Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представленный метод позволяет визуализировать флуоресцентно помеченные клеточные белки с расширением микроскопии, что приводит к разрешению 70 нм на обычном микроскопе.

Аннотация

Нарушение гломерулярного фильтра, состоящего из гломерулярного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и подоцитов, приводит к альбуминурии. Подоцитные процессы ног содержат актиновые пучки, которые связываются с белками цитоскелетного адаптера, такими как подоцин. Эти адаптерные белки, такие как подоцин, связывают основу диафрагмы гломерулярной щели, такой как нефрит, с актином цитоскелетом. Изучение локализации и функции этих и других подоцитных белков имеет важное значение для понимания роли гломерулярного фильтра в здоровье и болезнях. Представленный протокол позволяет пользователю визуализировать актин, подоцин и нефрит в клетках с визуализацией супер разрешения на обычном микроскопе. Во-первых, клетки окрашиваются с помощью обычной техники иммунофлуоресценции. Все белки в образце затем ковалентно закреплены на опухаемом гидрогеле. Через пищеварение с протеиназой K, структурные белки расщепляются позволяет изотропный отек геля в последний шаг. Диализ образца в воде приводит к 4-4,5-кратное расширение образца и образец может быть изображен с помощью обычного микроскопа флуоресценции, что делает потенциальное разрешение 70 нм.

Введение

Альбуминурия является суррогатным параметром сердечно-сосудистого риска и является результатом нарушения гломерулярного фильтра1. Гломерулярный фильтр состоит из фенестированного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и щелевой диафрагмы, образованной подоцитами. Первичные и вторичные процессы ног подоцитов обернуть вокруг капиллярной стенки гломерула2. Деликатная структура ног процессов поддерживается корковых актин расслоения, которые также служат в качестве якорей для нескольких белков щели диафрагмы и других белковадаптера 2. Белковый белок разреза диафрагмы называется нефритом и взаимодейс....

протокол

1. Разделение и посев клеток

  1. Разогреть стерильные Dulbecco в модифицированных Eagle's Medium (DMEM), в том числе 10% плода теленка сыворотки (FCS), стерильный фосфат буфера солевого раствора (PBS) и стерильных трипсина до 37 градусов по Цельсию. Активируйте чистую скамейку.
  2. Подготовка 6-хорошо пластины, добавив один стерильный стеклянный покров скольжения (10 мм) к каждому хорошо с помощью стерильных типсов.
  3. Положите 10 см клеточной культуры блюдо с Cos7 клетки под чистой скамейке. Под чистой скамейкой, аспирировать клетки среды с помощью вакуумного устройства.
  4. Держите angulated блюдо культуры клеток в одной руке и добавить 10 ....

Результаты

Концепция и сроки этого протокола proExM изображены на рисунке 1. На 5-й день трансфектные клетки фиксируются и окрашиваются флуоресцентными антителами, нацеленными на белок интереса(рисунок 1A,B). На 6-й день лечение AcX приводит к об?.......

Обсуждение

Представленный метод позволяет исследователю визуализировать клеточные белки, например, подоцин, нефрит и цитоскелетные компоненты, например, F-актин. В рамках этого протокола, трансфицированные cos7 клетки используются в качестве модели для изучения взаимодействия щелевых белков диаф.......

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Бланку Дувняка и Николу Кухра за отличную техническую помощь.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylamide >99%Sigma-AldrichA3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SEinvitrogenA-20770store up to 4 months
APSSigma-AldrichA3678-25G
Deckgläser (cover glasses)EngelbrechtK1243224x32mm #1.0
Diamont cutterVWR201-0392for cutting the cover slips
Guanidine HClSigma-AldrichG3272-100G8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrushLeon Hardy3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)Thermo Fischer 1565478624x24mm #1.5
N,N`-MethylenbisacrylamideSigma-AldrichM7256-25G
Objektträger UniMarkMarienfeld703010
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Sodium AcrylateSigma-Aldrich408220check purity 
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
Staining chamberproduced at the university's workshop
TEMEDROTH2367.1
6-Well glass bottom platesCellvisP06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546 chrometranon-available1:40
Anti Podocin produced in rabbitSigmaP-0372-200UL1:200
Donkey anti guinea-pig CF633SigmaSAB4600129-50UL1:200
Goat anti rabbit 488Life TechnologiesA110341:1000
Guinea pig anti nephrinOrigeneBP50301:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1Zeissnon-available

Ссылки

  1. Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
  2. Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

170proExM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены