使用扩张显微镜对波多细胞蛋白尼腓林、阿克汀和波多辛的成像

摘要

所介绍的方法使荧光标记的细胞蛋白具有扩展显微镜的可视化，从而在传统显微镜上实现 70 nm 的分辨率。

摘要

由球状内皮、球状地下膜和卵石细胞组成的球状过滤器的破坏导致白蛋白尿。多细胞足部过程包含与细胞细胞适配器蛋白（如波多辛）结合的活性素束。这些适配蛋白，如波多辛，将球状狭缝隔膜的骨干，如肾素，与细胞链球菌素连接起来。研究这些蛋白质和其他多囊蛋白的本地化和功能对于理解球状过滤器在健康和疾病中的作用至关重要。所呈现的协议使用户能够在传统显微镜上实现超分辨率成像的细胞中的行为素、波多辛和肾上腺素的可视化。首先，细胞被传统的免疫荧光技术所染色。然后，样品中的所有蛋白质都与膨胀的水凝胶共价锚定。通过用蛋白酶K消化，结构蛋白在最后一步被切开，从而允许凝胶的同位素肿胀。在水中透析样品可使样品膨胀4-4.5倍，样品可以通过传统的荧光显微镜进行成像，潜在分辨率为70纳米。

引言

白蛋白尿是心血管风险的代孕参数，是球状过滤器¹中断的结果。球状过滤器由受精内皮、球状地下室膜和由政治细胞形成的狭缝隔膜组成。主要和次要的足部过程的负细胞包裹在毛细细壁的球状^2。足部过程的微妙结构由皮质作用素束保持，皮质作用束也作为多个狭缝隔膜蛋白和其他适配蛋白²的锚。狭缝隔膜的骨干蛋白称为肾素，以同性亲性的方式与对立的 podocyt 的肾素分子相互作用。通过不同的适配器蛋白，肾上腺素与作用细胞球菌^2，3有关。肾素编码基因NPHS1的突变导致芬兰⁴型肾综合征。

肾素的相互作用蛋白之一是波多辛，一种类似发夹的蛋白质的口腔素家族^3。波多辛招募肾上腺素脂质筏，并将其链接到行动细胞球菌^5。波多辛由NPHS2基因编码。NPHS2中的突变导致类固醇耐肾病综合征^6。

为了可视化和共同本地化行为适应蛋白，可以使用免疫荧光技术。不幸的是，光的衍射屏障将传统荧光显微镜的分辨率限制在200-350纳米^7。新型显微镜技术，如刺激发射耗竭^{（STED）8，}光激活定位显微镜（PALM）9，随机光学重建显微镜（STORM或dSTORM）或地面状态删除显微镜，然后单个分子返回（GSDIM）9，10，11，使分辨率高达约10纳米。然而，这些超级分辨率技术需要非常昂贵的显微镜，训练有素的人员，因此在许多实验室中是不可用的。

扩展显微镜 （ExM） 是一种新颖而简单的技术，能够使用传统显微镜实现超分辨率成像，并有可能提供给大型研究团体¹²。在蛋白质保留扩张显微镜（proExM）中，兴趣样本（细胞或组织）是固定的，并沾染了氟磷^13。然后，样品中的蛋白质由小分子（6-（丙烯酰）氨基酸、苏奇尼米酰酯、AcX）共同锚定成可膨胀的水凝胶^13。通过酶酶K（ProK）的酶消化，蛋白质和氟磷在膨胀¹³后在凝胶中保持其相对位置。凝胶膨胀后，样品膨胀至4.5倍（体积膨胀90倍），有效横向分辨率约为60-70纳米（300纳米/4.5）。这项技术的修改甚至可以允许10倍的扩展（1000倍体积扩展），使分辨率20-30纳米的传统显微镜^{14，15，16。}

老鼠和人类肾脏的球状结构已经通过^ExM17可视化。在本文中，我们提出了一个详细的 ProExM 协议，使用传统的荧光显微镜可视化细胞内 F-actin 和 actin 适配器蛋白 podocin 的超分辨率图像。

研究方案

1. 细胞的分裂和播种

1. 加热无菌杜尔贝科的改良鹰的介质 （DMEM）， 包括 10% 胎儿小牛血清 （FCS）， 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和无菌肌氨酸到 37 °C. 激活干净的长凳。
2. 使用无菌钳向每口井添加一个无菌玻璃盖滑（10 毫米），准备一个 6 井板。
3. 将带有 Cos7 细胞的 10 厘米细胞培养盘放在干净的长凳下。在干净的长凳下，使用真空装置吸气细胞的介质。
4. 将焦虑的细胞培养盘一手握住，在细胞培养盘的侧面加入 10 mL 的无菌 PBS，以避免冲洗掉细胞。放下细胞培养盘，使PBS冲洗完整的细胞培养盘。
5. 取出 PBS，将 1 mL 的 trypsin 添加到细胞培养盘中间，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。
6. 通过添加 10 mL 的 DMEM（包括 10% FCS）和用移液器上下移动单元件来手动分离细胞来停止尝试化反应。
7. 使用计数室分析每毫升的细胞数。
8. 种子 68，000 细胞在 2 mL 介质每井到玻璃盖滑在 6 井板。通过谨慎地水平和垂直摇动板，在 6 井板内分配细胞。
   注意:细胞应该分散。
9. 在37°C的孵化器中用5%_{的二氧化碳}在一夜之间孵化细胞。

2. 细胞的传播

1. 准备两个无菌的1.5 mL管（一个用于稀释DNA（A），一个用于稀释试剂用于血脂传播（B）。Pipette 0.75 μg 肾素和 0.75 μg 的波多辛 cDNA 表达质粒每井成一个 1.5 mL 管，并稀释成每口井 100 μL 的减少血清介质。将每口井3μL的血脂转染试剂添加到第二口1.5 mL管中，用100μL的减少血清介质稀释。在室温下孵化两种反应5分钟。
2. 将两种反应（A和B）结合到DNA脂质复合物中，在室温下孵育20分钟。小心地将DNA脂质复合物的200μL添加到每口井中。
3. 在不改变介质的情况下，在 37 °C 下以 5% CO₂ 48 h 孵化受感染的细胞。

3. 细胞结构免疫带

1. 准备固定解决方案 （4% （w/v） PBS 中的副甲醛， 1 mL/井）， 渗透溶液 （0.5% （w/v） Triton X-100 在 PBS， 1 mL/井）， 和阻塞溶液 （5% （v/v） 牛血清白蛋白在 PBS， 1 mL/井）.
2. 使用真空设备拆下介质。将 2 mL 的 PBS 添加到每个井中，以删除额外的介质。完全吸气 PBS。
   注意:为了避免用PBS清洗细胞，请务必将PBS移液器直接移到玻璃盖上。
3. 修复细胞与4%（w/v）甲醛（PFA）溶解在PBS10分钟在室温下。
   注:或者，将细胞固定在3%（v/v）胶合醇-乙醇¹⁸中。
4. 通过避免直接将管道输送到玻璃盖滑上，在 PBS 中丢弃 PFA 和洗涤细胞两次（每个 2 mL）。在室温下，用 Triton X-100 0.5% （w/v） 在 PBS 中渗透固定细胞 10 分钟。
5. 删除渗透溶液，并按步骤 3.2 指示使用 PBS 洗两次。
6. 在室温下在 PBS 中加入 1 mL 的 5% （v/v） BSA，以 1 小时的速度阻塞细胞。在 4 °C 的夜间用 200 μL 的原抗体（抗波多辛抗体 1:200 在 PBS 中 1% （v/v） BSA） 孵化细胞。
   注:或者，在室温下将主要抗体孵育1小时。
7. 取出主要抗体，用 PBS 洗三次，如步骤 3.2。在室温下加入二次抗体（山羊抗兔亚历克萨 488 1:1000 在 PBS 中 1% （v/v） BSA） 1 小时。使用盒子将细胞保持在黑暗中。
8. 丢弃二次抗体，用 PBS 清洗三次。
9. 取出 PBS，在室温下在 PBS 中用 200 μL 的抗肾蛋白抗体 1:100（v/v） BSA 孵化细胞，在室温下 1 小时。用 PBS 洗三次。使用盒子将细胞保持在黑暗中。
10. 取出PBS，用二次抗体驴孵育抗桂猪633，1:200，在室温下1小时。用 PBS 洗三次。使用盒子将细胞保持在黑暗中。

4. 扩展显微镜

1. 制备
   1. 要形成凝胶室的隔板，使用钻石刀将玻璃盖滑动#1.0 和#1.5 滑成 5 毫米条纹（每杯滑梯 4 个）。将#1.5毫米盖滑条纹放置在玻璃滑梯上，形成2.5厘米长的正方形，并放入染色室（图2A1-C1）。派珀特将 ddH₂O 的液滴放入广场的角落，将玻璃盖滑条粘合到彼此和玻璃滑梯上（图 2A2-C2）。
      注意:避免完全干燥ddH₂O，因为粘附力将丢失。如果需要，请涂抹更多 ddH₂O 的液滴，等待约 20 分钟，以便在开始步骤 4.1.2 之前稳定地连接#1.5 毫米盖片。
   2. 将四个#1.0 玻璃盖滑条纹每个盖滑到#1.5 毫米盖滑。通过在每个#1.5毫米盖滑条纹（图 2A3 -C3）上管道输送液滴来粘附条纹。
      注:凝胶的厚度应至少为 0.15 mm，以便于在协议进行中处理。但是，为了避免细胞顶部凝胶过多，请将垫片高度保持在靠近细胞基板的地方。通过使用#1.5和#1.0盖滑条纹作为垫片，间隔高度约为0.3毫米。细胞粘附在盖玻璃上（高度 0.12 mm）。因此，凝胶将足够厚，足以处理，但细胞顶部的过多凝胶避免使用#1.0和#1.5覆盖玻璃条纹作为垫片。
   3. 对于凝胶室盖，用石蜡膜包裹盖玻璃（#1.5）。避免石蜡膜上的任何褶皱或污垢（图 2A5-C5）。
2. 锚定和聚合（凝胶化）
   1. 准备锚定缓冲区（参见 表 1）。用于锚定处理，将每口井 250 μL 的锚定缓冲器直接更换到玻璃盖滑上，并在室温下孵育 3 小时。使用盒子在黑暗中保持基板。
      注:或者，在室温下通宵孵化。为每个实验准备新鲜的锚定缓冲，等待 10-15 分钟，直到它正确溶解。应每4-5个月更换6-（丙烯酰）氨基酸、苏奇尼米酰酯（AcX），以确保充分锚定。
   2. 取下锚定缓冲器，每口井洗一次 1.5 mL PBS。
   3. 要染色 actin 纤维，解冻与 ExM 兼容的法洛丁溶液，并在室温下将 195 μL 稀释的法洛丁 （5 μL 的法洛丁 1% （v/v） BSA 在 PBS/井中孵育 45 分钟。使用盒子将样品放在黑暗中。
   4. 同时，使用搅拌装置溶解ddH₂O中的丙烯酸钠。在冰上，准备单体溶液（见表1）。
      注意:溶解的丙烯酸钠应该是一种清晰无色的溶液。如果溶液为黄色，请更换为新的丙烯酸钠。
   5. 准备冰上的凝胶溶液（见 表1）。在凝胶溶液应用于凝胶室之前，将珀珀特氨基硫酸铵 （APS） 放入凝胶溶液中。
   6. 从细胞中取出法洛丁，在室温下用 1.5 mL 的 PBS 洗两次。将 1.5 mL PBS 留在井内，以便于去除玻璃盖滑上的样品。
   7. 将盖玻璃上的细胞放入凝胶室中，使用钳子和管子将盖玻璃从 6 井板上取下。
      注:细胞应在玻璃盖滑动的顶部。玻璃盖滑不应触摸隔间。
   8. 不久将 APS 添加到凝胶溶液和涡流中。样品上的200μL凝胶溶液（图2A4-C4）。通过避免凝胶内的气泡（图2A5 -C5）小心地关闭凝胶室。
   9. 在 37 °C 时将凝胶室孵化至少 1 小时，以聚合湿染色室中的凝胶。
3. 同质化（消化）
   1. 将染色室从孵化器中取出。要打开凝胶室盖，在盖子和垫片之间引入剃须刀刀片。小心地取下盖子。用剃须刀刀片取出垫片，用剃须刀刀片切割，消除所有额外的凝胶。
   2. 将滑梯与凝胶和盖玻璃放入装满 PBS 的盘中。通过轻轻摇晃，从凝胶中取出分离的盖玻璃。要轻松地从盘子中取出凝胶，将滑梯放在凝胶下面，将凝胶连接到滑梯上。
   3. 将凝胶放在滑梯上，使用剃须刀刀片将凝胶分成小块（凝胶的四分之一被分成两到三块）。轻轻将一块凝胶推入带玻璃底的 6 井板的井中，然后用画笔将其包裹起来。使用画笔保持凝胶保湿，用少量的 PBS 来避免凝胶脱水。
      注意:细胞朝下。
   4. 使用倒显微镜，以低数字光圈拍摄概览图像，以确定扩展后的扩展因子。
   5. 准备消化缓冲区（见 表1）。在消化缓冲液中稀释蛋白酶 K 至 4 U/mL 以接收消化溶液。
      注意:无蛋白酶 K 的消化缓冲器可在 4 °C 中储存 1-2 周。
   6. 将消化溶液的 500 μL 添加到每口井中，并将凝胶浸入溶液中。让它在室温下消化过夜，并关闭盖子，将样品保持在黑暗中。
      注:或者，让它在37°C下消化1小时。
4. 扩张
   1. 用移液器取出消化液并丢弃。加入1毫升的ddH₂O.在室温下将浸入式凝胶孵化10分钟。
   2. 取出水，加入1毫升的新鲜ddH₂O.等待10分钟，并继续交换水每10分钟，直到达到膨胀的高原。
      注意:样品扩展高达 4.5 倍是可以实现的。凝胶在光学上变得清晰。
5. 成像
   1. 从凝胶中取出水，直接启动显微镜。使用倒显微镜，主要使用空气目标（低放大倍数）在扩展前状态（第 4.3.4 步）中查找成像细胞。
   2. 切换到 40 倍（油/水）和 63 倍目标，以获得更好的分辨率。兴奋的兴趣波长，并通过相机拍摄图像。
6. 验证
   1. 查看示例的概述图像。查找并匹配样本中以步骤 4.3.4 拍摄的相同结构。使用信号与噪声比率最好的通道进行验证（图3 A-B）。
      注意:调整成像参数，实现与在非扩展状态下获得的图像相同的亮度（步骤 4.3.4）。
   2. 通过旋转和移动图像J来覆盖扩展前和扩展后的图像。使用 ImageJ 中的距离测量工具测量清晰可识别的结构之间的距离。测量至少 10 种不同的结构。
      注:或者，使用 Python 脚本来测量¹⁴中描述的距离。
   3. 通过划分扩展后/扩展前测量来计算扩展因子。
   4. 要确定失真，请拍摄具有较高数值光圈的图像（图 4A-B）。覆盖这些图像，并分析他们与图像J或如¹⁵中描述。
      注意:应定期对失真进行测定，但不一定在每个样本上执行。

结果

此 ProExM 协议的概念和时间在图1中进行了描述。在第5天，受感染的细胞被固定并染上荧光抗体，以感兴趣的蛋白质为目标（图1A，B）。在第6天，使用AcX治疗导致所有蛋白质（包括氟磷）（图1A，B）12形成胺组。水凝胶聚合后，这些胺组与水凝胶（第6天）共效结?...

讨论

提出的方法使研究者能够可视化细胞蛋白，如波多辛、肾上腺素和细胞骨质成分，例如F-actin。在此协议中，变质的 cos7 细胞用作研究狭缝隔膜蛋白与 F-actin 相互作用的模型。不幸的是，不朽的足细胞系不能表达足够的内源性狭缝隔膜蛋白^19。

使用这种方法，细胞蛋白可以使用传统的荧光显微镜以纳米尺度分辨率进行可视化。协议中最关键的步骤是:1） 用 AcX ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available