Imagen de las proteínas podocíticas nefrina, actina y podocina con microscopía de expansión

Resumen

El método presentado permite visualizar proteínas celulares etiquetadas fluorescentemente con microscopía de expansión que conduce a una resolución de 70 nm en un microscopio convencional.

Resumen

La interrupción del filtro glomerular compuesto por el endotelio glomerular, la membrana glomerular del sótano y los podocitos, resulta en albúmina. Los procesos del pie de podocito contienen haces de actina que se unen a proteínas adaptadoras citoesqueléticos como la podocina. Esas proteínas adaptadoras, como la podocina, unen la columna vertebral del diafragma de hendidura glomerular, como la nefrina, con el citoesqueleto actin. Estudiar la localización y la función de estas y otras proteínas podocíticas es esencial para la comprensión del papel del filtro glomerular en la salud y la enfermedad. El protocolo presentado permite al usuario visualizar actina, podocina y nefrina en células con imágenes de super resolución en un microscopio convencional. En primer lugar, las células se tiñen con una técnica convencional de inmunofluorescencia. Todas las proteínas dentro de la muestra se anclan covalentemente a un hidrogel hinchable. A través de la digestión con proteinasa K, las proteínas estructurales se cleaved permitiendo la hinchazón isotrópica del gel en el último paso. La diálisis de la muestra en agua da como resultado una expansión de 4-4,5 veces de la muestra y la muestra se puede imaginar a través de un microscopio de fluorescencia convencional, lo que representa una resolución potencial de 70 nm.

Introducción

Albuminuria es un parámetro sustituto del riesgo cardiovascular y resulta de la interrupción del filtro glomerular^1. El filtro glomerular se compone del endotelio fenestrado, la membrana glomerular del sótano y el diafragma cortado formado por podocitos. Los procesos de pie primario y secundario de los podocitos se envuelven alrededor de la pared capilar del glomérulo^2. La delicada estructura de los procesos de los pies se mantiene mediante haces corticales de actina que también sirven como anclajes para múltiples proteínas de diafragma de hendidura y otras proteínas adaptadoras^2. La proteína de la columna vertebral del diafragma cortado se llama nefrina e interactúa de manera homofílica con moléculas de nefrina de podocitos opuestos. A través de diversas proteínas adaptadoras, la nefrina está vinculada al actin cytoskeleton^2,3. Las mutaciones en el gen de codificación de nefrina NPHS1 conducen al síndrome nefrótico del tipo^{finlandés 4.}

Una de las proteínas que interactúan con la nefrina es la podocina, una proteína similar a la horquilla de la familia de la estomatina^3. Podocin recluta nefrina a balsas lipídicas y la vincula con el actin cytoskeleton⁵. La podocina está codificada por el gen NPHS2. Las mutaciones en NPHS2 conducen al síndrome nefrótico resistente a los esteroides⁶.

Para visualizar y co-localizar las proteínas adaptadoras de actina, se pueden utilizar técnicas de inmunofluorescencia. Desafortunadamente, la barrera de difracción de la luz limita la resolución de los microscopios de fluorescencia convencionales a 200-350 nm⁷. Las nuevas técnicas de microscopía, por ejemplo, el agotamiento estimulado de emisiones (STED)^8,la microscopía de localización fotoactivada (PALM)^9,la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM o dSTORM) o la microscopía de eliminación de estado de tierra seguida de retorno individual de moléculas (GSDIM)^9,10,11,permiten una resolución de hasta aproximadamente 10 nm. Sin embargo, estas técnicas de súper resolución requieren microscopios altamente caros, personal bien capacitado y, por lo tanto, no están disponibles en muchos laboratorios.

La microscopía de expansión (ExM) es una técnica novedosa y sencilla que permite imágenes de súper resolución con microscopios convencionales y que potencialmente está disponible para una gran comunidad de investigación^12. En la microscopía de expansión de retención de proteínas (proExM), la muestra de interés (células o tejidos) se fija y se tiñe con fluoróforos^13. Las proteínas dentro de la muestra son entonces ancladas covalentemente por una molécula pequeña (6-((Accriloyl)amino)ácido hexanoico, éster de succinimidyl, AcX) en un hidrogel hinchable^13. A través de la digestión enzimática con proteinasa K (ProK), las proteínas y fluoróforos mantienen su posición relativa dentro del gel después de la expansión^13. Después de la hinchazón del gel, la muestra se expande hasta 4,5 veces (expansión volumétrica 90 veces) lo que conduce a una resolución lateral efectiva de aproximadamente 60-70 nm (300 nm/4,5). Las modificaciones de esta técnica pueden incluso permitir una expansión de 10 veces (expansión volumétrica de 1.000 veces), lo que representa una resolución de 20-30 nm en microscopios convencionales^14,15,16.

Las estructuras glomerulares del ratón y los riñones humanos se han visualizado a través de ExM^17. Dentro de este artículo, presentamos un protocolo proExM detallado para visualizar imágenes de súper resolución de F-actin y la podocina proteica actin-adaptador dentro de las células utilizando un microscopio de fluorescencia convencional.

Protocolo

1. División y siembra de células

1. Caliente el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco estéril, incluyendo un 10% de suero de pantorrilla fetal (FCS), solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y trippsina estéril a 37 °C. Active el banco limpio.
2. Prepare una placa de 6 pozos añadiendo un resbalón estéril de cubierta de vidrio (10 mm) a cada pozo utilizando fórceps estériles.
3. Ponga un plato de cultivo celular de 10 cm con células Cos7 bajo el banco limpio. Bajo el banco limpio, aspirar el medio de las celdas usando un dispositivo de vacío.
4. Sostenga el plato de cultivo celularngulado en una mano y agregue 10 ml de PBS estéril al lado del plato de cultivo celular para evitar el enjuague de las células. Ponga el plato de cultivo celular para que PBS enjuague el plato de cultivo celular completo.
5. Retire el PBS y agregue 1 ml de trypsin al centro del plato de cultivo celular e incuba durante 5 minutos a 37 °C.
6. Detenga la reacción de trippsinización añadiendo 10 ml de DMEM incluyendo 10% FCS y pipetear la solución celular arriba y abajo con un pipeteador para separar manualmente las celdas.
7. Analice el número de celda por mililitro utilizando una cámara de recuento.
8. Semillas 68.000 células en medio de 2 ml por pozo en la cubierta de vidrio se desliza en la placa de 6 pozos. Distribuya las celdas dentro de la placa de 6 pozos agitando cautelosamente la placa horizontal y verticalmente.
   NOTA: Las células deben estar dispersas.
9. Incubar las células durante la noche en una incubadora de 37 °C con un 5% de CO_2.

2. Transfección de células

1. Prepare dos tubos estériles de 1,5 ml (uno para ADN diluido (A) y otro para reactivo diluido para transfección lipídica catiónica (B)). Pipeta 0,75 μg de nefrina y 0,75 μg de plásmido de expresión de podocina cDNA por pozo en un tubo de 1,5 ml y diluirlo en 100 μL de medio sérico reducido por pozo. Añadir 3 μL de reactivo de transfección lipídica catiónica por pozo al segundo tubo de 1,5 ml y diluir con 100 μL de medio sérico reducido. Incuba ambas reacciones durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2. Combine ambas reacciones (A y B) con un complejo de lípidos de ADN e incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Agregue con precaución 200 μL del complejo DE lípidos de ADN a cada pozo.
3. Incubar las células transfectadas a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 48 h sin cambiar el medio.

3. Inmunoetiquetado de estructuras celulares

1. Prepare una solución de fijación (4% (w/v) paraformaldehído en PBS, 1 mL/pozo), la solución de permeabilización (0,5% (w/v) Triton X-100 en PBS, 1 mL/pozo) y una solución de bloqueo (5% (v/v) de albúmina sérica bovina en PBS, 1 mL/pozo).
2. Retire el medio con un dispositivo de vacío. Añadir 2 ml de PBS a cada pozo para eliminar el medio adicional. Aspirar el PBS por completo.
   NOTA: Para evitar lavar las células con PBS, asegúrese de pipetear PBS no en la tapa de vidrio resbalar directamente.
3. Fijar celdas con 4% (w/v) paraformaldehído (PFA) disuelto en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Alternativamente, fije las células en 3% (v/v) glyoxal-etanol¹⁸.
4. Deseche la PFA y lave las células dos veces en PBS (2 ml cada una) evitando el pipeteo directo en los resbalones de la cubierta de vidrio. Permeabilizar las células fijas con Tritón X-100 0.5% (w/v) en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
5. Retire la solución de permeabilización y lave dos veces con PBS como se indica en el paso 3.2.
6. Bloquee las celdas añadiendo 1 ml de BSA del 5% (v/v) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Incubar las células con 200 μL del anticuerpo primario (anticuerpo anti-podocina 1:200 en 1% (v/v) BSA en PBS) durante la noche a 4 °C.
   NOTA: Alternativamente, incuba el anticuerpo primario durante 1 h a temperatura ambiente.
7. Retire el anticuerpo primario y lave tres veces con PBS como en el paso 3.2. Agregue el anticuerpo secundario (el anticongelado de cabra Alexa 488 1:1000 en 1% (v/v) BSA en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Mantenga las celdas en la oscuridad usando una caja.
8. Deseche el anticuerpo secundario y lávelo con PBS tres veces.
9. Retire PBS e incuba las células con 200 μL de anticuerpo anti-nefrina 1:100 en 1% (v/v) BSA en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Lávese con PBS tres veces. Mantenga las celdas en la oscuridad usando una caja.
10. Retire PBS e incuba con el anticuerpo secundario burros anti-conejillo de indias 633, 1:200, durante 1 h a temperatura ambiente. Lávese con PBS tres veces. Mantenga las celdas en la oscuridad usando una caja.

4. Microscopía de expansión

1. preparación
   1. Para formar los espaciadores de la cámara de gelación, corte los resbalones de la cubierta de vidrio #1.0 y #1.5 en rayas de 5 mm (cuatro cada una por tobogán de vidrio) usando un cuchillo de diamante. Coloque las rayas deslizantes de la cubierta #1,5 mm de modo que formen un cuadrado de 2,5 cm de longitud en un tobogán de vidrio y colóquelas en una cámara de tinción(Figura 2A1-C1). Pipeta una gota de ddH₂O en las esquinas del cuadrado para adherir las rayas deslizantes de la cubierta de vidrio entre sí y a la diapositiva de vidrio (Figura 2A2-C2).
      NOTA: Evite el secado completo de ddH₂O a medida que se pierda la fuerza de adherencia. Si es necesario, aplique más gotas de ddH₂O. Espere aproximadamente 20 minutos para que los resbalones de la cubierta de #1,5 mm estén firmemente unidos antes de comenzar con el paso 4.1.2.
   2. Coloque cuatro tiras deslizantes de cubierta de vidrio #1.0 por deslizamiento de cubierta en los #1,5 mm de los resbalones de la cubierta. Adhiera las rayas pipeteando una gota en cada franja deslizante de la cubierta de #1,5 mm(Figura 2A3-C3).
      NOTA: El espesor del gel debe ser de al menos 0,15 mm para facilitar el manejo en el progreso del protocolo. Sin embargo, para evitar el gel excesivo en la parte superior de las células, mantenga la altura de los espaciadores cerca del sustrato celular. Mediante el uso de #1.5 y #1.0 rayas deslizantes de la cubierta como espaciadores, la altura de los espaciadores será de aproximadamente 0,3 mm. Las células se adhieren al vidrio de la cubierta (altura 0,12 mm). Por lo tanto, el gel será lo suficientemente grueso como para manejar, pero se evita el gel excesivo en la parte superior de las células usando #1.0 y #1.5 cubren las rayas de vidrio como espaciadores.
   3. Para la tapa de la cámara de gelificación, envuelva un vaso de cubierta (#1.5) con película de parafina. Evite cualquier pliegue o suciedad en la película de parafina(Figura 2A5-C5).
2. Anclaje y polimerización (gelación)
   1. Prepare el búfer de anclaje (véase la Tabla 1). Para el tratamiento de anclaje, reemplace PBS por 250 μL de amortiguador de anclaje por pozo directamente en el resbalón de la cubierta de vidrio e incubar durante 3 h a temperatura ambiente. Mantenga el sustrato en la oscuridad con una caja.
      NOTA: Alternativamente, incuba durante la noche a temperatura ambiente. Prepare un nuevo búfer de anclaje para cada experimento y espere 10-15 minutos hasta que se disuelva correctamente. 6-(Acrililo)amino)ácido hexanoico, éster de succinimidyl (AcX) debe ser reemplazado cada 4-5 meses para asegurar un anclaje adecuado.
   2. Retire el búfer de anclaje y lave una vez con PBS de 1,5 ml por pozo.
   3. Para manchar las fibras de actina, descongelar una solución de fhalloidina compatible con ExM e incubar la fhalloidina (5 μL de fhalloidina diluida en 195 μL de 1% (v/v) BSA en PBS/pozo) durante 45 min a temperatura ambiente. Mantenga las muestras en la oscuridad con una caja.
   4. Mientras tanto, disolver el acrilato de sodio en ddH₂O usando un dispositivo de agitación. Sobre hielo, prepare la solución del monómero (véase la Tabla 1).
      NOTA: El acrilato de sodio disuelto debe ser una solución transparente e incolora. Si la solución es amarilla, sustitúyala por un nuevo acrilato de sodio.
   5. Preparar la solución de gelificante sobre hielo (ver Tabla 1). Pipeta ammoniumperoxidsulfato (APS) en la solución de gelling justo antes de que la solución de gelling se aplique a la cámara de gelación.
   6. Retire la faloidina de las células y lave con 1,5 ml de PBS dos veces a temperatura ambiente. Deje 1,5 mL PBS dentro del pozo para facilitar la eliminación de la muestra en el resbalón de la cubierta de vidrio.
   7. Coloque las celdas en el vaso de la cubierta en la cámara de gelificante con fórceps y una cánula para levantar el resbalón de vidrio de la cubierta de la placa de 6 pozos.
      NOTA: Las celdas deben estar en la parte superior del resbalón de la cubierta de vidrio. El resbalón de la cubierta de vidrio no debe tocar los espaciadores.
   8. Agregue APS a la solución de gelling y vórtice en breve. Pipeta 200 μL de solución de gelificante en la muestra (Figura 2A4-C4). Cierre con precaución la cámara de gelación evitando burbujas de aire dentro del gel(Figura 2A5-C5).
   9. Incubar la cámara de gelificante durante al menos 1 h a 37 °C para polimerizar el gel en la cámara de tinción húmeda.
3. Homogeneización (digestión)
   1. Saca la cámara de manchas de la incubadora. Para abrir la tapa de la cámara de gelificación, introduzca una cuchilla de afeitar entre la tapa y el espaciador. Retire la tapa con precaución. Retire los espaciadores con la cuchilla de afeitar y elimine todo el gel adicional cortándolo con la cuchilla de afeitar.
   2. Coloque el tobogán con el gel y cubra el vidrio en un plato lleno de PBS. Agitando suavemente, retire el vaso de la cubierta desprendida del gel. Para quitar el gel del plato fácilmente, coloque la diapositiva debajo del gel para fijar el gel a la diapositiva.
   3. Con el gel en la diapositiva, divida el gel en trozos pequeños (la cuarta parte del gel se divide en dos o tres piezas) usando la hoja de afeitar. Empuje suavemente un trozo de gel en un pozo de una placa de 6 pozos con fondo de vidrio y envolvéguelo por un pincel. Mantenga el gel hidratado con una pequeña cantidad de PBS usando el pincel para evitar la deshidratación del gel.
      NOTA: Las células se enfrentan hacia abajo.
   4. Con un microscopio invertido, tome imágenes de visión general con baja apertura numérica para determinar el factor de expansión después de la expansión.
   5. Prepare el búfer de digestión (véase la Tabla 1). Diluir proteinasa K a 4 U/ml en búfer de digestión para recibir la solución de digestión.
      NOTA: El búfer de digestión sin Proteinase K se puede almacenar a 4 °C durante 1-2 semanas.
   6. Añadir 500 μL de la solución de digestión a cada pozo y sumergir el gel dentro de la solución. Deje que digiera durante la noche a temperatura ambiente y cierre la tapa manteniendo las muestras en la oscuridad.
      NOTA: Alternativamente, deje que digiera a 37 °C durante 1 h.
4. expansión
   1. Retire la solución de digestión con una pipeta y deséchela. Agregue 1 ml de ddH₂O. Incubar el gel sumergido durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   2. Retire el agua y agregue 1 ml de ddH fresco₂O. Espere 10 minutos y continúe intercambiando agua cada 10 minutos hasta que se alcance una meseta de expansión.
      NOTA: La expansión de la muestra hasta 4,5 veces es alcanzable. El gel se vuelve ópticamente transparente.
5. imagenológico
   1. Retire el agua del gel e inicie directamente la microscopía. Utilizando un microscopio invertido, utilice principalmente un objetivo de aire (baja ampliación) para encontrar células con imágenes en el estado de pre-expansión (paso 4.3.4).
   2. Cambie a un objetivo de 40x (aceite/agua) y 63x para una mejor resolución. Excitar con la longitud de onda de interés y tomar la imagen a través de la cámara.
6. validación
   1. Tome una imagen general de la muestra. Busque y haga coincidir las mismas estructuras dentro de la muestra que se imaginaron en el paso 4.3.4. Utilice el canal con la mejor relación señal-ruido para la validación (Figura 3 A-B).
      NOTA: Ajuste los parámetros de imagen para lograr un brillo similar al de la imagen adquirida en estado no expandido (paso 4.3.4).
   2. Superponga las imágenes previas y posteriores a la expansión girándolas y desplazándolas por ImageJ. Utilice la herramienta de medición de distancia en ImageJ para medir las distancias entre estructuras claramente identificables. Mida al menos 10 estructuras diferentes.
      NOTA: Como alternativa, utilice una secuencia de comandos de Python para medir las distancias como se describe en¹⁴.
   3. Calcule el factor de expansión dividiendo las mediciones posteriores/previas a la expansión.
   4. Para determinar distorsiones, tome imágenes con una apertura numérica más alta (Figura 4A-B). Superponga estas imágenes y analícelas con ImageJ o como se describe en¹⁵.
      NOTA: La determinación de distorsiones debe realizarse de forma rutinaria, pero no necesariamente en cada muestra.

Resultados

El concepto y el tiempo de este protocolo proExM se representan en la Figura 1. El día 5, las células transfectadas se fijan y se tiñen con anticuerpos fluorescentes dirigidos a la proteína de interés(Figura 1A,B). El día 6, el tratamiento con AcX conduce a la formación de grupos de aminas en todas las proteínas (incluidos los fluoróforos) (Figura 1A,B)

Discusión

El método presentado permite al investigador visualizar proteínas celulares, por ejemplo, podocina, nefrina y componentes citoesqueléticos, por ejemplo, F-actin. Dentro de este protocolo, las células cos7 transfectadas se utilizan como modelo para estudiar la interacción de proteínas de diafragma cortadas con F-actin. Desafortunadamente, las líneas celulares de podocitos inmortalizadas no expresan suficientes cantidades endógenas de proteínas de diafragma cortadas¹⁹.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available