Изображение подоцитических белков Нефрин, Актин и Подоцин с помощью микроскопии расширения

Резюме

Представленный метод позволяет визуализировать флуоресцентно помеченные клеточные белки с расширением микроскопии, что приводит к разрешению 70 нм на обычном микроскопе.

Аннотация

Нарушение гломерулярного фильтра, состоящего из гломерулярного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и подоцитов, приводит к альбуминурии. Подоцитные процессы ног содержат актиновые пучки, которые связываются с белками цитоскелетного адаптера, такими как подоцин. Эти адаптерные белки, такие как подоцин, связывают основу диафрагмы гломерулярной щели, такой как нефрит, с актином цитоскелетом. Изучение локализации и функции этих и других подоцитных белков имеет важное значение для понимания роли гломерулярного фильтра в здоровье и болезнях. Представленный протокол позволяет пользователю визуализировать актин, подоцин и нефрит в клетках с визуализацией супер разрешения на обычном микроскопе. Во-первых, клетки окрашиваются с помощью обычной техники иммунофлуоресценции. Все белки в образце затем ковалентно закреплены на опухаемом гидрогеле. Через пищеварение с протеиназой K, структурные белки расщепляются позволяет изотропный отек геля в последний шаг. Диализ образца в воде приводит к 4-4,5-кратное расширение образца и образец может быть изображен с помощью обычного микроскопа флуоресценции, что делает потенциальное разрешение 70 нм.

Введение

Альбуминурия является суррогатным параметром сердечно-сосудистого риска и является результатом нарушения гломерулярного фильтра¹. Гломерулярный фильтр состоит из фенестированного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и щелевой диафрагмы, образованной подоцитами. Первичные и вторичные процессы ног подоцитов обернуть вокруг капиллярной стенки гломерула². Деликатная структура ног процессов поддерживается корковых актин расслоения, которые также служат в качестве якорей для нескольких белков щели диафрагмы и других белков^{адаптера 2}. Белковый белок разреза диафрагмы называется нефритом и взаимодейс....

протокол

1. Разделение и посев клеток

1. Разогреть стерильные Dulbecco в модифицированных Eagle's Medium (DMEM), в том числе 10% плода теленка сыворотки (FCS), стерильный фосфат буфера солевого раствора (PBS) и стерильных трипсина до 37 градусов по Цельсию. Активируйте чистую скамейку.
2. Подготовка 6-хорошо пластины, добавив один стерильный стеклянный покров скольжения (10 мм) к каждому хорошо с помощью стерильных типсов.
3. Положите 10 см клеточной культуры блюдо с Cos7 клетки под чистой скамейке. Под чистой скамейкой, аспирировать клетки среды с помощью вакуумного устройства.
4. Держите angulated блюдо культуры клеток в одной руке и добавить 10 ....

Результаты

Концепция и сроки этого протокола proExM изображены на рисунке 1. На 5-й день трансфектные клетки фиксируются и окрашиваются флуоресцентными антителами, нацеленными на белок интереса(рисунок 1A,B). На 6-й день лечение AcX приводит к об?.......

Обсуждение

Представленный метод позволяет исследователю визуализировать клеточные белки, например, подоцин, нефрит и цитоскелетные компоненты, например, F-актин. В рамках этого протокола, трансфицированные cos7 клетки используются в качестве модели для изучения взаимодействия щелевых белков диаф.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available