تحليل الترجمة في الدماغ الماوس النامية باستخدام التنميط متعددة

Summary

يتطلب تطور دماغ الثدييات التحكم السليم في التعبير الجيني على مستوى الترجمة. هنا، ونحن نصف نظام التنميط متعددة مع سهلة لتجميع السكروز التدرج صنع ومنصة الكسر لتقييم الحالة التحويلية من الحمض النووي الريبي في الدماغ النامية.

Abstract

يعتمد التطور السليم لدماغ الثدييات على توازن دقيق بين انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. يتم التحكم في هذا التوازن بإحكام من خلال التعبير الجيني الذي يتم ضبطه على مستويات متعددة ، بما في ذلك النسخ وما بعد النسخ والترجمة. وفي هذا الصدد، تبرز مجموعة متزايدة من الأدلة دورا حاسما للتنظيم التحويلي في تنسيق قرارات مصير الخلايا الجذعية العصبية. الكسر المتعدد هو أداة قوية لتقييم حالة الحمض النووي الريبي الترجمي على المستويين الجيني العالمي والفردي. هنا، نقدم خط أنابيب متعدد السمات في المنزل لتقييم الكفاءة التحويلية في الخلايا من قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نصف بروتوكولات إعداد تدرج السكروز وتحلل الأنسجة والطرد الفائق والتحليل القائم على الكسر للحالة الترجمية ل mRNA.

Introduction

أثناء تطور دماغ الثدييات ، تتكاثر الخلايا الجذعية العصبية وتفرق لتوليد الخلايا العصبية وجليا^1،2 . اضطراب هذه العملية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في بنية الدماغ ووظيفة, كما رأينا في العديد من اضطرابات النمو العصبي^3,4. السلوك السليم للخلايا الجذعية العصبية يتطلب التعبير المنظم لجينات محددة⁵. في حين تمت دراسة التحكم اللاجيني والنسخي لهذه الجينات بشكل مكثف ، تشير النتائج الأخيرة إلى أن تنظيم الجينات على مستويات أخرى يساهم أيضا في تنسيق انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز^6و7و^8و9و10. وبالتالي ، فإن معالجة برامج التحكم التحويلية سوف تعزز بشكل كبير فهمنا للآليات الكامنة وراء قرار مصير الخلايا الجذعية العصبية وتطور الدماغ.

وقد طبقت ثلاث تقنيات رئيسية مع نقاط قوة مختلفة على نطاق واسع لتقييم الوضع الترجمي من مرنا، بما في ذلك التنميط ريبوسوم، وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) والتنميط متعدد السمات. التنميط ريبوسوم يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد شظايا الحمض النووي الريبي المحمية ريبوسوم، مما يسمح للتحليل العالمي لعدد وموقع ترجمة الريبوسومات على كل نسخة لاستنتاج غير مباشر معدل الترجمة من خلال مقارنتها وفرة النص¹¹. TRAP يستفيد من البروتينات الريبوسومية الموسومة بالظهارة لالتقاط الريبوسوم ملزمة mRNAs¹². وبالنظر إلى أنه يمكن التعبير عن البروتينات الريبوسومية الموسومة في أنواع خلايا محددة باستخدام النهج الوراثية، يسمح TRAP بتحليل الترجمة بطريقة خاصة بنوع الخلية. وبالمقارنة، فإن التنميط المتعدد، الذي يستخدم تجزئة تدرج كثافة السكروز لفصل الجزء الحر والسيء الترجمة (أحاديات أخف وزنا) عن تلك التي تترجم بنشاط عن طريق الريبوسومات (البوليسومات الأثقل)، يوفر قياسا مباشرا لكثافة الريبوسوم على مرنا^13. ميزة واحدة تقدم هذه التقنية هو براعة لدراسة ترجمة مرنا محددة من الفائدة، فضلا عن تحليل ترجمة الجينوم على نطاق^{واسع 14}.

في هذه الورقة، ونحن نصف بروتوكول مفصل من التنميط متعددة لتحليل قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نستخدم نظام تجميعها في المنزل لإعداد تدرجات كثافة السكروز وجمع الكسور لتطبيقات المصب. يمكن تكييف البروتوكول المعروض هنا بسهولة لتحليل أنواع أخرى من الأنسجة والكائنات الحية.

Protocol

وأشرفت لجنة رعاية الحيوانات في جامعة كالغاري على جميع استخدام الحيوانات. تم شراء فئران CD1 المستخدمة في التجربة من بائع تجاري.

1. إعداد الحلول

ملاحظة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، رش منضدة العمل وجميع المعدات مع محلول إزالة التلوث RNase. يتم استخدام نصائح خالية من RNase للتجربة. يتم إعداد جميع الحلول في المياه الخالية من RNase.

1. إعداد محلول مخزون سيكلوهيكسميد (100 ملغم/مل) في DMSO وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
2. إعداد 2.2 M حل مخزون السكروز بإضافة 75.3 غرام من السكروز إلى المياه الخالية من RNase وتتصدر حجم إلى 100 مل (لإعداد ~ 16 التدرج). يمكن الاحتفاظ بالمحلول عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
3. إعداد محلول الملح 10x (1 M NaCl; 200 mM تريس-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl₂).
4. إعداد 60٪ (ث / v) محلول مطاردة السكروز، التي تحتوي على 30 غرام من السكروز، 5 مل من محلول الملح 10x وأعلى حجم يصل إلى 50 مل مع المياه الخالية من RNase.
5. اختياريا، إضافة بقعة من بروموفينول الأزرق أو ما يقرب من 5 ميكرولتر من 1٪ بروموفينول الأزرق في المياه الخالية من RNase إلى الحل مطاردة. 1.6. تخزين الحلول عند 4 °C.

2. إعداد تدرج السكروز

ملاحظة: الدقة في إعداد تدرجات السكروز أمر بالغ الأهمية في الحصول على نتائج متسقة وقابلة للاستنساخ.

1. لإعداد ستة 10-50٪ تدرجات السكروز، تمييع محلول السكروز 2.2 M كما هو الحال في الجدول 1.

محلول السكروز	10%	20%	30%	40%	50%
2.2 م السكروز	2 مل	4 مل	6 مل	8 مل	10 مل
محلول ملح 10X	1.5 مل	1.5 مل	1.5 مل	1.5 مل	1.5 مل
سيكلوهيكسميد	15 ميكرولتر	15 ميكرولتر	15 ميكرولتر	15 ميكرولتر	15 ميكرولتر
الماء	11.5 مل	9.5 مل	7.5 مل	5.5 مل	3.5 مل
إجمالي حجم الصوت	15 مل	15 مل	15 مل	15 مل	15 مل

الجدول 1: تخفيف السكروز للمستحضرات من تدرجات السكروز.

ملاحظة: قم دائما بإعداد تدرجات السكروز في مضاعفات اثنين لتحقيق التوازن بين الوزن أثناء الطرد الفائق.

2. مسح إبرة نهاية معدنية حادة مع محلول إزالة التلوث RNase. شطف لفترة وجيزة أنابيب الطرد المركزي للغاية، والأنابيب والمحاقن باستخدام المياه الخالية من RNase. الهواء الجاف الأنابيب بحيث لا يبقى قطرة ماء في الأنابيب كما أي الماء المتبقي سوف يغير تركيز السكروز.
3. ضع الإبرة المعدنية على حامل المشبك وأنبوب الطرد المركزي على المسرح الآلي. لإعداد التدرجات باستمرار، تم استخدام نظام تجميع المنزل الذي يحتوي على مرحلة الآلية لعقد أنبوب الطرد الفائق ومضخة حقنة لحقن حلول السكروز(الشكل 1،انظر الخطوة 9 للحصول على تفاصيل).
4. ملء حقنة 30 مل مع ~ 16 مل من السكروز 10 ٪ (ما يكفي لستة تدرجات) ، ووضعها على مضخة حقنة وتوصيله إلى الإبرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة، والأنابيب، والإبرة. مسح طرف قبالة الإبرة لإزالة أي حل المتبقية.
5. تحريك المرحلة الآلية حتى بحيث غيض من الإبرة يمس وسط الأنبوب في الجزء السفلي.
6. ضبط مضخة حقنة بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة لحجم 2.3 مل.
7. بعد الاستغناء عن 2.3 مل من محلول السكروز 10٪، انتقل إلى أسفل المرحلة الآلية وتكرار العملية لجميع التدرجات الستة.
8. كرر الخطوات 2.4-2.7 لإضافة محلول السكروز 20٪ إلى الجزء السفلي من الأنابيب، تليها حلول السكروز 30٪، 40٪ و 50٪ بالمثل.
9. بعد إعداد التدرج، ختم أنبوب الطرد المركزي الفائق باستخدام فيلم البارافين.
10. اترك الأنابيب بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية بحيث تنتشر طبقات السكروز المختلفة معا لإعطاء تدرج مستمر.

3. تشريح الأنسجة

ملاحظة: الفئران الحوامل قتل رحيم عن طريق خلع عنق الرحم يسبقه التخدير مع 5٪ isoflurane.

1. جمع أجنة الفئران CD1 في اليوم الجنيني 12، أو غيرها من النقاط الزمنية حسب الحاجة، ووضع الأجنة في لوحة Ø 10 سم التي تحتوي على الجليد الباردة هانك متوازنة الملح الحل (HBSS) على الجليد للحفاظ على صلاحية الخلية.
2. تحت نطاق التشريح، نقل جنين واحد إلى لوحة Ø 6 سم تحتوي على HBSS الجليد الباردة.
3. استخدام الإبر 21-23 G لإصلاح موقف الرأس عن طريق اختراق من خلال عيون في زاوية 45 درجة تقريبا وتطبيق القوة للتأكد من الإبر ثابتة على لوحة(الشكل 2A).
4. استخدام ملقط No.5 لإزالة الجلد والجمجمة، من الوسط إلى الجانبين.
5. استخدام ملقط لقطع المصابيح الشمية وإزالة السحايا لفضح الأنسجة القشرية.3.6.Use ملقط منحني لقطع الأنسجة القشرية إلى 2-3 مل من المتوسطة العصبية على الجليد (الشكل 2B). تجمع الأنسجة القشرية من أجنة مختلفة حسب الحاجة. الأنسجة من 8-10 الأجنة عادة ما تعطي ~ 200 ميكروغرام مجموع الحمض النووي الريبي.

4. تحلل الخلية

1. في يوم تشريح الأنسجة، وإعداد العازلة تحلل الخلايا الطازجة كما هو موضح في الجدول 2.

حل	التركيز النهائي	حجم
تريس-HCl (pH 7.5)	20 مليون متر	100 ميكرولتر
KCl	100 مليون متر	250 ميكرولتر
مجمكل2	5 مليون متر	25 ميكرولتر
تريتون X-100	1٪ (v/v)	500 ميكرولتر
ديوكسيكولات الصوديوم	0.5٪ (ث/5)	500 ميكرولتر
ديثيوثيريتول (DTT)	1 مليون متر	5 ميكرولتر
سيكلوهيكسميد	100 ميكروغرام/مل	5 ميكرولتر
RNase المياه الحرة		أعلى حتى 5 مل
مجموع	5 مل	5 مل

الجدول 2: إعداد العازلة تحلل متعدد.

ملاحظة: ملحق تحلل العازلة مع مثبطات البروتيز والفوسفاتاز.

2. إضافة سيكلوهيكسيميد إلى الوسط العصبي مع الأنسجة تشريح إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. Cycloheximide كتل استطالة الترجمة، وبالتالي، يمنع ريبوسوم الجريان ¹⁵.
3. جهاز الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
4. غسل الأنسجة مرتين مع الجليد الباردة الفوسفات العازلة المالحة (PBS) تكملها مع 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد.
5. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية تكملها مع 4 ميكرولتر من مثبط RNase. ماصة صعودا وهبوطا لإعادة إنفاق الأنسجة في عازلة تحلل. استخدم إبرة الأنسولين لتسلي الأنسجة برفق.
6. احتضان الأنسجة على الجليد لمدة 10 دقيقة مع دوامة قصيرة كل 2-3 دقائق.
   ملاحظة: لمنع تدهور الأنسجة، تأكد من أن جميع خطوات تحلل الأنسجة تتم على الجليد.
7. جهاز طرد مركزي عند 2000 x g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد على الجليد.
9. جهاز طرد مركزي عند ~13,000 x g لمدة 5 دقائق عند 4 °C.
10. نقل supernatant إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد على الجليد.
11. قياس تركيز الحمض النووي الريبي في الأنسجة lysate باستخدام الطيف الأشعة فوق البنفسجية فيس.
    ملاحظة: إذا تم تضمين عينات متعددة في التجربة، قم بتخفيف العينات إلى نفس التركيز مع مخزن تحلل خلايا إضافي لتقليل التباين.

5. تحميل العينة والطرد الفائق

1. قم بالتبريد المسبق لدوار الطرد الفائق ودلاء التأرجح عند 4 درجات مئوية، وحدد درجة حرارة جهاز الطرد المركزي الفائق إلى 4 درجات مئوية.
2. الحفاظ على 20 ميكرولتر من الأنسجة lysate كما إجمالي مدخلات الحمض النووي الريبي.
3. عينات الحمل (50-300 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مع حجم متساو) على الجزء العلوي من التدرجات السكروز عن طريق الاستغناء ببطء lysate إلى جدران أنابيب الطرد المركزي للغاية.
4. ضع أنابيب الطرد الفائق برفق في دلو الأرجوحة. تأكد من أن جميع الدلاء المعاكسة تماما متوازنة.
5. تحميل دلاء سوينغ على الدوار. تعيين جهاز الطرد المركزي الفائق إلى 190،000 × ز (~ 39،000 دورة في الدقيقة) في 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
6. ضع التدرجات برفق على الثلج بعد الطرد المركزي.

6. الكسر وجمع العينات

ملاحظة: يتم استخدام نظام تجزئة وتسجيل وجمع منزلي للتحليل وجمع العينات من التدرجات(الشكل 3، راجع مكونات الجهاز).

1. ضع أنبوب طرد مركزي فارغ على مثقب الأنبوب واخترق الأنبوب برفق بواسطة الإبرة من الأسفل.
2. قم بتشغيل شاشة الأشعة فوق البنفسجية، وافتح برنامج تسجيل الإشارات الرقمية.
3. ملء حقنة 30 مل مع 25 مل من محلول مطاردة السكروز 60٪. اضغط بلطف على الحقنة بحيث يملأ محلول المطاردة الأنبوب الفارغ ويمر عبر شاشة الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر لتعيين خط الأساس للكشف.
4. اضغط على الصفر التلقائي على شاشة الأشعة فوق البنفسجية لتسجيل خط أساس للكشف. اضغط على تشغيل البرنامج لبدء التسجيل.
5. بمجرد أن يقوم النظام بإنشاء خط أساس ، أوقف التسجيل مؤقتا على البرنامج وتراجع عن حل المطاردة. تأكد من عدم بقاء أي حل مطاردة متبقية في النظام.
   ملاحظة: شطف النظام مع المياه الخالية من RNase لإزالة حلول السكروز المتبقية المتبقية من المدى السابق.
6. تحميل أنبوب عينة واحدة إلى أنبوب مثقب. تخترق بلطف أنبوب مع الإبرة من أسفل.
7. بدء التسجيل على البرنامج. بدء ضخ حقنة (معدل تدفق 1 مل / دقيقة لحجم 25 مل) وجامع الكسور لجمع كسور متعددة. تعيين إعدادات الكسر إلى 30 s.
   ملاحظة: قبل كل تشغيل، تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة أو الأنابيب عن طريق الضغط بلطف على الحقنة للسماح للحل مطاردة تدفق مستمر من خلال الإبرة.
8. جمع الكسور في أنابيب 1.5 مل (500 ميكرولتر لكل منهما) باستخدام جامع الكسور.
9. يمكن معالجة الكسور فورا أو تخزينها عند -80 درجة مئوية.
10. بعد جمع الكسور، شطف النظام مع المياه الخالية من RNase لإزالة أي السكروز المتبقية.

7. استخراج الحمض النووي الريبي

1. لكل كسر، إضافة 10 نانوغرام من لوسيفيراز مرنا ارتفاع في السيطرة.
2. إضافة ثلاثة مجلدات من guanidium هيدروكولريد القائم على وكيل العزل الحمض النووي الريبي التجارية لكل كسر.
3. دوامة لفترة وجيزة لمدة 15 s.
4. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي متوافقة مع الحل المستخدم في 7.2.

8. النسخ العكسي وPCR في الوقت الحقيقي

1. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيف.
2. موضوع الجيش الملكي النيبالي لعكس النسخ باستخدام مجموعة توليف cDNA، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
3. استخدم PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qPCR) لفحص التوزيع المتعدد الصبغات ل gapdh mRNA كمثال. تم إجراء qPCR باستخدام نظام الكشف qPCR وكواشف qPCR mastermix، مع ظروف ركوب الدراجات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، 72 درجة مئوية لمدة 40 s، تليها 95 درجة مئوية لمدة 60 s.
4. الحصول على قيم دورة العتبة (Ct) من مخططات التضخيم واستخدامها لحساب تغيير الطي باستخدام أسلوب ΔΔCt.

9. السكروز التدرج جعل تجميع النظام

ملاحظة: اتبع الخطوات لتجميع كل مكون (كما هو موضح في الجدول 3)من صانع التدرج السكروز (الشكل 1).

1. قم بتركيب قوسين عموديين (A2) على لوحة الخبز الأساسية (A1).
2. استخدم قوسين نحيفين من الزاوية اليمنى (B2) لتركيب مشغل المرحلة الخطية إلى لوحة الخبز الأساسية (A1).
3. استخدم أطقم الأقراص على وظيفة الألومنيوم Ø12.7 مم (C2) لإصلاحه على لوحة الخبز الأساسية لحامل الأنبوب (C1) كموقف لحامل الأنبوب.
4. تجميع الزاوية اليمنى Ø1/2 "إلى Ø6 مم آخر المشبك (C3) مع آخر (C2) ووظيفة بصرية مصغرة سلسلة (C4).
5. استخدم جهاز الأطقم على الوظيفة البصرية (C4) لتوصيل مشبك V صغير (C5) كحامل أنبوب.
6. وضع أنبوب الطرد المركزي في حامل أنبوب وضبط زاوية لجعله عمودي. وضع علامة على موضع الأنبوب وتركيب حامل وظيفة قاعدة التمثال (C6) على لوحة الخبز الأساسية (C1) لدعم الأنبوب.
7. على الجانب الآخر من لوح الخبز (A1)، استخدم طاقم المجموعة من منشور الألومنيوم Ø12.7 مم (D1) لإصلاحه وتوصيل منشور بصري قصير السلسلة (D3) باستخدام Ø1/2 الزاوية اليمنى إلى مشبك آخر Ø6 مم (D2).
8. قم بتوصيل المشبك الخامس المصغر (D4) بإبرة حادة (D5) بالمرحلة اللاحقة (D3). ضبط زاوية المشبك لتعيين الإبرة العمودية، وضبط طول آخر لضمان الإبرة تجتمع أنبوب الطرد المركزي.
9. قم بتوصيل المحرك (B1) بمحرك السائر (E1) واستخدم لوحة تحكم UNO R3 ووحدة عصا التحكم من مجموعة أدوات بدء UNO (E2) للتحكم في المحرك. يمكن استخدام محول الطاقة (على سبيل المثال، محول طاقة قابل للتعديل 9-24 فولت AC/DC) لقيادة المحرك بشكل منفصل.
10. ضع مضخة الحقنة (F) بجوار محطة صنع التدرج وربط الحقنة بالإبرة.
11. التحكم في مرحلة حامل أنبوب صعودا وهبوطا باستخدام عصا التحكم.

مكون	بند
B1	مشغل المرحلة الخطية
E1	سائق سيارة السائر
E2	UNO مشروع سوبر بداية عدة
A1	لوح الخبز
A2	قوس عمودي
B2	قوس زاوية أيمن نحيف
C1	لوحة خبز مصغرة
C5	صغير V-المشبك
D4	مصغرة V-المشبك
C2	Ø12.7 مم الألومنيوم آخر
C4، D3	مصغرة سلسلة البصرية وظيفة
D1	Ø12.7 مم الألومنيوم آخر
C3، D2	الزاوية اليمنى Ø1/2 " إلى Ø6 مم آخر المشبك
C6	قاعدة حامل وظيفة قاعدة التمثال سلسلة مصغرة
D5	إبرة نهاية حادة
و	مضخة حقنة

الجدول 3: التدرج في صنع مكونات النظام.

10. تجزئة وكشف تجميع النظام (الشكل 2).

1. استخدام الفك المستدير العادية burette المشبك لتركيب وحدة البصريات من شاشة الأشعة فوق البنفسجية على أنبوب مثقب. إرفاق نهاية واحدة من الأنابيب (1 سم طويلة وقطرها الداخلي 0.56 ملم) إلى الرابط من مثقب أنبوب والطرف الآخر إلى السائل في ميناء وحدة البصريات. قم بتوصيل منفذ Fluid Out بالكسر.
2. قم بتوصيل وحدة البصريات مع وحدة التحكم في شاشة الأشعة فوق البنفسجية وفقا لدليل الشركة المصنعة.
3. استخدم كابل اختراق لتوصيل مأخذ إخراج الإشارة بالمحول الرقمي على الأرض واتصالات الإدخال التناظرية، وفقا لدليل الشركة المصنعة.
4. قم بتوصيل المحول الرقمي بجهاز كمبيوتر محمول باستخدام كابل USB عادي، وسجل الإشارات الرقمية المحولة باستخدام برنامج الحصول على البيانات.

النتائج

كمظاهرة، تم فصل الليزات القشرية التي تحتوي على 75 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (مجمعة من 8 أجنة) عن طريق تدرج السكروز إلى 12 كسرا. قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر حددت الكسور التي تحتوي على وحدة فرعية 40S، وحدة فرعية 60S، 80S أحادية والبوليسومات(الشكل 4A). تحليل الك...

Discussion

التنميط المتعدد هو تقنية شائعة الاستخدام وقوية لتقييم الحالة الترجمية في كل من الجينات الفردية ومستويات الجينوم على نطاق^14. في هذا التقرير، نقدم بروتوكولا للتنميط المتعدد باستخدام منصة تجميعها في المنزل وتطبيقها لتحليل قشرة الماوس النامية. هذه المنصة الفعالة من حيث التكلفة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M