Imaging di proteine podocitiche Nefrrina, Actina e Podocina con microscopia di espansione

Riepilogo

Il metodo presentato consente la visualizzazione di proteine cellulari etichettate fluorescentmente con microscopia di espansione che porta a una risoluzione di 70 nm su un microscopio convenzionale.

Abstract

L'interruzione del filtro glomerulare composto dall'endotelio glomerulare, dalla membrana basale glomerulare e dai podociti, si traduce in albuminuria. I processi del piede dei podociti contengono fasci di actina che si legano alle proteine dell'adattatore citoscheletricho come la podocina. Queste proteine dell'adattatore, come la podocina, collegano la spina dorsale del diaframma a fessura glomerulare, come la nefrina, all'actina citoscheletro. Studiare la localizzazione e la funzione di queste e di altre proteine podocitiche è essenziale per la comprensione del ruolo del filtro glomerulare nella salute e nelle malattie. Il protocollo presentato consente all'utente di visualizzare actina, podocina e nefrrina nelle cellule con imaging a super risoluzione su un microscopio convenzionale. In primo luogo, le cellule sono macchiate con una tecnica di immunofluorescenza convenzionale. Tutte le proteine all'interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate a un idrogel gonfiabile. Attraverso la digestione con proteinasi K, le proteine strutturali vengono scissa permettendo gonfiore isotropico del gel nell'ultimo passaggio. La dialisi del campione in acqua si traduce in un'espansione di 4-4,5 volte del campione e il campione può essere immaginato tramite un microscopio a fluorescenza convenzionale, rendendo una risoluzione potenziale di 70 nm.

Introduzione

L'albuminuria è un parametro surrogato del rischio cardiovascolare e deriva dall'interruzione del filtro glomerulare¹. Il filtro glomerulare è composto dall'endotelio fenestrato, dalla membrana basale glomerulare e dal diaframma a fessura formato dai podociti. I processi del piede primario e secondario dei podociti avvolgono la parete capillare del glomerulum². La delicata struttura dei processi del piede è mantenuta da fasci di actina corticale che fungono anche da ancore per proteine del diaframma a fessura multipla e altre proteine dell'adattatore². La proteina dorsale del diaframma fessurato è chiamata nefrina e interagisce in modo omofilo con molecole di nefrrina di podociti opposti. Attraverso diverse proteine dell'adattatore, la nefrrina è legata all'actina citoscheletro^2,3. Mutazioni nel gene nphrin-codificante NPHS1 portano alla sindrome nefrotica del finlandese di tipo⁴.

Una delle proteine interagenti della nefrina è la podocina, una proteina simile a una forcina della famiglia delle stomatine³. La podocina recluta nefrrina alle zattere lipidiche e la collega all'actina citoscheletro⁵. La podocina è codificata dal gene NPHS2. Mutazioni in NPHS2 portano alla sindrome nefrotica resistente agli steroidi⁶.

Per visualizzare e co-localizzare le proteine dell'adattatore di actina, possono essere utilizzate tecniche di immunofluorescenza. Sfortunatamente, la barriera di diffrazione della luce limita la risoluzione dei microscopi a fluorescenza convenzionali a 200-350 nm⁷. Le nuove tecniche di microscopia, ad esempio l'esaurimento delle emissioni stimolate (STED)^8,la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM)^9,la microscopia per la ricostruzione ottica stocastica (STORM o dSTORM) o la microscopia a cancellazione dello stato del suolo seguita dal ritorno della singola molecola (GSDIM)^9,10,11, consentono una risoluzione fino a circa 10 nm. Tuttavia, queste tecniche di super risoluzione richiedono microscopi molto costosi, personale ben addestrato e quindi non sono disponibili in molti laboratori.

La microscopia di espansione (ExM) è una tecnica nuova e semplice che consente l'imaging a super risoluzione con microscopi convenzionali ed è potenzialmente disponibile per una grande comunità di ricerca¹². Nella microscopia di espansione della ritenzione proteica (proExM), il campione di interesse (cellule o tessuti) è fisso e macchiato di fluorofori¹³. Le proteine all'interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate da una piccola molecola (acido 6-((Acriloil)ammino)esanoico, estere succinimidile, AcX) in un idrogel gonfiabile¹³. Attraverso la digestione enzimatica con proteinasi K (ProK), proteine e fluorofori mantengono la loro posizione relativa all'interno del gel dopo^{l'espansione 13}. Dopo il gonfiore del gel, il campione si espande fino a 4,5 volte (espansione volumetrica di 90 volte) portando ad un'efficace risoluzione laterale di circa 60-70 nm (300 nm/4.5). Le modifiche di questa tecnica possono anche consentire un'espansione di 10 volte (espansione volumetrica di 1.000 volte), rendendo una risoluzione di 20-30 nm sui microscopi^{convenzionali 14,15,16}.

Le strutture glomerulari del topo e dei reni umani sono state visualizzate tramite ExM¹⁷. All'interno di questo documento, presentiamo un protocollo proExM dettagliato per visualizzare immagini a super risoluzione di F-actin e la podocina proteica dell'adattatore actina all'interno delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale.

Protocollo

1. Scissione e semina di cellule

1. Riscaldare il mezzo dell'aquila modificata (DMEM) sterile di Dulbecco, incluso il siero di vitello fetale al 10% (FCS), la salina tamponata di fosfato sterile (PBS) e la tripside sterile a 37 °C. Attivare la panca pulita.
2. Preparare una piastra da 6 pomp po' aggiungendo un foglietto di copertura sterile in vetro (10 mm) a ciascun pozzo utilizzando forcep sterili.
3. Metti un piatto di coltura cellulare di 10 cm con celle Cos7 sotto la panca pulita. Sotto il banco pulito, aspirare il mezzo delle cellule utilizzando un dispositivo a vuoto.
4. Tenere il piatto di coltura cellulare angolata in una mano e aggiungere 10 mL di PBS sterile sul lato del piatto di coltura cellulare per evitare il risciacquo delle cellule. Mettere giù il piatto di coltura cellulare in modo che PBS risciacqui il piatto completo di coltura cellulare.
5. Rimuovere il PBS e aggiungere 1 mL di tripside al centro del piatto di coltura cellulare e incubare per 5 minuti a 37 °C.
6. Interrompere la reazione di tripsinzizzazione aggiungendo 10 mL di DMEM, incluso il 10% di FCS e pipettare la soluzione cellulare su e giù con un pipettor per separare manualmente le celle.
7. Analizzare il numero di cella per millilitro utilizzando una camera di conteggio.
8. Semina 68.000 cellule in mezzo da 2 mL per pozzo sul coperchio di vetro scivola nella piastra a 6 po porsi. Distribuire le cellule all'interno della piastra a 6 po 'scuotendo cautamente la piastra orizzontalmente e verticalmente.
   NOTA: Le cellule devono giacere sparse.
9. Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂.

2. Trasfezione delle cellule

1. Preparare due tubi sterili da 1,5 ml (uno per il DNA diluito (A) e uno per il reagente diluito per la trasfezione lipidica cationica (B)). Pipetta 0,75 μg di nefrina e 0,75 μg di podocina cDNA espressione plasmide per pozzo in un tubo da 1,5 ml e diluirla in 100 μL di mezzo siero ridotto per pozzo. Aggiungere 3 μL di reagente di trasfezione lipidica cationica per pozzo al secondo tubo da 1,5 ml e diluire con 100 μL di mezzo sierico ridotto. Incubare entrambe le reazioni per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Unire entrambe le reazioni (A e B) a un complesso DNA-lipidico e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere con cautela 200 μL del complesso DNA-lipidico ad ogni pozzo.
3. Incubare le cellule trasfette a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore senza cambiare il mezzo.

3. Immunoetichettatura delle strutture cellulari

1. Preparare una soluzione di fissaggio (4% (w/v) paraformaldeide in PBS, 1 mL/pozzo), la soluzione di permeabilizzazione (0,5% (w/v) Triton X-100 in PBS, 1 mL/pozzo) e una soluzione di blocco (5% (v/v) albumina di siero bovino in PBS, 1 mL/pozzo).
2. Rimuovere il mezzo con un dispositivo a vuoto. Aggiungere 2 mL di PBS ad ogni pozzo per rimuovere il mezzo aggiuntivo. Aspirare completamente il PBS.
   NOTA: Per evitare di lavare via le celle con PBS, assicurarsi di pipettare pbs non sul coperchio di vetro scivolare direttamente.
3. Fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 4% (w/v) sciolta in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: In alternativa, fissare le cellule in 3% (v/v) glioxal-etanolo¹⁸.
4. Scartare pfa e lavare le celle due volte in PBS (2 mL ciascuno) evitando la pipettazione diretta sui vetri. Permeabilizzare le celle fisse con Tritone X-100 0,5% (w/v) in PBS per 10 min a temperatura ambiente.
5. Rimuovere la soluzione di permeabilità e lavare due volte con PBS come indicato al passaggio 3.2.
6. Bloccare le celle aggiungendo 1 mL di 5% (v/v) BSA in PBS per 1 h a temperatura ambiente. Incubare le cellule con 200 μL dell'anticorpo primario (anticorpo anti-podocina 1:200 in 1% (v/v) BSA in PBS) durante la notte a 4 °C.
   NOTA: In alternativa, incubare l'anticorpo primario per 1 h a temperatura ambiente.
7. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare tre volte con PBS come nel passaggio 3.2. Aggiungere l'anticorpo secondario (capra anti-coniglio Alexa 488 1:1000 in 1% (v/v) BSA in PBS) per 1 h a temperatura ambiente. Tenere le celle al buio usando una scatola.
8. Scartare l'anticorpo secondario e lavare con PBS tre volte.
9. Rimuovere il PBS e incubare le cellule con 200 μL di anticorpo anti-nefrina 1:100 in 1% (v/v) BSA in PBS per 1 h a temperatura ambiente. Lavare con PBS tre volte. Tenere le celle al buio usando una scatola.
10. Rimuovere il PBS e incubare con l'anticorpo secondario asino anti-porcellino d'India 633, 1:200, per 1 h a temperatura ambiente. Lavare con PBS tre volte. Tenere le celle al buio usando una scatola.

4. Microscopia di espansione

1. preparazione
   1. Per formare i distanziale per la camera di gelazione, la copertura in vetro tagliato scivola #1,0 e #1,5 in strisce da 5 mm (quattro ciascuna per scivolo di vetro) utilizzando un coltello diamantante. Posizionare le strisce di scorrimento del coperchio #1,5 mm in modo che formeranno un quadrato di 2,5 cm di lunghezza su uno scivolo di vetro e le posizionare in una camera dicolorazione (figura 2A1-C1). Pipettare una goccia di ddH₂O negli angoli del quadrato per aderire le strisce di vetro scivolano l'una all'altra e allo scivolo di vetro(Figura 2A2-C2).
      NOTA: Evitare l'asciugatura completa di ddH₂O poiché la forza di adesione si perderà. Se necessario, applicare più goccioline di ddH₂O. Attendere circa 20 min in modo che le lapsus di copertura da #1,5 mm siano attaccate stabilmente prima di iniziare con il passaggio 4.1.2.
   2. Posizionare quattro strisce #1,0 di vetro per coperchio scivolare sui coperchi #1,5 mm. Aderire alle strisce tubazionando una goccia su ciascuna striscia di scorrimento del coperchio #1,5 mm (Figura 2A3-C3).
      NOTA: Lo spessore del gel deve essere di almeno 0,15 mm per facilitare la manipolazione nell'avanzamento del protocollo. Tuttavia, per evitare un gel eccessivo sopra le cellule, mantenere l'altezza dei distanziali vicino al substrato cellulare. Utilizzando strisce di scorrimento #1,5 e #1,0 come distanziale, l'altezza dei distanziale sarà di circa 0,3 mm. Le celle aderiscono al vetro di copertura (altezza 0,12 mm). Pertanto, il gel sarà abbastanza spesso da essere maneggiato, ma il gel eccessivo sopra le celle viene evitato utilizzando strisce di vetro di copertura #1.0 e #1.5 come distanziali.
   3. Per il coperchio della camera di gelazione, avvolgere un vetro di copertura (#1.5) con pellicola di paraffina. Evitare pieghe o sporcizia sulla pellicola di paraffina(Figura 2A5-C5).
2. Ancoraggio e polimerizzazione (gelazione)
   1. Preparare il buffer di ancoraggio (vedere tabella 1). Per il trattamento di ancoraggio, sostituire PBS con 250 μL di tampone di ancoraggio per pozzo direttamente sullo scivolo di copertura del vetro e incubare per 3 ore a temperatura ambiente. Tenere il substrato al buio usando una scatola.
      NOTA: In alternativa, incubare durante la notte a temperatura ambiente. Preparare un nuovo buffer di ancoraggio per ogni esperimento e attendere 10-15 minuti fino a quando non viene sciolto correttamente. Acido 6-((acriloil)ammino)esanoico, estere succinimidilico (AcX) deve essere sostituito ogni 4-5 mesi per garantire un'adeguata ancoraggio.
   2. Rimuovere il tampone di ancoraggio e lavare una volta con 1,5 mL PBS per pozzo.
   3. Per macchiare le fibre di actina, scongelare una soluzione di phalloidina compatibile con ExM e incubare la phalloidina (5 μL di phalloidin diluita in 195 μL dell'1% (v/v) BSA in PBS/pozzo) per 45 min a temperatura ambiente. Tenere i campioni al buio usando una scatola.
   4. Nel frattempo, sciogliere l'acrilato di sodio in ddH₂O utilizzando un dispositivo di agitazione. Sul ghiaccio, preparare la soluzione monomero (cfr. tabella 1).
      NOTA: L'acrilato di sodio disciolto dovrebbe essere una soluzione chiara e incolore. Se la soluzione è gialla, sostituire con il nuovo acrilato di sodio.
   5. Preparare la soluzione gelificante sul ghiaccio (cfr. tabella 1). Pipetta ammonioperossidasulfato (APS) nella soluzione gelificante subito prima che la soluzione gelificante sia applicata alla camera di gelazione.
   6. Rimuovere la falloidina dalle cellule e lavare con 1,5 mL di PBS due volte a temperatura ambiente. Lasciare 1,5 mL PBS all'interno del pozzo per facilitare la rimozione del campione sul coperchio del vetro.
   7. Posizionare le celle sul vetro di copertura nella camera di gelata utilizzando le forcep e una cannula per sollevare lo scivolo di vetro di copertura dalla piastra a 6 po '.
      NOTA: Le celle devono essere sulla parte superiore del coperchio del vetro. Il foglietto di copertura in vetro non deve toccare i distanziale.
   8. Aggiungere a breve APS alla soluzione di gelatatura e al vortice. Pipetta 200 μL di soluzione gelificante sul campione(Figura 2A4-C4). Chiudere cautamente la camera di gelazione evitando bolle d'aria all'interno del gel(Figura 2A5-C5).
   9. Incubare la camera di gelata per almeno 1 h a 37 °C per polimerizzare il gel nella camera di colorazione bagnata.
3. Omogeneizzazione (digestione)
   1. Togliere la camera di colorazione dall'incubatrice. Per aprire il coperchio della camera di gelazione, introdurre una lama di rasoio tra il coperchio e il distanziale. Rimuovere il coperchio con cautela. Rimuovere i distanziati con la lama del rasoio ed eliminare tutto il gel extra tagliandolo con la lama del rasoio.
   2. Mettere lo scivolo con il gel e coprire il vetro in un piatto pieno di PBS. Scuotendo delicatamente, rimuovere il vetro di copertura staccato dal gel. Per rimuovere facilmente il gel dal piatto, mettere la diapositiva sotto il gel per attaccare il gel alla diapositiva.
   3. Con il gel sullo scivolo, dividere il gel in piccoli pezzi (un quarto del gel è diviso in due o tre pezzi) usando la lama del rasoio. Spingere delicatamente un pezzo di gel in un pozzo di una piastra a 6 pozzetti con fondo di vetro e avvolgerlo da un pennello. Mantenere il gel idratante con una piccola quantità di PBS utilizzando il pennello per evitare la disidratazione del gel.
      NOTA: Le cellule si affacciano verso il basso.
   4. Utilizzando un microscopio invertito, scatta immagini panoramiche con bassa apertura numerica per determinare il fattore di espansione dopo l'espansione.
   5. Preparare il tampone di digestione (cfr. tabella 1). Diluire la proteinasi da K a 4 U/mL nel tampone di digestione per ricevere la soluzione di digestione.
      NOTA: Il tampone di digestione senza proteinasi K può essere conservato a 4 °C per 1-2 settimane.
   6. Aggiungere 500 μL della soluzione di digestione ad ogni pozzo e immergere il gel all'interno della soluzione. Lasciare digerire durante la notte a temperatura ambiente e chiudere il coperchio mantenendo i campioni al buio.
      NOTA: In alternativa, lasciarlo digerire a 37 °C per 1 h.
4. espansione
   1. Rimuovere la soluzione di digestione con una pipetta e scartarla. Aggiungere 1 mL di ddH₂O. Incubare il gel immerso per 10 minuti a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere l'acqua e aggiungere 1 mL di ddH_{fresco 2}O. Attendere 10 minuti e continuare a scambiare acqua ogni 10 minuti fino a raggiungere un altopiano di espansione.
      NOTA: l'espansione del campione fino a 4,5 volte è realizzabile. Il gel diventa otticamente chiaro.
5. Imaging
   1. Rimuovere l'acqua dal gel e iniziare direttamente la microscopia. Utilizzando un microscopio invertito, utilizzare principalmente un obiettivo dell'aria (basso ingrandimento) per trovare celle con immagini nello stato di pre-espansione (passaggio 4.3.4).
   2. Passa a un obiettivo 40x (olio / acqua) e 63x per una migliore risoluzione. Eccitare con la lunghezza d'onda di interesse e prendere l'immagine tramite la fotocamera.
6. convalida
   1. Scatta un'immagine panoramica dell'esempio. Trovare e abbinare le stesse strutture all'interno del campione che sono state immagini nel passaggio 4.3.4. Utilizzare il canale con il miglior rapporto segnale/rumore per la convalida (Figura 3 A-B).
      NOTA: regolare i parametri di imaging per ottenere una luminosità simile a nell'immagine acquisita nello stato non espanso (passaggio 4.3.4).
   2. Sovrapporre le immagini pre e post-espansione ruotandole e spostandole con ImageJ. Utilizzare lo strumento di misurazione della distanza in ImageJ per misurare le distanze tra strutture chiaramente identificabili. Misurare almeno 10 strutture diverse.
      NOTA: in alternativa, utilizzare uno script Python per misurare le distanze come descritto in¹⁴.
   3. Calcola il fattore di espansione dividendo le misure post/pre-espansione.
   4. Per determinare le distorsioni, scattare immagini con un'apertura numerica piùelevata ( Figura 4A-B). Sovrapporre queste immagini e analizzarle con ImageJ o come descritto in¹⁵.
      NOTA: La determinazione delle distorsioni deve essere eseguita regolarmente ma non necessariamente su ogni campione.

Risultati

Il concetto e la tempistica di questo protocollo proExM sono illustrati nella figura 1. Il giorno 5, le cellule trasfette sono fisse e macchiate con anticorpi fluorescenti mirati alla proteina di interesse(Figura 1A,B). Il giorno 6, il trattamento con AcX porta alla formazione di gruppi amminici su tutte le proteine (compresi i fluorofori)(Figura 1A,B)

Discussione

Il metodo presentato consente allo sperimentatore di visualizzare proteine cellulari, ad esempio podocina, nefrrina e componenti citoscheletrici, ad esempio F-actina. All'interno di questo protocollo, le cellule cos7 trasfette sono usate come modello per studiare l'interazione delle proteine del diaframma a fessura con f-actina. Sfortunatamente, le linee cellulari dei podociti immortalate non esprimono quantità endogene sufficienti di proteine del diaframma fessurato¹⁹.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available