Анализ перевода в развивающемся мозге мыши с использованием полисомного профилирования

Резюме

Развитие мозга млекопитающих требует надлежащего контроля экспрессии генов на уровне перевода. Здесь мы описываем систему поликомного профилирования с помощью простой в сборке градиентной градиентной и фракционной платформы для оценки трансляционного состояния мРНК в развивающемся мозге.

Аннотация

Правильное развитие мозга млекопитающих опирается на тонкий баланс пролиферации нервных стволовых клеток и дифференциации на различные типы нервных клеток. Этот баланс жестко контролируется экспрессией генов, которая достроена на нескольких уровнях, включая транскрипцию, посткриптацию и перевод. В этой связи растущее количество фактических данных подчеркивает важную роль трансляционной регуляции в координации решений о судьбе нервных стволовых клеток. Полисомная фракционирование является мощным инструментом для оценки трансвеститного статуса мРНК как на глобальном, так и на индивидуальном уровне генов. Здесь мы представляем внутриутверенные полисомные профилирования трубопровода для оценки трансляционной эффективности в клетках из развивающейся коры головного мозга мыши. Мы описываем протоколы для подготовки градиента сахарозы, лиза тканей, ультрацентрифугации и дробного анализа переводного статуса мРНК.

Введение

Во время развития мозга млекопитающих, нервные стволовые клетки размножаются и дифференцируются для генерации нейронов и^{глии 1,2.} Возмущение этого процесса может привести к изменениям в структуре и функции мозга, как видно из многих расстройств нейроразвития^3,4. Правильное поведение нервных стволовых клеток требует организованного выражения конкретных генов^5. В то время как эпигенетический и транскрипционные контроль этих генов был интенсивно изучен, последние результаты показывают, что регуляции генов на других уровнях также способствует координации пролиферации^{нервных стволовых клеток и дифференциации6, 7,8,9,10}. Таким образом, решение программ трансляционного контроля значительно повысит наше понимание механизмов, лежащих в основе решения судьбы нервных стволовых клеток и развития мозга.

Три основных метода с различными сильными сторонами были широко применены для оценки трансляционного статуса мРНК, включая рибосомное профилирование, перевод очистки рибосомной сродства (TRAP) и профилирование поликомы. Рибосомное профилирование использует секвенирование РНК для определения защищенных рибосомой фрагментов мРНК, что позволяет глобальному анализу количества и местонахождения перевода рибосом на каждой стенограмме косвенно сделать вывод о скорости перевода, сравнив его с изобилием^{стенограммы 11}. TRAP использует рибосомальные белки с эпитопом, помеченными эпитопом, для захвата рибосомно-связанных мРНК^12. Учитывая, что помеченные рибосомные белки могут быть выражены в конкретных типах клеток с использованием генетических подходов, TRAP позволяет анализ перевода в клеточном типе конкретных образом. Для сравнения, поликомное профилирование, которое использует градиентную фракциацию плотности сахарозы для отделить свободную и плохо переведенную часть (легкие моносомы) от тех, которые активно переводятся рибосомами (более тяжелыми полисомами), обеспечивает прямое измерение плотности рибосомы на мРНК^13. Одним из преимуществ этого метода является его универсальность для изучения перевода конкретных мРНК, представляющих интерес, а также генома всей перевод анализа¹⁴.

В этой статье мы описываем подробный протокол полисомного профилирования для анализа развивающейся коры головного мозга мыши. Мы используем домоборную систему для подготовки градиентов плотности сахарозы и сбора фракций для нисходящих приложений. Представленный здесь протокол можно легко адаптировать для анализа других типов тканей и организмов.

протокол

Все виды использования животных контролировались Комитетом по уходу за животными в Университете Калгари. Мыши CD1, используемые для эксперимента, были приобретены у коммерческого поставщика.

1. Подготовка решений

ПРИМЕЧАНИЕ Для предотвращения деградации РНК, спрей рабочая скамья и все оборудование с RNase обеззараживание раствора. Для эксперимента используются советы без RNase. Все решения готовятся в воде без RNase.

1. Подготовка циклохэксимида фондовый раствор (100 мг/мл) в DMSO и хранить при -20 градусов по Цельсию.
2. Приготовьте раствор для запаса сахарозы 2,2 М, добавив 75,3 г сахарозы в воду без RNase и долива объема до 100 мл (для подготовки градиента No16). Раствор можно хранить при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения.
3. Приготовить 10-х соляной раствор (1 М НаКл; 200 мМ Трис-ХКл, рН 7,5; 50 мМ_{МгКл 2).}
4. Приготовьте 60% (w/v) раствор для погони сахарозы, содержащий 30 г сахарозы, 5 мл 10-х соленого раствора и доверху до 50 мл с безсолевой водой без RNase.
5. По желанию, добавить пятнышко бромофено-голубой или примерно 5 йл 1% бромофено-голубой в RNase свободной воды в погоню решения. 1.6. Храните растворы при 4 градусах Цельсия.

2. Подготовка градиента сахарозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Точность в подготовке градиентов сахарозы имеет решающее значение для получения последовательных и воспроизводимых результатов.

1. Чтобы подготовить шесть градиентов сахарозы 10-50%, разбавьте раствор сахарозы 2,2 М, как в таблице 1.

Раствор сахарозы	10%	20%	30%	40%	50%
2.2 M сахароза	2 мл	4 мл	6 мл	8 мл	10 мл
10X солевой раствор	1,5 мл	1,5 мл	1,5 мл	1,5 мл	1,5 мл
Циклохексимид	15 йл	15 йл	15 йл	15 йл	15 йл
Вода	11,5 мл	9,5 мл	7,5 мл	5,5 мл	3,5 мл
Общий объем	15 мл	15 мл	15 мл	15 мл	15 мл

Таблица 1: Разбавления сахарозы для препаратов градиентов сахарозы.

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда подготовьте градиенты сахарозы в кратных по два, чтобы сбалансировать вес во время ультрацентрифугации.

2. Протрите металлическую тупую иглу с помощью раствора обеззараживания RNase. Кратко промойте ультрацентрифуговые трубки, трубки и шприц, используя воду без RNase. Воздух-сухие трубки так, что не капля воды остается в трубах, как и любая оставшаяся вода изменит концентрацию сахарозы.
3. Поместите металлическую иглу на держатель зажима и центрифугу на моторизованной сцене. Для последовательной подготовки градиентов использовалась система домашней сборки, которая содержит моторизованную сцену для удержания ультрацентрифугной трубки и шприц-насоса для впрыскива растворов сахарозы(рисунок 1, см. шаг 9 для деталей).
4. Заполните шприц 30 мл с 16 мл 10% сахарозы (достаточно для шести градиентов), поместите его на шприц насоса и подключить его к игле. Убедитесь, что в шприце, трубке и игле нет пузырьков воздуха. Протрите кончик с иглы, чтобы удалить любой остаточный раствор.
5. Перемести моторизованную сцену так, чтобы кончик иглы касался центра трубки внизу.
6. Установите шприц-насос со скоростью потока 2 мл/мин при объеме 2,3 мл.
7. После дозирования 2,3 мл 10% раствора сахарозы, двигаться вниз моторизованной стадии и повторить процесс для всех шести градиентов.
8. Повторите шаги 2.4-2.7, чтобы добавить 20% раствор сахарозы в нижней части труб, а затем 30%, 40% и 50% сахарозы решений аналогичным образом.
9. После подготовки градиента, печать ультрацентрифуг трубки с помощью парафиновой пленки.
10. Оставьте трубки на ночь при 4 градусов по Цельсию, чтобы различные слои сахарозы рассеиваются вместе, чтобы дать непрерывный градиент.

3. Вскрытие тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Беременные мыши были усыпляются шейки матки дислокации предшествовала анестезия с 5% изофлюран.

1. Соберите эмбрионы мыши CD1 в эмбриональный день 12, или другие точки времени по мере необходимости, и поместите эмбрионы в пластину 10 см, содержащую ледяной Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) на льду, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.
2. Под прицелом вскрытия перенесите один эмбрион на пластину длиной 6 см, содержащую ледяной HBSS.
3. Используйте 21-23 G иглы, чтобы исправить положение головы, проникая через глаза под углом примерно 45 "и применить силу, чтобы убедиться, что иглы фиксируются на пластине(рисунок 2A).
4. Используйте No 5 типсы для удаления кожи и черепа, от середины до сторон.
5. Используйте типсы, чтобы сократить обонятельные луковицы и удалить осинки подвергать корковых тканей.3.6.Использование изогнутых типсов, чтобы сократить корковых тканей на 2-3 мл нервно-пластовой среды нальду (рисунок 2B). Бассейн корковых тканей из разных эмбрионов по мере необходимости. Ткани из 8-10 эмбрионов обычно дают 200 мкг общей РНК.

4. Клеточныйлиз

1. В день вскрытия тканей приготовьте буфер свежего клеточного лиза, как описано в таблице 2.

решение	Окончательная концентрация	том
Трис-HCl (рН 7,5)	20 мМ	100 йл
KCl	100 мМ	250 йл
MgCl2	5 мМ	25 йл
Тритон X-100	1% (v/v)	500 йл
Дезоксихолат натрия	0,5% (w/v)	500 йл
Дитиотрейтол (DTT)	1 мМ	5 йл
Циклохексимид	100 мкг/мл	5 йл
RNase бесплатная вода		До 5 мл
итог	5 мл	5 мл

Таблица 2: Подготовка полисомного лиза буфера.

ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнение буфера лиза с ингибиторами протеазы и фосфатазы.

2. Добавьте циклохексимид в нейробазную среду с расчлененными тканями до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 10 мин. Циклохексимид блокирует удлинение перевода и, следовательно, предотвращает рибосомный ^{15-й запуск.}
3. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант.
4. Вымойте ткани дважды с ледяной фосфат-буферный солевой раствор (PBS) дополняется 100 мкг / мл циклохексимида.
5. Добавьте 500 МКЛ буфера клеточного лиза, дополненного 4 МКЛ ингибитора RNase. Пипетт вверх и вниз, чтобы повторно использовать ткани в буфере лиза. Используйте инсулиновую иглу, чтобы аккуратно подставить ткань.
6. Инкубировать ткани на льду в течение 10 минут с кратким вихрем каждые 2-3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения деградации тканей, убедитесь, что все шаги лиза тканей проводятся на льду.
7. Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
8. Перенесите супернатант в новую центрифугу на льду.
9. Центрифуга при 13 000 евро х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
10. Перенесите супернатант в новую центрифугу на льду.
11. Измерьте концентрацию РНК в лиссате ткани с помощью спектрофотометра UV-Vis.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперимент включено несколько образцов, разбавьте образцы в ту же концентрацию с дополнительным буфером лиза клеток, чтобы свести к минимуму вариации.

5. Примерная загрузка и ультрацентрифугация

1. Предварительно охладить ультрацентрифугированный ротор и качели на 4 градусов по Цельсию, и установить температуру ультрацентрифуга до 4 градусов по Цельсию.
2. Держите 20 йл ткани лизолировать в качестве общего ввода РНК.
3. Загрузите образцы (50-300 мкг РНК с равным объемом) в верхней части градиентов сахарозы, медленно распределяя лизат к стенкам ультрацентрифугных труб.
4. Аккуратно поместите ультрацентрифуговые трубки в ведро с качелями. Убедитесь, что все диаметрально противоположные ведра сбалансированы.
5. Загрузите качели ведра на ротор. Установите ультрацентрифуг до 190 000 х г (39 000 об/мин) при 4 градусах Цельсия в течение 90 мин.
6. Аккуратно поместите градиенты на лед после центрифугации.

6. Фракция и сбор образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа и сбора образцов из градиентов (рисунок3, см. Компонентыустройства) используется система домашней дробиления, записи и сбора.

1. Поместите пустую ультрацентрифугную трубку на трубчатый пирсинг и аккуратно проникните в трубку иглой со дна.
2. Включите УФ-монитор и откройте программное обеспечение для записи цифрового сигнала.
3. Заполните 30 мл шприца с 25 мл 60% раствора погони сахарозы. Аккуратно нажмите шприц так, что решение погони заполняет пустую трубку и пройти через 254 нм УФ-монитор, чтобы установить базовый уровень для обнаружения.
4. Нажмите авто-ноль на УФ-монитор, чтобы зарегистрировать базовый уровень для обнаружения. Нажмите играть на программное обеспечение, чтобы начать запись.
5. Как только система установит базовый уровень, приохтять запись на программное обеспечение и отказаться от решения погони. Убедитесь, что в системе не останется остаточного решения погони.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промыть систему с RNase свободной воды для удаления остаточной сахарозы решений, оставшихся от предыдущего запуска.
6. Загрузите одну пробоотборчатую трубку в трубчатый пирсинг. Аккуратно проникайте в трубку иглой со дна.
7. Начните запись на программное обеспечение. Запустите шприц-насос (скорость потока 1 мл/мин для объема 25 мл) и сборщик фракций для сбора полисомных фракций. Установите параметры фракциотеля до 30 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым запуском, убедитесь, что пузырьки воздуха в шприце или трубки, мягко нажав шприц, чтобы погоня решение течет непрерывно через иглу.
8. Соберите фракции в 1,5 мл труб (500 йл каждая) с помощью фракционной коллектора.
9. Фракции могут быть обработаны немедленно или хранятся при -80 градусов по Цельсию.
10. После сбора фракций, промыть систему с RNase свободной воды, чтобы удалить остатки сахарозы.

7. Извлечение РНК

1. К каждой фракции добавьте 10 нг люциферазы мРНК-контроля.
2. Добавьте три тома гидрохолрида гуанидия на основе коммерческого реагента изоляции РНК к каждой фракции.
3. Вихрь кратко для 15 s.
4. Извлекайте РНК с помощью набора для извлечения РНК, совместимого с раствором, используемым в 7.2.

8. Обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени

1. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра UV-Vis.
2. Тема РНК для обратной транскрипции с помощью комплекта синтеза cDNA, в соответствии с протоколом производителя.
3. В качестве примера используйте количественный ПЦР в реальном времени (qPCR) для изучения полисомального распределения зияющей мРНК. qPCR был выполнен с помощью системы обнаружения qPCR и реагента qPCR mastermix, со следующими условиями езды на велосипеде: 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, затем 40 циклов по 95 градусов по Цельсию для 15 с, 60 градусов по Цельсию для 30 с, 72 кк C для 40 с, а затем 95 градусов по Цельсию для 60 с.
4. Получение значений порогового цикла (Ct) на участках усиления и использование для расчета изменения складок с использованием метода «CT».

9. Сборка градиента сахарозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте шагам, чтобы собрать каждый компонент (как описано в таблице 3) градиента сахарозы(рисунок 1).

1. Гора две вертикальные скобки (A2) на базовой доске (A1).
2. Используйте два тонких правоугольных кронштейна (B2) для установки линейного привода к базовой доске (A1).
3. Используйте наборы на алюминиевом столбе 12,7 мм (C2), чтобы зафиксировать его на держатель трубки базовой доски (C1) в качестве стенда для держателя трубки.
4. Соберите правый угол No 1/2" до 6 мм после зажима (C3) с постом (C2) и мини-серии оптический пост (C4).
5. Используйте наборы на оптическом столбе (C4) для подключения небольшого V-зажима (C5) в качестве держателя трубки.
6. Положите центрифугу трубки в держатель трубки и настроить угол, чтобы сделать его вертикальным. Отметь положение трубки и смонтировать держатель поста пьедестала (C6) на базовой доске (C1) для поддержки трубки.
7. С другой стороны доски (A1) используйте наборы алюминиевого столба диаметром 12,7 мм (D1), чтобы исправить его и подключить оптический столб мини-серии (D3) с помощью правого угла No1/2" до почтового зажима диаметром 6 мм (D2).
8. Соедините миниатюрный V-clamp (D4) с тупой иглой (D5) к столбу (D3). Отрегулируйте угол зажима, чтобы установить вертикаль иглы, и отрегулируйте длину столба, чтобы игла соответствовала центрифуге трубки.
9. Подключите привод (B1) к шагеру(E1) и используйте доску контроллера UNO R3 и модуль джойстика из стартового комплекта UNO (E2) для управления приводом. Для отдельного привода двигателя можно использовать адаптер питания (например, 9-24 V AC/DC регулируемый адаптер питания).
10. Поместите шприц-насос (F) рядом со станцией изготовления градиентов и соедините шприц с иглой.
11. Управление держатель трубки этапе вверх и вниз с помощью джойстика.

компонент	пункт
B1	Линейный актуатор сцены
E1	Степпер водитель
E2	Супер стартовый комплект проекта UNO
A1	макет
A2	Вертикальная кронштейн
B2	Тонкий правый угол кронштейна
C1	Мини-серия доска
C5	Маленький V-зажим
D4	Миниатюрный V-зажим
C2	Алюминиевый столб диаметром 12,7 мм
C4, D3	Мини-серия оптический пост
D1	Алюминиевый столб диаметром 12,7 мм
C3, D2	Правый угол No1/2" до 6 мм пост зажима
C6	Мини-серия пьедестал пост держатель базы
D5	Блант конец иглы
фа	Шприц насос

Таблица 3: Градиент делает системные компоненты.

10. Фракционо-обнаружение системной сборки(рисунок 2).

1. Используйте обычный круглый зажим для зажима для зажима для установки оптики модуля УФ-монитора на трубчатом пирсинге. Прикрепите один конец трубки (1 см в длину и 0,56 мм внутреннего диаметра) к соединителю трубчатого пирсинга, а другой конец к жидкости в порту оптики модуля. Подключите порт Fluid Out к фракциотору.
2. Подключите модуль оптики к блоку управления УФ-монитора в соответствии с руководством производителя.
3. Используйте прорыв кабеля для подключения розетки выход сигнала к цифровому преобразователь на земле и аналоговых входных соединений, в соответствии с руководством производителя.
4. Подключите цифровой преобразователь к ноутбуку с помощью обычного USB-кабеля и заместите преобразованные цифровые сигналы с помощью программного обеспечения для сбора данных.

Результаты

В качестве демонстрации корковой лизат, содержащий РНК 75 мкг (с объединением из 8 эмбрионов), был разделен градиентом сахарозы на 12 фракций. Пики поглощения УФ-излучения на 254 нм определили фракции, содержащие 40S подразделение, 60S подразделение, 80S моносомы и полисомы(рисунок 4A

Обсуждение

Поликом-профилирование является широко используемым и мощным методом оценки трансляционного статуса как на одном гене, так и на уровне^{генома 14.} В этом отчете мы представляем протокол полисомного профилирования с помощью домашней платформы и ее применения для анализа раз?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M