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* Estos autores han contribuido por igual
El método presentado permite visualizar proteínas celulares etiquetadas fluorescentemente con microscopía de expansión que conduce a una resolución de 70 nm en un microscopio convencional.
La interrupción del filtro glomerular compuesto por el endotelio glomerular, la membrana glomerular del sótano y los podocitos, resulta en albúmina. Los procesos del pie de podocito contienen haces de actina que se unen a proteínas adaptadoras citoesqueléticos como la podocina. Esas proteínas adaptadoras, como la podocina, unen la columna vertebral del diafragma de hendidura glomerular, como la nefrina, con el citoesqueleto actin. Estudiar la localización y la función de estas y otras proteínas podocíticas es esencial para la comprensión del papel del filtro glomerular en la salud y la enfermedad. El protocolo presentado permite al usuario visualizar actina, podocina y nefrina en células con imágenes de super resolución en un microscopio convencional. En primer lugar, las células se tiñen con una técnica convencional de inmunofluorescencia. Todas las proteínas dentro de la muestra se anclan covalentemente a un hidrogel hinchable. A través de la digestión con proteinasa K, las proteínas estructurales se cleaved permitiendo la hinchazón isotrópica del gel en el último paso. La diálisis de la muestra en agua da como resultado una expansión de 4-4,5 veces de la muestra y la muestra se puede imaginar a través de un microscopio de fluorescencia convencional, lo que representa una resolución potencial de 70 nm.
Albuminuria es un parámetro sustituto del riesgo cardiovascular y resulta de la interrupción del filtro glomerular1. El filtro glomerular se compone del endotelio fenestrado, la membrana glomerular del sótano y el diafragma cortado formado por podocitos. Los procesos de pie primario y secundario de los podocitos se envuelven alrededor de la pared capilar del glomérulo2. La delicada estructura de los procesos de los pies se mantiene mediante haces corticales de actina que también sirven como anclajes para múltiples proteínas de diafragma de hendidura y otras proteínas adaptadoras2. La proteína de l....
1. División y siembra de células
El concepto y el tiempo de este protocolo proExM se representan en la Figura 1. El día 5, las células transfectadas se fijan y se tiñen con anticuerpos fluorescentes dirigidos a la proteína de interés(Figura 1A,B). El día 6, el tratamiento con AcX conduce a la formación de grupos de aminas en todas las proteínas (incluidos los fluoróforos) (Figura 1A,B)
El método presentado permite al investigador visualizar proteínas celulares, por ejemplo, podocina, nefrina y componentes citoesqueléticos, por ejemplo, F-actin. Dentro de este protocolo, las células cos7 transfectadas se utilizan como modelo para estudiar la interacción de proteínas de diafragma cortadas con F-actin. Desafortunadamente, las líneas celulares de podocitos inmortalizadas no expresan suficientes cantidades endógenas de proteínas de diafragma cortadas19.
Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores quieren agradecer a Blanka Duvnjak y Nikola Kuhr por su excelente asistencia técnica.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
"Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
TEMED | ROTH | 2367.1 | |
6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
Antibodies | |||
Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
Software | |||
FIJI | |||
Visiview | |||
microscope | |||
AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
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