拡張顕微鏡によるポドサイクタンパク質のイメージングニーフリン、アクチン、ポドシン

要約

この提示方法は、従来の顕微鏡で70nmの分解能を導く拡大顕微鏡による蛍光標識された細胞タンパク質の可視化を可能にする。

要約

糸球体内皮、糸球体の地下膜およびポドサイトから構成される糸球体フィルターの破壊は、アルブミン尿をもたらす。ポドサイトの足のプロセスは、ポドシンなどの細胞骨格アダプタータンパク質に結合するアクチンバンドルを含む。これらのアダプタータンパク質は、ポドシンなどの、ネフリンなどの糸球体スリットダイヤフラムの骨格をアクチン細胞骨格に連結する。これらのタンパク質および他のポドサイクタンパク質の局在化と機能を研究することは、健康と疾患における糸球体フィルターの役割を理解するために不可欠です。提示された議定書はユーザーが従来の顕微鏡の超解像のイメージ投射と細胞のアクチン、ポドシンおよびネフリンを視覚化することを可能にする。まず、細胞は、従来の免疫蛍光技術で染色される。サンプル内のすべてのタンパク質は、その後、膨らむヒドロゲルに共有結合して固定されます。プロテアーゼKによる消化を通じて、構造タンパク質は切断され、最後のステップでゲルの等熱帯腫脹を可能にする。水中のサンプルの透析はサンプルの4-4.5倍の拡大をもたらし、サンプルは従来の蛍光顕微鏡を介して画像化することができ、70nmの潜在的な解像度をレンダリングする。

概要

アルブミン尿症は、心血管リスクの代理パラメータであり、糸球体フィルター¹の破壊による結果である。糸球体フィルターは、フェネスト処理された内皮、糸球体の地下膜およびポドサイトによって形成されたスリットダイヤフラムから構成される。ポドサイトの一次および二次足のプロセスは、グロメルラム²の毛細血管壁の周りを包む。足のプロセスの繊細な構造は、複数のスリットダイヤフラムタンパク質および他のアダプタタンパク質のアンカーとしても機能する皮質アクチン束によって維持される^2。スリットダイアフラムの骨格タンパク質はネフリンと呼ばれ、反対するポドサイトのネフリン分子と同種的に相互作用する。多様なアダプタータンパク質を介して、ネフリンは、アクチン細胞骨格^2、3にリンクされています。ネフリンコード遺伝子NPHS1の変異は、フィンランド型⁴型のネフローゼ症候群に至る。

ネフリンの相互作用タンパク質の1つは、ストマチンファミリー³のヘアピン様タンパク質であるポドシンである。ポドシンは、脂質ラフトにネフリンを募集し、アクチン細胞骨格⁵にリンクします。ポドシンは、NPHS2遺伝子によってコードされる。NPHS2の突然変異はステロイド耐性ネフローゼ症候群⁶につながる。

アクチンアダプタータンパク質を可視化し、共局化するために、免疫蛍光技術が用いられ得る。残念ながら、光の回折障壁は、従来の蛍光顕微鏡の分解能を200〜350^nm7に制限する。新規顕微鏡法は、例えば、刺激放出枯渇(STED)8、光活性化局在化顕微鏡(PALM)9、確率的光学再構成顕微鏡(STORMまたはdSTORM)、または個々の分子リターン(GSDIM)9、10、11の後に、約10nmまでの分解能を可能にする。しかし、これらの超分解能技術は、非常に高価な顕微鏡、十分な訓練を受けた人員を必要とし、したがって、多くの研究室では利用できません。

拡張顕微鏡(ExM)は、従来の顕微鏡で超解像度イメージングを可能にする新しい簡単な技術であり、大規模な研究コミュニティ¹²に潜在的に利用可能である。タンパク質保持拡大顕微鏡(proExM)において、目的とするサンプル(細胞または組織)が固定され、フルオロフォア¹³で染色される。サンプル中のタンパク質は、その後、小分子((Acryloyl)アミノ酸、コハクニミジルエステル、AcX)によって可膨らむヒドロゲル¹³に共有結合される。タンパク質および蛍光体は、タンパク質K(ProK)による酵素消化を通じて、膨張後のゲル内での相対的な位置を維持^する13。ゲルの腫脹後、サンプルは4.5倍(90倍の容積膨張)まで拡大し、約60-70 nm(300 nm/4.5)の効果的な横解像度に至る。この技術の変更は、10倍の拡張(1,000倍の体積膨張)を可能にし、従来の顕微鏡^14、15、16で20〜30nmの解像度をレンダリングする。

マウスとヒト腎臓の糸球体構造は、ExM¹⁷を介して可視化されている。本論文では、従来の蛍光顕微鏡を用いて、F-アクチンおよびアクチンアダプタータンパク質ポドシンの超分解能像を細胞内で可視化する詳細なproExMプロトコルを紹介する。

プロトコル

1. 細胞の分割と播種

1. 10%の胎児子牛血清(FCS)、滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)、滅菌トリプシンを含む無菌ダルベックコの修正イーグル培地(DMEM)を37°Cに温めます。 クリーンベンチをアクティブにします。
2. 滅菌鉗子を使用して各ウェルに1つの無菌ガラスカバースリップ(10mm)を加えることによって6ウェルプレートを準備します。
3. 清潔なベンチの下にCos7細胞を持つ10cmの細胞培養皿を入れます。クリーンベンチの下で、真空装置を使用して細胞の媒体を吸引する。
4. アンギュレードされた細胞培養皿を片手に持ち、細胞培養皿の側面に10mLの無菌PBSを加えて細胞のすすがりを避けます。PBSが完全な細胞培養皿を洗いすがるように細胞培養皿を下に置きます。
5. PBSを取り出し、細胞培養皿の途中に1mLのトリプシンを加え、37°Cで5分間インキュベートします。
6. 10%FCSを含むDMEMの10 mLを加えてトリプシン反応を停止し、ピペットで細胞溶液を上下にピペットして細胞を手動で分離します。
7. カウントチャンバーを使用して、ミリリットル当たりのセル数を分析します。
8. 6ウェルプレートのガラスカバースリップに2mL培地あたり68,000個の細胞をシードします。プレートを水平および垂直に慎重に振って、6ウェルプレート内の細胞を分配します。
   注: セルは分散している必要があります。
9. 細胞を5%CO2で37°Cインキュベーターで一晩インキュベートする。

2. 細胞のトランスフェクション

1. 滅菌1.5mLチューブ(1つは希釈DNA(A)用、もう1つはカチオン脂質トランスフェクション用希釈試薬(B))用)を2つ用意します。ピペット0.75μgのネフリンと0.75 μgのポドシンcDNA発現プラスミドを1つの1.5 mLチューブに1ウェルにし、1ウェルあたり100 μLの減らされた血清培地に希釈します。2番目の1.5mLチューブに1ウェルあたり3μLのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を加え、100 μLの減らされた血清培地で希釈します。両方の反応を室温で5分間インキュベートします。
2. 両方の反応(AとB)をDNA-脂質複合体に組み合わせ、室温で20分間インキュベートします。DNA-脂質複合体をそれぞれ200μLずつ添加します。
3. トランスフェクトした細胞を培地を変えずに、37°Cで5%CO2で48時間インキュベートします。

3. 細胞構造の免疫表示

1. 固定溶液(PBS中のパラホルムアルデヒド4%(w/v)パラホルムアルデヒド、1 mL/well、透過性溶液(0.5%(w/v)トリトンX-100 PBS、1 mL/well)、ブロッキング溶液(PBS中の5%(v/v)ウシ血清アルブミン、1mL/ウェルを調製します。
2. 真空装置で媒体を取り外します。各ウェルに2mLのPBSを加え、余分な媒体を取り除きます。PBSを完全に吸引します。
   メモ:PBSで細胞を洗い流さないように、ガラスカバースリップに直接ピペットPBSを入れないようにしてください。
3. 4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに溶解し、室温で10分間溶解した細胞を固定します。
   注:または、細胞を3%(v/v)グリオキサルエタノール¹⁸に固定します。
4. ガラスカバースリップに直接ピペットを避けることによって、PFAを廃棄し、PBS(それぞれ2mL)で細胞を2回洗浄します。室温で10分間PBSでトリトンX-100 0.5%(w/v)で固定細胞を透過させます。
5. パーメアビライゼーション溶液を取り出し、ステップ3.2に示すようにPBSで2回洗浄します。
6. PBSで1mLの5%(v/v)BSAを室温で1時間加えて細胞をブロックします。一次抗体の200 μLで細胞をインキュベートする (抗ポドシン抗体 1:200 で 1%(v/v) BSA で 1%の BSA) 4 °C で一晩.
   注:または、一次抗体を室温で1時間インキュベートします。
7. 一次抗体を取り出し、ステップ3.2のようにPBSで3回洗浄します。二次抗体(ヤギ抗ウサギアレクサ488 1:1000 1%(v/v)PBSのBSA)を室温で1時間加えます。ボックスを使用して暗闇の中でセルを維持します。
8. 二次抗体を捨て、PBSで3回洗浄します。
9. PBSを取り除き、200 μLの抗ネフリン抗体1:100をPBSで1%(v/v)BSAで室温で1時間インキュベートします。PBSで3回洗います。ボックスを使用して暗闇の中でセルを維持します。
10. PBSを取り除き、二次抗体ロバ抗モルモット633、1:200、室温で1時間インキュベートします。PBSで3回洗います。ボックスを使用して暗闇の中でセルを維持します。

4. 拡張顕微鏡

1. 準備
   1. ゲル化チャンバー用スペーサーを形成するには、ダイヤモンドナイフを使用して、ガラスカバーを#1.0、#1.5を5mmストライプ(1枚4枚スライド)にカットします。#1.5 mmカバースリップストライプを、ガラススライド上に2.5cmの長さの正方形を形成し、染色チャンバーに配置します(図2A1-C1)。正方形の角に_ddH2Oの液滴をピペットし、ガラスカバースリップストライプを互いに接着し、ガラススライドに付着する(図2A2-C2)。
      注:接着力が失われるため、ddH₂Oの完全な乾燥は避けてください。必要に応じて、ddH₂O.の液滴を塗布し、約20分間待ち、#1.5 mmカバースリップが安定して取り付けられてからステップ4.1.2で始めます。
   2. カバースリップごとに4つの#1.0ガラスカバースリップストライプを#1.5mmカバースリップに置きます。各#1.5 mmカバースリップストライプに液滴をピペットしてストライプを付着させる(図2A3-C3)。
      注: プロトコルの進行の処理を容易にするために、ゲルの厚さは 0.15 mm 以上である必要があります。しかし、細胞の上に過度のゲルを避けるために、スペーサーの高さを細胞の基質に近づけます。スペーサーとして#1.5および#1.0カバースリップストライプを使用すると、スペーサーの高さは約0.3 mmになります。セルはカバーガラス(高さ0.12mm)に付着します。したがって、ゲルは取り扱いに十分な厚さになりますが、細胞の上に過度のゲルがスペーサーとして#1.0と#1.5カバーガラスストライプを使用して回避されます。
   3. ゲル化チャンバ蓋の場合は、カバーガラス(#1.5)をパラフィンフィルムで包みます。パラフィンフィルムの折り目や汚れを避けてください(図2A5-C5)。
2. アンカーと重合(ゲル化)
   1. アンカー バッファを準備します ( 表 1を参照)。アンカー処理の場合は、PBSをガラスカバースリップに直接当たり250 μLのアンカーバッファに交換し、室温で3時間インキュベートします。箱を使って、基板を暗い状態に保ちます。
      注:または、室温で一晩インキュベートしてください。すべての実験に新鮮なアンカーバッファを準備し、それが適切に溶解するまで10〜15分待ちます。6-(((Acryloyl)アミノ酸、コハシニミジルエステル(AcX)は、適切なアンカーを確保するために4〜5ヶ月ごとに交換する必要があります。
   2. アンカーバッファを取り外し、井戸あたり1.5 mL PBSで1回洗います。
   3. アクチン繊維を染色するには、ExM適合のファロイジン溶液を解凍し、ファロイジン(195 μLで195 μLの1%(v/v)BSAをPBS/ウェルで希釈したファロイジン5μL)を室温で45分間インキュベートします。箱を使って暗闇の中でサンプルを保ちます。
   4. その間、攪拌装置を用いて_ddH2O中にアクリレートナトリウムを溶解する。氷の上で、単量体溶液を準備する( 表1を参照)。
      注:溶存ナトリウムアクリレートは、明確で無色の溶液でなければなりません。溶液が黄色の場合は、新しいアクリレートナトリウムに交換してください。
   5. 氷の上でゲル化液を準備する( 表1を参照)。ゲル化液がゲル化チャンバーに塗布される直前に、ゲル化液中にピペットアンモニウムペルオキシドスルフェート(APS)を投入した。
   6. 細胞からファロイジンを取り出し、室温で2回PBSの1.5mLで洗浄します。ガラスカバースリップのサンプルの除去を容易にするために井戸の中に1.5 mL PBSを残します。
   7. 鉗子とカニューレを使用して、カバーガラスの上の細胞をゲル化チャンバーに入れ、6ウェルプレートからカバーガラススリップを持ち上げます。
      注: セルは、ガラスカバースリップの上部に置く必要があります。ガラスカバースリップはスペーサーに触れてはならない。
   8. すぐにゲル化液と渦にAPSを追加します。サンプル上の200μLのゲル化溶液(図2A4-C4)を用いた)。ゲル内の気泡を避けることでゲル化チャンバーを慎重に閉じる(図2A5-C5)。
   9. ゲル化チャンバーを37°Cで少なくとも1時間インキュベートし、濡れた染色チャンバ内でゲルを重合させる。
3. 均質化(消化)
   1. インキュベーターから染色チャンバーを取り出します。ゲル化チャンバーの蓋を開けるには、蓋とスペーサの間にカミソリの刃を導入します。蓋は慎重に取り外します。カミソリの刃でスペーサーを取り外し、カミソリの刃で切ることによってすべての余分なゲルを排除する。
   2. スライドにゲルを入れ、ガラスをカバーしてPBSで満たされた皿に入れます。軽く振ることで、取り外したカバーガラスをゲルから取り外します。食器からゲルを取り除きやすくするには、スライドをゲルの下に置き、スライドにゲルを取り付けます。
   3. スライド上のゲルで、カミソリの刃を使用してゲルを小さく分割します(ゲルの4分の1は2〜3個に分割されます)。ゲルの1枚をガラス底の6ウェルプレートの井戸にそっと押し込み、ペイントブラシで包みます。ゲルの脱水を避けるために、ペイントブラシを使用してPBSの少量でゲルを保湿してください。
      メモ: セルは下向きに向いています。
   4. 反転顕微鏡を使用して、低い数値開口で画像を撮り、膨張後の膨張因子を決定します。
   5. ダイジェスト バッファを準備します ( 表 1を参照)。消化液を受け取る消化バッファーで4 U/mLにプロテイナーゼKを希釈。
      注:プロテアーゼKなしの消化バッファーは、4°Cで1〜2週間保存することができます。
   6. 消化液500μLを各ウェルに加え、ゲルを溶液内に浸します。室温で一晩消化させ、サンプルを暗闇の中に保つ蓋を閉じます。
      注:または、37°Cで1時間消化させます。
4. 拡張
   1. ピペットで消化液を取り出し、廃棄します。ddH₂O.1 mLを加えて、浸漬ゲルを室温で10分間インキュベートします。
   2. 水を取り除き、1mLの新鮮なddH₂O.を加え、10分間待ち、膨張の高原に達するまで10分ごとに水を交換し続けます。
      注:サンプルの拡大は4.5倍まで達成可能です。ゲルは光学的に透明になる。
5. イメージング
   1. ゲルから水を取り出し、直接顕微鏡を開始します。反転顕微鏡を用いて、主に空気対物(低倍率)を使用して、前膨張状態の画像化された細胞を見つける(ステップ4.3.4)。
   2. 40x(オイル/水)と63倍の目標に切り替えて、解像度を向上させます。興味のある波長で興奮し、カメラを介して画像を撮ります。
6. 検証
   1. サンプルの概要画像を表示します。サンプル内の、手順 4.3.4 でイメージした構造と同じ構造を見つけて一致させます。検証に最適な信号対雑音比のチャンネルを使用します(図3 A-B)。
      注: イメージング パラメータを調整して、非展開状態で取得したイメージと同様の明るさを実現します(ステップ 4.3.4)。
   2. ImageJ で展開前と後のイメージを回転およびシフトしてオーバーレイします。ImageJ の距離測定ツールを使用して、明確に識別可能な構造間の距離を測定します。少なくとも10種類の構造を測定します。
      注: または、Python スクリプトを使用して^、14で説明したように距離を測定します。
   3. 展開後/展開前の測定値を除算して、拡張係数を計算します。
   4. 歪みを判断するには、より高い数値絞りを持つ画像を撮影します(図4A-B)。これらの画像をオーバーレイし、ImageJ または¹⁵で説明されているように分析します。
      注: 歪みの判定は、必ずしもすべてのサンプルで行う必要がありますが、必ずしも行う必要があります。

結果

この proExM プロトコルの概念とタイミングを図 1に示します。5日目、トランスフェクトされた細胞は、目的のタンパク質を標的とする蛍光抗体で固定され染色される(図1A、B)。6日目、AcXによる治療は、全てのタンパク質(フルオロフォアを含む)上でアミン基の形成を導く(図1A、B)

ディスカッション

提示された方法は、研究者が細胞タンパク質、例えば、ポドシン、ネフリン、および細胞骨格成分、例えば、F-アクチンを可視化することを可能にする。このプロトコルでは、トランスフェクトされたcos7細胞がF-アクチンとスリットダイヤフラムタンパク質の相互作用を研究するモデルとして使用されています。残念なことに、不死化ポドサイト細胞株は、スリットダイヤフラムタンパク質

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available