Imagen de las proteínas podocíticas nefrina, actina y podocina con microscopía de expansión

Resumen

El método presentado permite visualizar proteínas celulares etiquetadas fluorescentemente con microscopía de expansión que conduce a una resolución de 70 nm en un microscopio convencional.

Resumen

La interrupción del filtro glomerular compuesto por el endotelio glomerular, la membrana glomerular del sótano y los podocitos, resulta en albúmina. Los procesos del pie de podocito contienen haces de actina que se unen a proteínas adaptadoras citoesqueléticos como la podocina. Esas proteínas adaptadoras, como la podocina, unen la columna vertebral del diafragma de hendidura glomerular, como la nefrina, con el citoesqueleto actin. Estudiar la localización y la función de estas y otras proteínas podocíticas es esencial para la comprensión del papel del filtro glomerular en la salud y la enfermedad. El protocolo presentado permite al usuario visualizar actina, podocina y nefrina en células con imágenes de super resolución en un microscopio convencional. En primer lugar, las células se tiñen con una técnica convencional de inmunofluorescencia. Todas las proteínas dentro de la muestra se anclan covalentemente a un hidrogel hinchable. A través de la digestión con proteinasa K, las proteínas estructurales se cleaved permitiendo la hinchazón isotrópica del gel en el último paso. La diálisis de la muestra en agua da como resultado una expansión de 4-4,5 veces de la muestra y la muestra se puede imaginar a través de un microscopio de fluorescencia convencional, lo que representa una resolución potencial de 70 nm.

Introducción

Albuminuria es un parámetro sustituto del riesgo cardiovascular y resulta de la interrupción del filtro glomerular^1. El filtro glomerular se compone del endotelio fenestrado, la membrana glomerular del sótano y el diafragma cortado formado por podocitos. Los procesos de pie primario y secundario de los podocitos se envuelven alrededor de la pared capilar del glomérulo^2. La delicada estructura de los procesos de los pies se mantiene mediante haces corticales de actina que también sirven como anclajes para múltiples proteínas de diafragma de hendidura y otras proteínas adaptadoras^2. La proteína de l....

Protocolo

1. División y siembra de células

1. Caliente el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco estéril, incluyendo un 10% de suero de pantorrilla fetal (FCS), solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y trippsina estéril a 37 °C. Active el banco limpio.
2. Prepare una placa de 6 pozos añadiendo un resbalón estéril de cubierta de vidrio (10 mm) a cada pozo utilizando fórceps estériles.
3. Ponga un plato de cultivo celular de 10 cm con células Cos7 bajo el banco limpio. Bajo el banco limpio, aspirar el medio de las celdas usando un dispositivo de vacío.
4. Sostenga el plato de cultivo celularngulado en una mano y agregue 10 ml de PBS....

Resultados

El concepto y el tiempo de este protocolo proExM se representan en la Figura 1. El día 5, las células transfectadas se fijan y se tiñen con anticuerpos fluorescentes dirigidos a la proteína de interés(Figura 1A,B). El día 6, el tratamiento con AcX conduce a la formación de grupos de aminas en todas las proteínas (incluidos los fluoróforos) (Figura 1A,B)

Discusión

El método presentado permite al investigador visualizar proteínas celulares, por ejemplo, podocina, nefrina y componentes citoesqueléticos, por ejemplo, F-actin. Dentro de este protocolo, las células cos7 transfectadas se utilizan como modelo para estudiar la interacción de proteínas de diafragma cortadas con F-actin. Desafortunadamente, las líneas celulares de podocitos inmortalizadas no expresan suficientes cantidades endógenas de proteínas de diafragma cortadas¹⁹.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available