Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Zusammenfassung

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Zusammenfassung

Die richtige Entwicklung des Säugetiergehirns beruht auf einem feinen Gleichgewicht der proliferation neuronaler Stammzellen und der Differenzierung in verschiedene neuronale Zelltypen. Dieses Gleichgewicht wird streng durch genexpression kontrolliert, die auf mehreren Ebenen fein abgestimmt ist, einschließlich Transkription, Posttranskription und Übersetzung. In dieser Hinsicht unterstreicht eine wachsende Zahl von Beweisen eine entscheidende Rolle der translationalen Regulierung bei der Koordinierung von Entscheidungen über das Schicksal neuronaler Stammzellen. Polysome Fractionation ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des mRNA-Translationalstatus sowohl auf globaler als auch auf individueller Genebene. Hier stellen wir eine hauseigene Polysomen-Profiling-Pipeline vor, um die Translationseffizienz in Zellen aus der sich entwickelnden Mausgroßrinde zu bewerten. Wir beschreiben die Protokolle zur Saccharosegradientenvorbereitung, Gewebelyse, Ultrazentrifugation und Fraktionierungs-basierte Analyse des mRNA-Translationalstatus.

Einleitung

Während der Entwicklung des Säugetierhirns vermehren sich neuronale Stammzellen und differenzieren sich, um Neuronen und Glia^1,2 zu erzeugen. Die Störung dieses Prozesses kann zu Veränderungen in der Gehirnstruktur und -funktion führen, wie in vielen neuroentwicklungsbedingten Störungen^{gesehen 3,4}. Das richtige Verhalten neuronaler Stammzellen erfordert die orchestrierte Expression spezifischer Gene⁵. Während die epigenetische und transkriptionelle Kontrolle dieser Gene intensiv untersucht wurde, deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass die Genregulation auf anderen Ebenen auch zur Koordination der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen beiträgt^6,7,8,9,10. Daher wird die Adressierung der translationalen Kontrollprogramme unser Verständnis der Mechanismen, die der Entscheidung über das Schicksal von neuronalen Stammzellen und der Entwicklung des Gehirns zugrunde liegen, erheblich voranbringen.

Drei Haupttechniken mit unterschiedlichen Stärken wurden weit verbreitet, um den Translationsstatus von mRNA zu bewerten, einschließlich Ribosom-Profiling, Übersetzen ribososome-Affinitätsreinigung (TRAP) und Polysome-Profiling. Ribosome Profiling verwendet RNA-Sequenzierung, um ribosome-geschützte mRNA-Fragmente zu bestimmen, was die globale Analyse der Anzahl und Position der Übersetzung von Ribosomen auf jedem Transkript ermöglicht, um indirekt die Translationsrate abzuleiten, indem man sie mit transkriptionsüberfluss¹¹vergleicht. TRAP nutzt epitopgemarkierte ribosomale Proteine, um ribosomgebundene mRNAs¹²zu erfassen. Da die markierten ribosomalen Proteine mit genetischen Ansätzen in bestimmten Zelltypen exprimiert werden können, ermöglicht TRAP die zelltypspezifische Analyse der Translation. Im Vergleich dazu bietet die Polysomenprofilierung, die die Saccharosedichtegradientenfraktionierung verwendet, um freie und schlecht übersetzte Portionen (leichtere Monosomen) von denen zu trennen, die aktiv durch Ribosomen (schwerere Polysomen) übersetzt werden, eine direkte Messung der Ribosomdichte auf mRNA¹³. Ein Vorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit, die Übersetzung spezifischer mRNA von Interesse sowie genomweite Translatome-Analyse¹⁴zu studieren.

In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll der Polysomenprofilierung zur Analyse der sich entwickelnden Mausgroßhirnrinde. Wir verwenden ein selbst montiertes System, um Saccharosedichtegradienten vorzubereiten und Brüche für nachgelagerte Anwendungen zu sammeln. Das hier vorgestellte Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Arten von Geweben und Organismen zu analysieren.

Protokoll

Der gesamte Gebrauch von Tieren wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary überwacht. CD1-Mäuse, die für das Experiment verwendet wurden, wurden von kommerziellen Anbietern gekauft.

1. Vorbereitung von Lösungen

HINWEIS Um den ABBAU der RNA zu verhindern, sprühen Sie die Werkbank und alle Geräte mit RNase-Dekontaminationslösung. Für das Experiment werden RNase-freie Spitzen verwendet. Alle Lösungen werden in RNase-freiem Wasser vorbereitet.

1. Cycloheximid-Stammlösung (100 mg/ml) in DMSO vorbereiten und bei -20 °C lagern.
2. 2,2 M Saccharose-Stammlösung vorbereiten, indem 75,3 g Saccharose zu RNase-freiem Wasser hinzugefügt und das Volumen auf 100 ml aufgefüllt wird (für die Gradientenvorbereitung von 16 €). Die Lösung kann bei -20 °C für eine langzeitige Lagerung gehalten werden.
3. 10x Salzlösung vorbereiten (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl₂).
4. Bereiten Sie 60% (w/v) Saccharose-Jagdlösung vor, die 30 g Saccharose, 5 ml 10x Salzlösung enthält und das Volumen bis zu 50 ml mit RNase-freiem Wasser aufstocken kann.
5. Optional fügen Sie der Chase-Lösung einen Fleck Bromphenolblau oder ca. 5 l Bromphenolblau in RNase-freiem Wasser hinzu. 1.6. Lösungen bei 4 °C lagern.

2. Herstellung des Saccharosegradienten

HINWEIS: Die Genauigkeit bei der Herstellung von Saccharosegradienten ist entscheidend, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.

1. Zur Herstellung von sechs 10-50% Saccharosegradienten 2,2 Mio. Saccharoselösung wie in Tabelle 1verdünnen.

Saccharoselösung	10%	20%	30%	40%	50%
2.2 M Saccharose	2 mL	4 ml	6 ml	8 mL	10 ml
10X Salzlösung	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml
Cycloheximid	15 l	15 l	15 l	15 l	15 l
Wasser	11,5 ml	9,5 ml	7,5 ml	5,5 ml	3,5 ml
Gesamtvolumen	15 ml	15 ml	15 ml	15 ml	15 ml

Tabelle 1: Saccharoseverdünnungen zur Zubereitung von Saccharosegradienten.

HINWEIS: Bereiten Sie immer Saccharosegradienten in Vielfachen von zwei vor, um das Gewicht während der Ultrazentrifugation auszugleichen.

2. Wischen Sie die metallstumpfe Endnadel mit RNase Dekontaminationslösung ab. Spülen Sie die Ultrazentrifugenrohre, Schläuche und die Spritze kurz mit RNase-freiem Wasser ab. Die Rohre werden so lufttrocken, dass kein Wassertropfen in den Rohren verbleibt, da jedes verbleibende Wasser die Saccharosekonzentration verändert.
3. Legen Sie die Metallnadel auf den Klemmhalter und das Zentrifugenrohr auf die motorisierte Bühne. Um Gradienten konsistent vorzubereiten, wurde ein selbstgebautes System verwendet, das eine motorisierte Stufe enthält, um das Ultrazentrifugenrohr und eine Spritzenpumpe zur Injektion von Saccharoselösungen zu halten(Abbildung 1, siehe Schritt 9 für Details).
4. Füllen Sie eine 30 ml Spritze mit 16 ml 10% Saccharose (genug für sechs Gradienten), legen Sie sie auf die Spritzenpumpe und schließen Sie sie an die Nadel an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze, den Schläuchen und der Nadel befinden. Wischen Sie die Spitze von der Nadel ab, um eine Restlösung zu entfernen.
5. Bewegen Sie die motorisierte Bühne so nach oben, dass die Spitze der Nadel die Mitte des Rohres an der Unterseite berührt.
6. Stellen Sie die Spritzenpumpe bei einem Durchfluss von 2 ml/min für ein Volumen von 2,3 ml ein.
7. Nach abgabe 2,3 ml 10% Saccharoselösung, bewegen Sie die motorisierte Stufe nach unten und wiederholen Sie den Prozess für alle sechs Steigungen.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.7, um 20% Saccharoselösung an den Boden der Rohre hinzuzufügen, gefolgt von 30%, 40% und 50% Saccharoselösungen in ähnlicher Weise.
9. Nach der Vorbereitung des Farbverlaufs das Ultrazentrifugenrohr mit einem Paraffinfilm versiegeln.
10. Lassen Sie die Rohre über Nacht bei 4 °C so, dass die verschiedenen Saccharoseschichten zusammen diffundieren, um einen kontinuierlichen Gradienten zu erhalten.

3. Gewebesektion

HINWEIS: Schwangere Mäuse wurden durch zervikale Dislokation vor anästhesien mit 5% Isofluran eingeschläfert.

1. Sammeln Sie CD1-Maus-Embryonen am embryonalen Tag 12 oder andere Zeitpunkte nach Bedarf, und legen Sie Embryonen in eine Platte mit einem Durchmesser von 10 cm, die eiskalte Hankes Balanced Salt Solution (HBSS) enthält, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.
2. Übertragen Sie im Sezierbereich einen Embryo auf eine Platte von 6 cm, die eiskalte HBSS enthält.
3. Verwenden Sie 21-23 G Nadeln, um die Position des Kopfes zu fixieren, indem Sie durch die Augen in einem etwa 45°-Winkel eindringen und Kraft anwenden, um sicherzustellen, dass die Nadeln auf der Platte befestigt sind (Abbildung 2A).
4. Verwenden Sie No.5 Zangen, um Haut und Schädel von der Mitte bis zu den Seiten zu entfernen.
5. Verwenden Sie Zangen, um die olfaktorischen Glühbirnen zu schneiden und die Hirnungzuschläge zu entfernen, um die kortikalen Gewebe freizulegen.3.6.Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das kortikale Gewebe in 2-3 ml neurobasales Medium auf Eis zu schneiden (Abbildung 2B). Pool kortikale Gewebe aus verschiedenen Embryonen nach Bedarf. Gewebe von 8-10 Embryonen geben in der Regel eine Gesamt-RNA von 200 g.

4. Zelllyse

1. Am Tag der Gewebesektion den Frischzelllysepuffer vorbereiten, wie in Tabelle 2beschrieben.

Lösung	Endgültige Konzentration	Volumen
Tris-HCl (pH 7.5)	20 mM	100 l
Kcl	100 mM	250 l
MgCl2	5 mM	25 l
Triton X-100	1% (v/v)	500 l
Natriumdesoxycholat	0,5% (mit/v)	500 l
Dithiothreitol (DTT)	1 mM	5 l
Cycloheximid	100 g/ml	5 l
RNase freies Wasser		Aufladen bis zu 5 ml
gesamt	5 mL	5 mL

Tabelle 2: Herstellung des Polysomenlysepuffers.

HINWEIS: SupplementLyse Puffer mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren.

2. Cycloheximid dem neurobasalen Medium mit seziertem Gewebe zu einer Endkonzentration von 100 g/ml hinzufügen und 10 min bei 37 °C inkubieren. Cycloheximid blockiert die Translationsdehnung und verhindert somit ribosomen Ablauf ¹⁵.
3. Zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
4. Waschen Sie das Gewebe zweimal mit eiskaltem Phosphat-gepufferter Saline (PBS), ergänzt mit 100 g/ml Cycloheximid.
5. Fügen Sie 500 L Zelllysepuffer hinzu, ergänzt durch 4 L RNase-Inhibitor. Pipette nach oben und unten, um das Gewebe im Lysepuffer wieder auszusetzen. Verwenden Sie eine Insulinnadel, um das Gewebe sanft zu lysieren.
6. Inkubieren Sie das Gewebe auf Eis für 10 min mit kurzen Wirbeln alle 2-3 min.
   HINWEIS: Um einen Gewebeabbau zu verhindern, stellen Sie sicher, dass alle Schritte der Gewebelyse auf Eis durchgeführt werden.
7. Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C.
8. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr auf Eis.
9. Zentrifuge bei 13.000 x g für 5 min bei 4 °C.
10. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr auf Eis.
11. Messen Sie die RNA-Konzentration im Gewebelysat mit einem UV-Vis-Spektrophotometer.
    HINWEIS: Wenn mehrere Proben in das Experiment einbezogen sind, verdünnen Sie Proben auf die gleiche Konzentration mit zusätzlichem Zelllysepuffer, um Variationen zu minimieren.

5. Probenbeladung und Ultrazentrifugation

1. Den Ultrazentrifugationsrotor und die Schwenkschaufeln auf 4 °C vorkühlen und die Temperatur der Ultrazentrifuge auf 4 °C einstellen.
2. Halten Sie 20 l des Gewebelysats als Gesamt-RNA-Eingang.
3. Laden Sie Proben (50-300 g RNA mit gleichem Volumen) auf die Oberseite der Saccharosegradienten, indem Sie das Lysat langsam an die Wände der Ultrazentrifugenrohre abgeben.
4. Legen Sie die Ultrazentrifugenrohre vorsichtig in den Schwenkeimer. Stellen Sie sicher, dass alle diametral gegenüberliegenden Buckets ausgeglichen sind.
5. Laden Sie die Schwenkschaufeln auf den Rotor. Stellen Sie die Ultrazentrifuge 90 min auf 190.000 x g (39.000 U/min) bei 4 °C.
6. Legen Sie die Steigungen nach der Zentrifugation vorsichtig auf Eis.

6. Fraktionierung und Probensammlung

HINWEIS: Für die Analyse und das Sammeln von Proben aus den Gradienten wird ein selbst gebautes Fraktionierungs-, Aufzeichnungs- und Sammelsystem verwendet(Abbildung 3, siehe Gerätekomponenten).

1. Legen Sie ein leeres Ultrazentrifugenrohr auf den Rohrpiercer und dringen Sie vorsichtig mit der Nadel von unten in das Rohr ein.
2. Schalten Sie den UV-Monitor ein, und öffnen Sie die digitale Signalaufzeichnungssoftware.
3. Füllen Sie eine 30 ml Spritze mit 25 ml 60% Saccharose-Chase-Lösung. Drücken Sie die Spritze vorsichtig so, dass die Chase-Lösung das leere Rohr auffüllt und durch den 254 nm UV-Monitor geht, um die Basis für die Erkennung festzulegen.
4. Drücken Sie auf dem UV-Monitor auf Auto-Null, um eine Baseline für die Erkennung zu registrieren. Drücken Sie die Wiedergabe auf der Software, um mit der Aufnahme zu beginnen.
5. Sobald das System eine Baseline erstellt hat, halten Sie die Aufzeichnung auf der Software an und ziehen Sie die Chase-Lösung zurück. Stellen Sie sicher, dass keine Restverfolgungslösung im System verbleibt.
   HINWEIS: Spülen Sie das System mit RNase-freiem Wasser, um Rest-Saccharose-Lösungen zu entfernen, die vom vorherigen Lauf übrig geblieben sind.
6. Laden Sie ein Probenrohr auf den Rohrpiercer. Eindringen Sie vorsichtig mit der Nadel von unten in das Rohr.
7. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung auf der Software. Starten Sie die Spritzenpumpe (Durchfluss von 1 ml/min bei einem Volumen von 25 ml) und den Bruchkollektor, um Polysomenfraktionen zu sammeln. Legen Sie die Fractionator-Einstellungen auf 30 s fest.
   HINWEIS: Stellen Sie vor jedem Lauf keine Luftblasen in der Spritze oder dem Schlauch sicher, indem Sie die Spritze vorsichtig drücken, damit die Chase-Lösung kontinuierlich durch die Nadel fließt.
8. Sammeln Sie die Fraktionen in 1,5 ml-Rohre (jeweils 500 l) mit einem Fraktionskollektor.
9. Die Fraktionen können sofort verarbeitet oder bei -80 °C gelagert werden.
10. Nach der Bruchaufnahme das System mit RNase-freiem Wasser abspülen, um restliche Saccharose zu entfernen.

7. Extraktion von RNA

1. Zu jeder Fraktion, fügen Sie 10 ng Luziferase mRNA Spike-in-Kontrolle.
2. Fügen Sie drei Bände Guanidiumhydrocholrid-basiertes kommerzielles RNA-Isolationsreagenz zu jeder Fraktion hinzu.
3. Wirbel kurz für 15 s.
4. Extrahieren Sie RNA mit einem RNA-Extraktionskit, das mit der in 7.2 verwendeten Lösung kompatibel ist.

8. Reverse Transkription und Echtzeit-PCR

1. Messen Sie die Konzentration der RNA mit dem UV-Vis Spektralphotometer.
2. Die RNA wird gemäß dem Herstellerprotokoll mit einem cDNA-Synthesekit einer umgekehrten Transkription unterzogen.
3. Verwenden Sie quantitative Echtzeit-PCR (qPCR), um die polysomale Verteilung von gapdh mRNA als Beispiel zu untersuchen. qPCR wurde mit einem qPCR-Erkennungssystem und einem qPCR-Mastermix-Reagenz mit folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 95 °C für 10 min, dann 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 40 s, gefolgt von 95 °C für 60 s.
4. Abrufen von Schwellenwertzykluswerten (Ct) aus den Amplifikationsdiagrammen und zur Berechnung der Falzänderung mit der Methode "Ct".

9. Saccharose Gradientenherstellung Systemmontage

ANMERKUNG: Führen Sie die Schritte aus, um jede Komponente (wie in Tabelle 3beschrieben) des Saccharosegradientenherstellers(Abbildung 1) zusammenzusetzen.

1. Montieren Sie zwei vertikale Halterungen (A2) auf der Basis-Brotplatte (A1).
2. Verwenden Sie zwei schlanke, rechtwinklige Halterungen (B2), um den linearen Stufenantrieb an der Basis-Breadboard (A1) zu montieren.
3. Befestigen Sie ihn mit der Setschraube am Aluminiumpfosten (C2) mit 12,7 mm, um sie als Ständer für den Rohrhalter auf dem Rohrhalter basistisch zu befestigen.
4. Montieren Sie den rechten Winkel von 1,5" auf 6 mm Pfostenklemme (C3) mit dem Pfosten (C2) und dem optischen Pfosten der Mini-Serie (C4).
5. Verwenden Sie die Setschraube am optischen Pfosten (C4), um eine kleine V-Klemme (C5) als Rohrhalter zu verbinden.
6. Legen Sie ein Zentrifugenrohr in den Rohrhalter und passen Sie den Winkel an, um es vertikal zu machen. Markieren Sie die Position des Rohres und montieren Sie den Sockelpfostenhalter (C6) auf dem Basis-Breadboard (C1), um das Rohr zu stützen.
7. Auf der anderen Seite des Steckbretts (A1) befestigen Sie ihn mit der Setschraube des 12,7 mm Aluminiumpfostens (D1) und verbinden Sie einen optischen Pfosten der Mini-Serie (D3) mit einer rechtwinkligen Pfostenklemme (D2).
8. Schließen Sie die Miniatur-V-Klemme (D4) mit stumpfer Endnadel (D5) an den Pfosten (D3) an. Passen Sie den Winkel der Klemme an, um die Nadel vertikal einzustellen, und passen Sie die Länge der Post an, um sicherzustellen, dass die Nadel dem Zentrifugenrohr entspricht.
9. Schließen Sie den Aktuator (B1) an den Schrittmotortreiber (E1) an und verwenden Sie die UNO R3 Controller Platine und das Joystick-Modul aus dem UNO Starter kit (E2), um den Aktuator zu steuern. Ein Netzadapter (z.B. 9-24 V AC/DC einstellbarer Netzadapter) kann verwendet werden, um den Motor separat anzutreiben.
10. Stellen Sie die Spritzenpumpe (F) neben die Gradientenherstellungsstation und schließen Sie die Spritze mit der Nadel an.
11. Steuern Sie die Rohrhalterstufe nach oben und unten mit dem Joystick.

Komponente	Artikel
B1	Linearer Stufenantrieb
E1	Stepper-Motortreiber
E2	UNO-Projekt Super Starter Kit
A1	Steckbrett
A2	Vertikale Halterung
B2	Schlanke rechtwinklige Halterung
C1	Mini-Serie Brotbrett
C5	Kleine V-Klemme
D4	Miniatur-V-Klemme
C2	12,7 mm Aluminiumpfosten
C4, D3	Optischer Pfosten der Mini-Serie
D1	12,7 mm Aluminiumpfosten
C3, D2	Rechtwinklige Pfostenklemme mit einer Postklemme von 1,5 mm bis 6 mm
C6	Sockelhalter basisder Sockelhalter der Mini-Serie
D5	Blunt-Endnadel
F	Spritzenpumpe

Tabelle 3: Gradientenherstellung von Systemkomponenten.

10. Fraktionierung und Erkennung der Systembaugruppe (Abbildung 2).

1. Verwenden Sie eine normale Rundbacken-Burette-Klemme, um das Optikmodul des UV-Monitors am Rohrpiercer zu montieren. Befestigen Sie ein Ende des Schlauches (1 cm lang und 0,56 mm Innendurchmesser) am Anschluss des Rohrpiercers und das andere Ende am Fluid-In-Anschluss des Optikmoduls. Schließen Sie den Fluid Out-Anschluss an den Fraktionator an.
2. Schließen Sie das Optikmodul mit der Steuereinheit des UV-Monitors gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers an.
3. Verwenden Sie ein Breakout-Kabel, um die Signalausgangsbuchse mit dem Digitalwandler am Boden und analogen Eingangsanschlüssen zu verbinden, so das Herstellerhandbuch.
4. Schließen Sie den Digitalkonverter über ein normales USB-Kabel an einen Laptop an und zeichnen Sie die konvertierten digitalen Signale mithilfe der Datenerfassungssoftware auf.

Ergebnisse

Als Demonstration wurde das kortikale Lysat, das 75 g RNA (gepoolt aus 8 Embryonen) enthält, durch den Saccharosegradienten in 12 Fraktionen getrennt. Spitzen der UV-Absorption bei 254 nm identifizierten Fraktionen, die die 40S-Untereinheit, 60S-Untereinheit, 80S-Monosomen und Polysomen enthalten (Abbildung 4A). Die Analyse der Fraktionen nach Western Blot für die große ribosomale Untereinheit randalierte Rpl10 in der 60S-Untereinheit (Fraktion 3), Monosomen (Fraktion 4) und Polysomen (Fr...

Diskussion

Polysome Profiling ist eine häufig verwendete und leistungsfähige Technik, um den Translationsstatus sowohl auf einzelnen Gen- als auch auf genomweiten Ebenen¹⁴ zu bewerten. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll der Polysomenprofilierung mit einer selbst zusammengesetzten Plattform und deren Anwendung zur Analyse des sich entwickelnden Mauskortex vor. Diese kostengünstige Plattform lässt sich einfach montieren und robuste, reproduzierbare Saccharosegradienten und Polysomenprofilierung mi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M