Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Представленный метод позволяет визуализировать флуоресцентно помеченные клеточные белки с расширением микроскопии, что приводит к разрешению 70 нм на обычном микроскопе.
Нарушение гломерулярного фильтра, состоящего из гломерулярного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и подоцитов, приводит к альбуминурии. Подоцитные процессы ног содержат актиновые пучки, которые связываются с белками цитоскелетного адаптера, такими как подоцин. Эти адаптерные белки, такие как подоцин, связывают основу диафрагмы гломерулярной щели, такой как нефрит, с актином цитоскелетом. Изучение локализации и функции этих и других подоцитных белков имеет важное значение для понимания роли гломерулярного фильтра в здоровье и болезнях. Представленный протокол позволяет пользователю визуализировать актин, подоцин и нефрит в клетках с визуализацией супер разрешения на обычном микроскопе. Во-первых, клетки окрашиваются с помощью обычной техники иммунофлуоресценции. Все белки в образце затем ковалентно закреплены на опухаемом гидрогеле. Через пищеварение с протеиназой K, структурные белки расщепляются позволяет изотропный отек геля в последний шаг. Диализ образца в воде приводит к 4-4,5-кратное расширение образца и образец может быть изображен с помощью обычного микроскопа флуоресценции, что делает потенциальное разрешение 70 нм.
Альбуминурия является суррогатным параметром сердечно-сосудистого риска и является результатом нарушения гломерулярного фильтра1. Гломерулярный фильтр состоит из фенестированного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и щелевой диафрагмы, образованной подоцитами. Первичные и вторичные процессы ног подоцитов обернуть вокруг капиллярной стенки гломерула2. Деликатная структура ног процессов поддерживается корковых актин расслоения, которые также служат в качестве якорей для нескольких белков щели диафрагмы и других белковадаптера 2. Белковый белок разреза диафрагмы называется нефритом и взаимодейс....
1. Разделение и посев клеток
Концепция и сроки этого протокола proExM изображены на рисунке 1. На 5-й день трансфектные клетки фиксируются и окрашиваются флуоресцентными антителами, нацеленными на белок интереса(рисунок 1A,B). На 6-й день лечение AcX приводит к об?.......
Представленный метод позволяет исследователю визуализировать клеточные белки, например, подоцин, нефрит и цитоскелетные компоненты, например, F-актин. В рамках этого протокола, трансфицированные cos7 клетки используются в качестве модели для изучения взаимодействия щелевых белков диаф.......
Авторов нечего раскрывать.
Авторы хотели бы поблагодарить Бланку Дувняка и Николу Кухра за отличную техническую помощь.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
"Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
TEMED | ROTH | 2367.1 | |
6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
Antibodies | |||
Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
Software | |||
FIJI | |||
Visiview | |||
microscope | |||
AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены