Imagerie des protéines podocytiques Nephrin, Actin et Podocin avec microscopie d’expansion

Résumé

La méthode présentée permet la visualisation de protéines cellulaires étiquetées fluorescentes avec microscopie d’expansion conduisant à une résolution de 70 nm sur un microscope conventionnel.

Résumé

La perturbation du filtre glomerular composé de l’endothélium glomerular, de la membrane glomerular de sous-sol et des podocytes, a comme conséquence l’albuminuria. Les processus de pied de podocyte contiennent des faisceaux d’actine qui se lient aux protéines cytosquelettiques d’adaptateur telles que la podocine. Ces protéines adaptateurs, comme la podocine, relient l’épine dorsale du diaphragme fente glomérique, comme la néphrine, au cytosquelette d’actine. L’étude de la localisation et de la fonction de ces protéines podocytiques et d’autres est essentielle à la compréhension du rôle du filtre glomerular dans la santé et la maladie. Le protocole présenté permet à l’utilisateur de visualiser l’actine, la podocine et la néphrine dans les cellules avec imagerie à super résolution sur un microscope conventionnel. Premièrement, les cellules sont tachées d’une technique conventionnelle d’immunofluorescence. Toutes les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente dans un hydrogel gonflé. Grâce à la digestion avec la proteinase K, les protéines structurelles sont fendillées permettant un gonflement isotropical du gel dans la dernière étape. La dialyse de l’échantillon dans l’eau entraîne une expansion de 4 à 4,5 fois de l’échantillon et l’échantillon peut être photographié au microscope à fluorescence conventionnel, ce qui rend une résolution potentielle de 70 nm.

Introduction

L’albuminurie est un paramètre de substitution du risque cardiovasculaire et résulte de la perturbation du filtre glomerular¹. Le filtre glomerular est composé de l’endothélium fenestrated, de la membrane glomerular de sous-sol et du diaphragme de fente formé par des podocytes. Les processus primaires et secondaires de pied des podocytes enveloppent autour de la paroi capillaire du glomerulum^2. La structure délicate des processus de pied est maintenue par des faisceaux corticals d’actine qui servent également d’ancres pour les protéines multiples de diaphragme de fente et d’autres protéines d’adaptateur^2. La protéine dorsale du diaphragme fendue est appelée néphrine et interagit de manière homophilique avec les molécules de néphrine des podocytes opposés. Grâce à diverses protéines adaptateurs, la néphrine est liée au cytosquelette d’actine^2,3. Les mutations dans le gène d’encodage de néphrine NPHS1 mènent au syndrome néphrotique du type^{finlandais 4.}

L’une des protéines en interaction de la néphrine est la podocine, une protéine en épingle à cheveux de la famille des stomatines³. Podocin recrute de la néphrine aux radeaux lipidiques et la relie au cytosquelette d’actine⁵. La podocine est codée par le gène NPHS2. Les mutations dans NPHS2 mènent au syndrome néphrotique stéroïde-résistant^6.

Pour visualiser et co-localisé les protéines adaptateurs de l’actine, des techniques d’immunofluorescence peuvent être utilisées. Malheureusement, la barrière de diffraction de la lumière limite la résolution des microscopes conventionnels de fluorescence à 200-350 nm^7. De nouvelles techniques de microscopie, par exemple, l’épuisement des émissions stimulées (STED)^8,la microscopie de localisation photoactivée (PALM)^9,la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM ou dSTORM) ou la microscopie de suppression de l’état au sol suivie d’un retour individuel des molécules (GSDIM)^9,10,11, permettent une résolution jusqu’à environ 10 nm. Cependant, ces techniques de super résolution nécessitent des microscopes très coûteux, du personnel bien formé et ne sont donc pas disponibles dans de nombreux laboratoires.

La microscopie d’expansion (ExM) est une technique nouvelle et simple qui permet l’imagerie par super résolution avec des microscopes conventionnels et qui est potentiellement disponible pour une grande communauté de^{recherche 12}. Dans la microscopie d’expansion de rétention de protéine (proExM), l’échantillon d’intérêt (cellules ou tissu) est fixé et souillé avec des fluorophores^13. Les protéines de l’échantillon sont ensuite ancrées de façon covalente par une petite molécule (6-((Acryloyl)amino)acide hexanoïque, succinimidyl ester, AcX) dans un hydrogel gonflé¹³. Grâce à la digestion enzymatique avec proteinase K (ProK), les protéines et les fluorophores maintiennent leur position relative dans le gel après expansion^13. Après gonflement du gel, l’échantillon se dilate jusqu’à 4,5 fois (expansion volumétrique de 90 fois) menant à une résolution latérale efficace d’environ 60-70 nm (300 nm/4.5). Les modifications de cette technique peuvent même permettre une expansion 10 fois (expansion volumétrique 1000 fois), rendant une résolution de 20-30 nm sur les microscopes conventionnels^14,15,16.

Des structures glomerular de souris et de reins humains ont été visualisées par l’intermédiaire d’ExM^17. Dans cet article, nous présentons un protocole proExM détaillé pour visualiser des images de super résolution de F-actin et de la podocine de protéine d’actine-adaptateur dans les cellules utilisant un microscope conventionnel de fluorescence.

Protocole

1. Fractionnement et ensemencement des cellules

1. Réchauffez le milieu de l’aigle modifié (DMEM) stérile de Dulbecco, y compris le sérum fœtal de veau (FCS) à 10 %, la solution saline tamponnée de phosphate stérile (PBS) et la trypsine stérile à 37 °C. Activez le banc propre.
2. Préparer une plaque de 6 puits en ajoutant un glissement stérile de couvercle en verre (10 mm) à chaque puits à l’aide de forceps stériles.
3. Mettez un plat de culture cellulaire de 10 cm avec des cellules Cos7 sous le banc propre. Sous le banc propre, aspirer le milieu des cellules à l’aide d’un dispositif à vide.
4. Tenez le plat de culture cellulaire angulé dans une main et ajoutez 10 mL de PBS stérile sur le côté du plat de culture cellulaire pour éviter de rincer les cellules. Ez le plat de culture cellulaire vers le bas de sorte que PBS rince le plat complet de culture cellulaire.
5. Retirer le PBS et ajouter 1 mL de trypsine au milieu du plat de culture cellulaire et incuber pendant 5 min à 37 °C.
6. Arrêtez la réaction de trypsinisation en ajoutant 10 mL de DMEM dont 10% de FCS et pipette la solution cellulaire de haut en bas avec un pipettor pour séparer manuellement les cellules.
7. Analyser le numéro de cellule par millilitre à l’aide d’une chambre de comptage.
8. Ensemencer 68 000 cellules dans un milieu de 2 mL par puits sur le couvercle en verre glisse dans la plaque de 6 puits. Répartir les cellules dans la plaque de 6 puits en secouant prudemment la plaque horizontalement et verticalement.
   REMARQUE : Les cellules doivent être dispersées.
9. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de 37 °C avec 5 % de CO₂.

2. Transfection des cellules

1. Préparer deux tubes stériles de 1,5 mL (l’un pour l’ADN dilué (A) et l’autre pour le réagencé dilué pour la transfection lipidique cationique (B)). Pipette 0,75 μg de néphrine et 0,75 μg de plasmide d’expression podocine cDNA par puits dans un tube de 1,5 mL et le diluer en 100 μL de sérum moyen réduit par puits. Ajouter 3 μL de réaccfection cationique par puits au deuxième tube de 1,5 mL et diluer avec 100 μL de sérum moyen réduit. Incuber les deux réactions pendant 5 min à température ambiante.
2. Combinez les deux réactions (A et B) à un complexe ADN-lipide et incubez pendant 20 min à température ambiante. Ajouter prudemment 200 μL du complexe ADN-lipides à chaque puits.
3. Incuber les cellules transfectées à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 h sans changer le milieu.

3. Immunolabeling des structures cellulaires

1. Préparer une solution de fixation (4% (w/v) paraformaldéhyde en PBS, 1 mL/puits), la solution de perméabilisation (0,5% (w/v) Triton X-100 en PBS, 1 mL/puits), et une solution de blocage (5% (v/v) albumine de sérum bovin en PBS, 1 mL/puits).
2. Retirez le milieu à l’l’l’insage d’un dispositif sous vide. Ajouter 2 mL de PBS à chaque puits pour enlever le milieu supplémentaire. Aspirez complètement le PBS.
   REMARQUE: Pour éviter de laver les cellules avec PBS, assurez-vous de pipette PBS pas sur le couvercle en verre glisser directement.
3. Fixer les cellules avec 4% (w/v) paraformaldéhyde (PFA) dissous dans PBS pendant 10 min à température ambiante.
   REMARQUE : Alternativement, fixez des cellules dans 3% (v/v) glyoxal-éthanol^18.
4. Jetez la PFA et lavez les cellules deux fois dans PBS (2 mL chacune) en évitant le pipetage direct sur les feuillets de couverture en verre. Perméabilizez les cellules fixes avec Triton X-100 0,5% (w/v) en PBS pendant 10 min à température ambiante.
5. Retirez la solution de perméabilisation et lavez-la deux fois avec pbs comme indiqué dans l’étape 3.2.
6. Bloquez les cellules en ajoutant 1 mL de 5% (v/v) BSA dans PBS pendant 1 h à température ambiante. Incuber les cellules avec 200 μL de l’anticorps primaire (anticorps anti-podocine 1:200 en 1% (v/v) BSA en PBS) pendant la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Alternativement, incuber l’anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante.
7. Retirez l’anticorps primaire et lavez-le trois fois avec du PBS comme à l’étape 3.2. Ajouter l’anticorps secondaire (chèvre anti-lapin Alexa 488 1:1000 en 1% (v/v) BSA en PBS) pendant 1 h à température ambiante. Gardez les cellules dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.
8. Jetez l’anticorps secondaire et lavez-le avec du PBS trois fois.
9. Retirer le PBS et incuber les cellules avec 200 μL d’anticorps anti-néphrine 1:100 en 1% (v/v) BSA en PBS pendant 1 h à température ambiante. Laver avec PBS trois fois. Gardez les cellules dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.
10. Retirer le PBS et incuber avec l’anticorps secondaire âne anti-cobaye 633, 1:200, pendant 1 h à température ambiante. Laver avec PBS trois fois. Gardez les cellules dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.

4. Microscopie d’expansion

1. préparation
   1. Pour former les entretentres pour la chambre de gelation, coupez les glissements de couverture en verre #1,0 et #1,5 en rayures de 5 mm (quatre chacune par glissière de verre) à l’aide d’un couteau en diamant. Placez les bandes de glissement de couverture de #1,5 mm de sorte qu’elles forment un carré de 2,5 cm de longueur sur une glissière de verre et placez-les dans une chambre de coloration(figure 2A1-C1). Pipette une gouttelette de ddH₂O dans les coins de la place pour adhérer à la couverture de verre glisser rayures les uns aux autres et à la glissade de verre (Figure 2A2-C2).
      REMARQUE : Évitez le séchage complet du ddH₂O car la force d’adhérence se perdra. Si nécessaire, appliquez plus de gouttelettes de ddH₂O. Attendez environ 20 min pour que les feuillets de couverture de #1,5 mm soient fixés de façon stably avant de commencer par l’étape 4.1.2.
   2. Placez quatre #1.0 bandes de glissement de couverture en verre par glissement de couverture sur les #1 de couverture de 0,5 mm. Adhérez aux rayures en pipetant une gouttelette sur chaque #1,5 mm de glissement de couverture(figure 2A3-C3).
      REMARQUE : L’épaisseur du gel doit être d’au moins 0,15 mm pour faciliter la manipulation dans l’avancement du protocole. Cependant, pour éviter le gel excessif sur le dessus des cellules, maintenez la hauteur d’espacement près du substrat cellulaire. En utilisant #1.5 et #1.0 bandes de glissement de couverture comme espaceurs, la hauteur des entretaires sera d’environ 0,3 mm. Les cellules adhèrent au verre de couverture (hauteur 0,12 mm). Par conséquent, le gel sera assez épais pour manipuler, mais gel excessif sur le dessus des cellules est évité en utilisant #1,0 et #1,5 bandes de verre de couverture comme espaceurs.
   3. Pour le couvercle de la chambre de gelation, envelopper un verre de couverture (#1,5) avec du film de paraffine. Évitez les plis ou la saleté sur le film de paraffine(figure 2A5-C5).
2. Ancrage et polymérisation (gelation)
   1. Préparer le tampon d’ancrage (voir le tableau 1). Pour le traitement d’ancrage, remplacez PBS par 250 μL de tampon d’ancrage par puits directement sur le bordereau de couverture en verre et incubez pendant 3 h à température ambiante. Gardez le substrat dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.
      REMARQUE : Alternativement, incuber toute la nuit à température ambiante. Préparez un tampon d’ancrage frais pour chaque expérience et attendez 10-15 min jusqu’à ce qu’il soit dissous correctement. 6-((Acryloyl)amino)acide hexanoïque, ester succinimidyl (AcX) doit être remplacé tous les 4-5 mois pour assurer un ancrage adéquat.
   2. Retirer le tampon d’ancrage et laver une fois avec 1,5 mL de PBS par puits.
   3. Pour tacher les fibres d’actine, décongeler une solution de phalloidine compatible ExM et incuber la phalloidine (5 μL de phalloidine diluée en 195 μL de 1 % (v/v) BSA en PBS/puits) pendant 45 min à température ambiante. Gardez les échantillons dans l’obscurité à l’aide d’une boîte.
   4. Entre-temps, dissoudre l’acrylate de sodium en ddH 2 O_{à l’aide}d’un dispositif d’agitation. Sur la glace, préparer la solution monomère (voir le tableau 1).
      REMARQUE : L’acrylate de sodium dissous devrait être une solution claire et incolore. Si la solution est jaune, remplacer par un nouvel acrylate de sodium.
   5. Préparer la solution de gelling sur la glace (voir le tableau 1). Pipette ammoniumperoxidsulfate (APS) dans la solution de gelage juste avant que la solution de gelling soit appliquée à la chambre de gelation.
   6. Retirer la phalloidine des cellules et laver avec 1,5 mL de PBS deux fois à température ambiante. Laissez 1,5 mL de PBS dans le puits pour faciliter l’enlèvement de l’échantillon sur la feuille de couverture en verre.
   7. Placez les cellules sur le verre de couverture dans la chambre de hongre à l’aide de forceps et d’une canule pour soulever le glissement de verre de couverture de la plaque de 6 puits.
      REMARQUE : Les cellules doivent être sur le dessus de la feuille de couverture en verre. Le slip de couvercle en verre ne doit pas toucher les entretaires.
   8. Ajouter aps à la solution de gelling et vortex sous peu. Pipette 200 μL de solution de gelling sur l’échantillon( Figure 2A4-C4). Fermez prudemment la chambre de gelation en évitant les bulles d’air dans le gel (Figure 2A5-C5).
   9. Incuber la chambre gélissante pendant au moins 1 h à 37 °C pour polymériser le gel dans la chambre de coloration humide.
3. Homogénéisation (digestion)
   1. Sortez la chambre de coloration de l’incubateur. Pour ouvrir le couvercle de la chambre de gelation, introduisez une lame de rasoir entre le couvercle et l’espaceur. Retirez le couvercle prudemment. Retirez les entretaires avec la lame de rasoir et éliminez tout gel supplémentaire en le coupant avec la lame de rasoir.
   2. Mettre la diapositive avec le gel et couvrir le verre dans un plat rempli de PBS. En secouant doucement, retirer le verre détaché du gel. Pour retirer facilement le gel du plat, placez la lame sous le gel pour fixer le gel à la lame.
   3. Avec le gel sur la lame, diviser le gel en petits morceaux (le quart du gel est divisé en deux à trois morceaux) à l’aide de la lame de rasoir. Poussez doucement un morceau de gel dans un puits d’une plaque de 6 puits avec fond de verre et pliez-le par un pinceau. Gardez le gel hydraté avec un peu de PBS à l’aide du pinceau pour éviter la déshydratation du gel.
      REMARQUE : Les cellules font face vers le bas.
   4. À l’aide d’un microscope inversé, prenez des images d’aperçu avec une faible ouverture numérique pour déterminer le facteur d’expansion après expansion.
   5. Préparer le tampon de digestion (voir le tableau 1). Diluer proteinase K à 4 U/mL dans le tampon de digestion pour recevoir la solution de digestion.
      REMARQUE : Le tampon de digestion sans Proteinase K peut être stocké à 4 °C pendant 1 à 2 semaines.
   6. Ajouter 500 μL de la solution de digestion à chaque puits et plonger le gel dans la solution. Laissez-le digérer toute la nuit à température ambiante et fermez le couvercle en gardant les échantillons dans l’obscurité.
      REMARQUE : Alternativement, laissez-le digérer à 37 °C pendant 1 h.
4. expansion
   1. Retirer la solution de digestion à l’aide d’une pipette et la jeter. Ajouter 1 mL de ddH₂O. Incuber le gel immergé pendant 10 min à température ambiante.
   2. Retirer l’eau et ajouter 1 mL de ddH_{frais 2}O. Attendre 10 minutes et continuer à échanger de l’eau toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’un plateau d’expansion soit atteint.
      REMARQUE : L’expansion de l’échantillon jusqu’à 4,5 fois est réalisable. Le gel devient optiquement clair.
5. imagerie
   1. Retirer l’eau du gel et démarrer directement la microscopie. À l’aide d’un microscope inversé, utilisez principalement un objectif d’air (faible grossissement) pour trouver des cellules imageuses dans l’état de pré-expansion (étape 4.3.4).
   2. Passez à un objectif 40x (huile/eau) et 63x pour une meilleure résolution. Excitez avec la longueur d’onde de l’intérêt et de prendre l’image via la caméra.
6. validation
   1. Prenez une image de vue d’ensemble de l’échantillon. Trouvez et assortir les mêmes structures dans l’échantillon qui ont été illustrées à l’étape 4.3.4. Utilisez le canal avec le meilleur rapport signal-bruit pour validation(figure 3 A-B).
      REMARQUE : Ajustez les paramètres d’imagerie pour obtenir une luminosité similaire à celle de l’image acquise à l’état non élargi (étape 4.3.4).
   2. Superposez les images avant et après l’expansion en les tournant et en les déplaçant avec ImageJ. Utilisez l’outil de mesure de distance dans ImageJ pour mesurer les distances entre les structures clairement identifiables. Mesurez au moins 10 structures différentes.
      REMARQUE : Alternativement, utilisez un script Python pour mesurer les distances décrites dans¹⁴.
   3. Calculez le facteur d’expansion en divisant les mesures post-/pré-expansion.
   4. Pour déterminer les distorsions, prenez des images avec une ouverture numérique plus élevée (Figure 4A-B). Superposez ces images et analysez-les avec ImageJ ou comme décrit^{dans 15}.
      REMARQUE : La détermination des distorsions doit être effectuée régulièrement, mais pas nécessairement sur chaque échantillon.

Résultats

Le concept et le moment de ce protocole proExM sont représentés à la figure 1. Le jour 5, les cellules transfectées sont fixées et tachées d’anticorps fluorescents ciblant la protéine d’intérêt (Figure 1A,B). Le jour 6, le traitement par AcX conduit à la formation de groupes d’amine sur toutes les protéines (y compris les fluorophores) (Figure 1A,B)<...

Discussion

La méthode présentée permet à l’investigateur de visualiser les protéines cellulaires, p. ex., la podocine, la néphrine et les composants cytosquelettiques, p. ex., la F-actine. Dans ce protocole, les cellules cos7 transfectées sont utilisées comme modèle pour étudier l’interaction des protéines de diaphragme fendue avec la F-actine. Malheureusement, les lignées cellulaires immortalisées des podocytes n’expriment pas suffisamment de quantités endogènes de protéines diaphragmes fendues

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available