Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El método presentado permite visualizar proteínas celulares etiquetadas fluorescentemente con microscopía de expansión que conduce a una resolución de 70 nm en un microscopio convencional.

Resumen

La interrupción del filtro glomerular compuesto por el endotelio glomerular, la membrana glomerular del sótano y los podocitos, resulta en albúmina. Los procesos del pie de podocito contienen haces de actina que se unen a proteínas adaptadoras citoesqueléticos como la podocina. Esas proteínas adaptadoras, como la podocina, unen la columna vertebral del diafragma de hendidura glomerular, como la nefrina, con el citoesqueleto actin. Estudiar la localización y la función de estas y otras proteínas podocíticas es esencial para la comprensión del papel del filtro glomerular en la salud y la enfermedad. El protocolo presentado permite al usuario visualizar actina, podocina y nefrina en células con imágenes de super resolución en un microscopio convencional. En primer lugar, las células se tiñen con una técnica convencional de inmunofluorescencia. Todas las proteínas dentro de la muestra se anclan covalentemente a un hidrogel hinchable. A través de la digestión con proteinasa K, las proteínas estructurales se cleaved permitiendo la hinchazón isotrópica del gel en el último paso. La diálisis de la muestra en agua da como resultado una expansión de 4-4,5 veces de la muestra y la muestra se puede imaginar a través de un microscopio de fluorescencia convencional, lo que representa una resolución potencial de 70 nm.

Introducción

Albuminuria es un parámetro sustituto del riesgo cardiovascular y resulta de la interrupción del filtro glomerular1. El filtro glomerular se compone del endotelio fenestrado, la membrana glomerular del sótano y el diafragma cortado formado por podocitos. Los procesos de pie primario y secundario de los podocitos se envuelven alrededor de la pared capilar del glomérulo2. La delicada estructura de los procesos de los pies se mantiene mediante haces corticales de actina que también sirven como anclajes para múltiples proteínas de diafragma de hendidura y otras proteínas adaptadoras2. La proteína de l....

Protocolo

1. División y siembra de células

  1. Caliente el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco estéril, incluyendo un 10% de suero de pantorrilla fetal (FCS), solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y trippsina estéril a 37 °C. Active el banco limpio.
  2. Prepare una placa de 6 pozos añadiendo un resbalón estéril de cubierta de vidrio (10 mm) a cada pozo utilizando fórceps estériles.
  3. Ponga un plato de cultivo celular de 10 cm con células Cos7 bajo el banco limpio. Bajo el banco limpio, aspirar el medio de las celdas usando un dispositivo de vacío.
  4. Sostenga el plato de cultivo celularngulado en una mano y agregue 10 ml de PBS....

Resultados

El concepto y el tiempo de este protocolo proExM se representan en la Figura 1. El día 5, las células transfectadas se fijan y se tiñen con anticuerpos fluorescentes dirigidos a la proteína de interés(Figura 1A,B). El día 6, el tratamiento con AcX conduce a la formación de grupos de aminas en todas las proteínas (incluidos los fluoróforos) (Figura 1A,B)

Discusión

El método presentado permite al investigador visualizar proteínas celulares, por ejemplo, podocina, nefrina y componentes citoesqueléticos, por ejemplo, F-actin. Dentro de este protocolo, las células cos7 transfectadas se utilizan como modelo para estudiar la interacción de proteínas de diafragma cortadas con F-actin. Desafortunadamente, las líneas celulares de podocitos inmortalizadas no expresan suficientes cantidades endógenas de proteínas de diafragma cortadas19.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Blanka Duvnjak y Nikola Kuhr por su excelente asistencia técnica.

....

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylamide >99%Sigma-AldrichA3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SEinvitrogenA-20770store up to 4 months
APSSigma-AldrichA3678-25G
Deckgläser (cover glasses)EngelbrechtK1243224x32mm #1.0
Diamont cutterVWR201-0392for cutting the cover slips
Guanidine HClSigma-AldrichG3272-100G8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrushLeon Hardy3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)Thermo Fischer 1565478624x24mm #1.5
N,N`-MethylenbisacrylamideSigma-AldrichM7256-25G
Objektträger UniMarkMarienfeld703010
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Sodium AcrylateSigma-Aldrich408220check purity 
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
Staining chamberproduced at the university's workshop
TEMEDROTH2367.1
6-Well glass bottom platesCellvisP06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546 chrometranon-available1:40
Anti Podocin produced in rabbitSigmaP-0372-200UL1:200
Donkey anti guinea-pig CF633SigmaSAB4600129-50UL1:200
Goat anti rabbit 488Life TechnologiesA110341:1000
Guinea pig anti nephrinOrigeneBP50301:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1Zeissnon-available

Referencias

  1. Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
  2. Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioqu micaN mero 170microscop a de expansi nnefrinaactinapodocinas per resoluci nproExM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Investigación

Educación

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados