ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

Summary

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

Abstract

ההתפתחות התקינה של מוח היונקים מסתמכת על איזון עדין של התפשטות תאי גזע עצביים ובידול לסוגי תאים עצביים שונים. איזון זה נשלט היטב על ידי ביטוי גנים כי הוא מכוון היטב ברמות מרובות, כולל שעתוק, לאחר שעתוק ותרגום. בהקשר זה, גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש תפקיד קריטי של רגולציה תרגום בתיאום החלטות גורל תאי גזע עצביים. שבר פוליזום הוא כלי רב עוצמה להערכת מצב תרגום mRNA הן ברמה הגלובלית והן ברמת הגנים האינדיבידואלית. כאן, אנו מציגים צינור פרופיל פוליזום בתוך הבית כדי להעריך יעילות תרגום בתאים מקליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו מתארים את הפרוטוקולים להכנת שיפוע סוכרוז, תמוגה לרקמות, ultracentrifugation וניתוח מבוסס שבר של מצב תרגום mRNA.

Introduction

במהלך התפתחות המוח יונקים, תאי גזע עצביים להתרבות ולהבדיל כדי ליצור נוירונים גליה^1,2 . ההפרעה של תהליך זה יכולה להוביל לשינויים במבנה המוח ובתפקוד, כפי שניתן לראות בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות^3,4. ההתנהגות הנכונה של תאי גזע עצביים דורשת ביטוי מתוזמר של גנים ספציפיים⁵. בעוד שהשליטה האפיגנטית והתעתיקית של גנים אלה נחקרה באופן אינטנסיבי, הממצאים האחרונים מצביעים על כך שוויסות גנים ברמות אחרות תורם גם לתיאום התפשטות תאי גזע עצביים ובידול^6,7,8,9,10. לפיכך, התייחסות לתוכניות הבקרה התרגומיות תקדם מאוד את הבנתנו את המנגנונים שבבסיס החלטת גורל תאי הגזע העצביים והתפתחות המוח.

שלוש טכניקות עיקריות עם עוצמות שונות יושמו באופן נרחב כדי להעריך את המצב התרגומי של mRNA, כולל פרופיל ריבוזום, תרגום טיהור זיקה ריבוזום (TRAP) ופרופיל פוליזום. פרופיל ריבוזום משתמש ברצף RNA כדי לקבוע שברי mRNA המוגנים על ידי ריבוזום, ומאפשר ניתוח גלובלי של מספר ומיקום של תרגום ריבוזומים על כל תעתיק כדי להסיק בעקיפין את שיעור התרגום על ידי השוואתו לשפע^{תעתיק 11}. TRAP מנצלת חלבונים ריבוזומליים מתויגים באפיטופ כדי ללכוד mRNAs¹²הקשורים לריבוזום . בהתחשב בכך שהחלבונים הריבוזומליים המתויגים יכולים לבוא לידי ביטוי בסוגי תאים ספציפיים באמצעות גישות גנטיות, TRAP מאפשרת ניתוח של תרגום באופן ספציפי לסוג התא. לשם השוואה, פרופיל פוליזום, המשתמש בשבר שיפוע בצפיפות סוכרוז כדי להפריד חלק חופשי ותורגם בצורה גרועה (מונוזומים קלים יותר) מאלה המתורגמים באופן פעיל על ידי ריבוזומים (פוליזומים כבדים יותר), מספק מדידה ישירה של צפיפות הריבוזום ב- mRNA¹³. יתרון אחד טכניקה זו מציעה היא צדדיות שלה ללמוד את התרגום של mRNA ספציפי של עניין, כמו גם ניתוח תרגום רחב הגנום¹⁴.

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט של פרופיל פוליזום כדי לנתח את קליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו משתמשים במערכת ביתית כדי להכין מעברי צבע של צפיפות סוכרוז ולאסוף שברים עבור יישומים במורד הזרם. הפרוטוקול המוצג כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי לנתח סוגים אחרים של רקמות ואורגניזמים.

Protocol

כל השימוש בבעלי חיים היה בפיקוח הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קלגרי. עכברי CD1 ששימשו לניסוי נרכשו מספק מסחרי.

1. הכנת פתרונות

הערה כדי למנוע השפלה RNA, לרסס שולחן עבודה וכל הציוד עם פתרון טיהור RNase. טיפים ללא RNase משמשים לניסוי. כל הפתרונות מוכנים במים נטולי RNase.

1. הכן פתרון מלאי ציקלוהקסימיד (100 מ"ג / מ"ל) ב- DMSO ולאחסן ב -20 °C (70 °F).
2. הכן פתרון מלאי סוכרוז 2.2 M על ידי הוספת 75.3 גרם של סוכרוז למים ללא RNase ומעלה את עוצמת הקול ל 100 מ"ל (להכנת שיפוע ~ 16). הפתרון יכול להישמר ב -20 °C (60 °F) לאחסון לטווח ארוך.
3. הכן 10x פתרון מלח (1 M NaCl; 200 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl₂).
4. הכן 60% (w / v) פתרון מרדף סוכרוז, המכיל 30 גרם של סוכרוז, 5 מ"ל של 10x פתרון מלח העליון את נפח עד 50 מ"ל עם מים ללא RNase.
5. באופן אופציונלי, להוסיף גרגר של כחול ברומופנול או כ 5 μL של 1% כחול ברומופנול במים ללא RNase לפתרון המרדף. 1.6. יש לאחסן פתרונות ב-4 מעלות צלזיוס.

2. הכנת שיפוע סוכרוז

הערה: דיוק בהכנת מעברי צבע סוכרוז הוא קריטי בהשגת תוצאות עקביות לשחזור.

1. כדי להכין שישה שיפוע סוכרוז 10-50%, לדלל 2.2 M פתרון סוכרוז כמו בטבלה 1.

פתרון סוכרוז	10%	20%	30%	40%	50%
2.2 מ' סוכרוז	2 מ"ל	4 מ"ל	6 מ"ל	8 מ"ל	10 מ"ל
תמיסת מלח פי 10	1.5 מ"ל	1.5 מ"ל	1.5 מ"ל	1.5 מ"ל	1.5 מ"ל
ציקלוהקסימיד	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
מים	11.5 מ"ל	9.5 מ"ל	7.5 מ"ל	5.5 מ"ל	3.5 מ"ל
נפח כולל	15 מ"ל	15 מ"ל	15 מ"ל	15 מ"ל	15 מ"ל

טבלה 1: דילול סוכרוז להכנות של שיפוע סוכרוז.

הערה: הכן תמיד מעברי צבע של סוכרוז בכפולות של שניים כדי לאזן משקל במהלך ultracentrifugation.

2. לנגב את מחט קצה קהה מתכת עם פתרון טיהור RNase. יש לשטוף בקצרה את צינורות האולטרה-סנטריפוגה, הצינור והמזרק באמצעות מים נטולי RNase. לייבש את האוויר את הצינורות כך שלא נותרה טיפת מים בצינורות כמו כל המים הנותרים ישנה את ריכוז סוכרוז.
3. מניחים את מחט המתכת על מחזיק המהדק ועל צינור הצנטריפוגה על הבמה הממונעת. להכנת מעברי צבע באופן עקבי, נעשה שימוש במערכת ביתית המכילה שלב ממונע להחזקת צינור האולטרה-סנטריפוגה ומשאבת מזרק להזרקת פתרונות סוכרוז(איור 1, ראה שלב 9 לפרטים).
4. מלא מזרק 30 מ"ל עם ~ 16 מ"ל של 10% סוכרוז (מספיק עבור שישה מעברי צבע), למקם אותו על משאבת המזרק ולחבר אותו המחט. ודא שאין בועות אוויר במזרק, בצינורות ובמחט. לנגב את הקצה את המחט כדי להסיר כל פתרון שיורית.
5. הזז את השלב הממונע למעלה כך שקצה המחט נוגע במרכז הצינור בתחתית.
6. הגדר את משאבת המזרק בקצב זרימה של 2 מ"ל / דקה עבור נפח של 2.3 מ"ל.
7. לאחר חלוקת 2.3 מ"ל של 10% פתרון סוכרוז, לרדת בשלב הממונע ולחזור על התהליך עבור כל ששת שיפוע.
8. חזור על שלבים 2.4-2.7 כדי להוסיף 20% פתרון סוכרוז לתחתית הצינורות, ואחריו 30%, 40% ו 50% פתרונות סוכרוז באופן דומה.
9. לאחר הכנת השיפוע, לאטום את הצינור ultracentrifuge באמצעות סרט פרפין.
10. השאירו את הצינורות לילה ב 4 מעלות צלזיוס, כך שכבות סוכרוז שונים להתפזר יחד כדי לתת שיפוע מתמשך.

3. ניתוח רקמות

הערה: עכברים בהריון היו מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם קדמו הרדמה עם 5% isoflurane.

1. לאסוף עוברי עכבר CD1 ביום העוברי 12, או נקודות זמן אחרות לפי הצורך, ומניחים עוברים בצלחת Ø 10 ס"מ המכילה קר כקרח האנק של מאוזן מלח פתרון (HBSS) על הקרח כדי לשמור על הכדאיות של התא.
2. תחת טווח הניתוח, להעביר עובר אחד לצלחת Ø 6 ס"מ המכיל HBSS קר כקרח.
3. השתמש במחטים של 21-23 G כדי לתקן את מיקום הראש על-ידי חדירה דרך העיניים בזווית של כ-45° והפעל כוח כדי לוודא שהמחטים קבועות על הצלחת(איור 2A).
4. השתמש No.5 מלקחיים כדי להסיר עור וגולגולת, מהאמצע לצדדים.
5. השתמש במלקחיים כדי לחתוך את נורות הריח ולהסיר את קרום המוח כדי לחשוף את רקמות קליפת המוח.3.6.Use מלקחיים מעוגלים כדי לחתוך את רקמות קליפת המוח לתוך 2-3 מ"ל של מדיום נוירובאסלי על קרח (איור 2B). רקמות קליפת המוח של הבריכה מעוברים שונים לפי הצורך. רקמות מ 8-10 עוברים בדרך כלל לתת ~ 200 מיקרוגרם הכולל RNA.

4. תמוגה תאית

1. ביום של ניתוח רקמות, להכין מאגר תמוגה תא טרי כמתואר בטבלה 2.

תמיסה	ריכוז סופי	נפח
טריס-HCl (עמ' 7.5)	20 מ"מ	100 μL
KCl	100 מ"ר	250 μL
MgCl2	5 מ"מ	25 μL
טריטון X-100	1% (v/v)	500 μL
נתרן דוקסיכולאט	0.5% (עם/v)	500 μL
דיתיותריטול (DTT)	1 מ"מ	5 μL
ציקלוהקסימיד	100 מיקרוגרם/ מ"ל	5 μL
מים ללא RNase		עד 5 מ"ל
סך	5 מ"ל	5 מ"ל

טבלה 2: הכנת מאגר תמוגה פוליזום.

הערה: תוספת מאגר תמוגה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז.

2. הוסף ציקלוהקסימיד למדיום הנוירובאסלי עם רקמות מנותח לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ציקלוהקסימיד חוסם התארכות תרגום, ולכן מונע ריצת ריבוזום ¹⁵.
3. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולזרוק את supernatant.
4. לשטוף את הרקמות פעמיים עם מלח קר כקרח פוספט אגירה (PBS) בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוהקסימיד.
5. הוסף 500 μL של מאגר תמוגה התא בתוספת 4 μL של מעכב RNase. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשבית את הרקמה במאגר תמוגה. השתמש במחט אינסולין בעדינות lyse הרקמה.
6. דגירה את הרקמות על הקרח במשך 10 דקות עם מערבולת קצרה כל 2-3 דקות.
   הערה: כדי למנוע השפלה של רקמות, ודא כי כל השלבים של תמוגה רקמה מתבצעים על קרח.
7. צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש על קרח.
9. צנטריפוגה ב ~ 13,000 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
10. להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש על קרח.
11. למדוד את ריכוז RNA ברקמה lysate באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis.
    הערה: אם דגימות מרובות כלולות בניסוי, לדלל דגימות לאותו ריכוז עם מאגר תמוגה תא נוסף כדי למזער את השונות.

5. טעינה דגימה אולטרה צנטריפוגה

1. מצננים מראש את רוטור האולטרה-צנטריפוגה ואת דליי הנדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ומגדירים את הטמפרטורה של האולטרה-סנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס.
2. שמור 20 μL של lysate הרקמה כמו קלט RNA הכולל.
3. לטעון דגימות (50-300 מיקרוגרם RNA עם נפח שווה) על החלק העליון של שיפוע סוכרוז על ידי חלוקת לאט את lysate לקירות של צינורות ultracentrifuge.
4. מניחים בעדינות את צינורות האולטרה-צנטריפוגה בדלי הנדנדה. ודא שכל הדליים ההפוכים מבחינה דיאמטרית מאוזנים.
5. טען את דליי הנדנדה על הרוטור. הגדר את ultracentrifuge ל 190,000 x g (~ 39,000 סל"ד) ב 4 °C (70 °F) במשך 90 דקות.
6. מניחים בעדינות את השיפוע על קרח לאחר צנטריפוגה.

6. שבר ואיסוף לדוגמה

הערה: מערכת ניתוק, הקלטה ואיסוף ביתית משמשת לניתוח ואיסוף דגימות מהמדרגיים(איור 3, ראה רכיבי התקן).

1. מניחים צינור אולטרה צנטריפוגה ריק על מדקר הצינור בעדינות לחדור את הצינור עם המחט מלמטה.
2. הפעל את צג UV ופתח את תוכנת הקלטת האותות הדיגיטלית.
3. מלא מזרק 30 מ"ל עם 25 מ"ל של 60% פתרון מרדף סוכרוז. לחץ בעדינות על המזרק כך שתמיסת המרדף תמלא את הצינור הריק ותעבור דרך צג UV של 254 ננומטר כדי להגדיר את הבסיס לגילוי.
4. לחץ על אפס אוטומטי בצג UV כדי לרשום תוכנית בסיסית לזיהוי. לחץ על הפעל בתוכנה כדי להתחיל בהקלטה.
5. ברגע שהמערכת קובעת בסיס, השהה את ההקלטה על התוכנה וחזור בו מפתרון המרדף. ודא שלא נשאר פתרון מרדף שיורית במערכת.
   הערה: יש לשטוף את המערכת במים נטולי RNase כדי להסיר שאריות של פתרונות סוכרוז שנותרו מההפעלה הקודמת.
6. טען צינור דגימה אחד לפיקר הצינור. בעדינות לחדור את הצינור עם המחט מלמטה.
7. התחל להקליט בתוכנה. הפעל את משאבת המזרק (קצב זרימה של 1 מ"ל / דקה עבור נפח של 25 מ"ל) ואת אספן השברים כדי לאסוף שברים פוליזומים. הגדר הגדרות שבר ל- 30 שניות.
   הערה: לפני כל ריצה, ודא שאין בועות אוויר במזרק או בצינורות על ידי לחיצה עדינה על המזרק כדי לאפשר לפתרון המרדף לזרום ברציפות דרך המחט.
8. לאסוף את השברים לתוך 1.5 צינורות מ"ל (500 μL כל אחד) באמצעות אספן שבר.
9. ניתן לעבד את השברים באופן מיידי או לאחסן אותם ב- -80 °C (60 °F).
10. לאחר איסוף שברים, יש לשטוף את המערכת במים נטולי RNase כדי להסיר כל שאריות סוכרוז.

7. מיצוי רנ"א

1. לכל שבר, להוסיף 10 ng של לוציפראז mRNA ספייק בשליטה.
2. הוסף שלושה כרכים של גואנידיום הידרוכולריד מבוסס מסחרי בידוד RNA מגיב לכל שבר.
3. וורטקס לזמן קצר במשך 15 שניות.
4. לחלץ RNA באמצעות ערכת מיצוי RNA תואם את הפתרון המשמש 7.2.

8. שעתוק הפוך PCR בזמן אמת

1. למדוד את הריכוז של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis.
2. RNA נושא להפוך שעתוק באמצעות ערכת סינתזה cDNA, על פי פרוטוקול היצרן.
3. השתמש PCR בזמן אמת כמותי (qPCR) כדי לבחון את ההתפלגות הפוליסומלית של mRNA gapdh כדוגמה. qPCR בוצע באמצעות מערכת זיהוי qPCR ריאגנט mastermix qPCR, עם תנאי האופניים הבאים: 95 °C (75 °F) במשך 10 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 °C (65 °F) עבור 15 s, 60 °C (60 °F) עבור 30 s, 72 °C (72 °F) עבור 40 s, ואחריו 95 °C (60 °F) עבור 60 s.
4. השג ערכי מחזור סף (Ct) מהחלקות ההגברה ושימש לחישוב שינוי קיפול באמצעות שיטת ΔΔCt.

9. סוקרוז הדרגתי ביצוע הרכבת המערכת

הערה: בצע את השלבים להרכבת כל רכיב (כמתואר בטבלה 3)של יצרנית מעבר הצבע סוכרוז (איור 1).

1. הכן שני סוגריים אנכיים (A2) על לוח הלחם הבסיסי (A1).
2. השתמש בשני סוגריים דקים בזווית ישרה (B2) כדי לטעון את מפעיל השלב הליניארי ללוח הלחם הבסיסי (A1).
3. השתמש ב- 12.7 מ"מ אלומיניום (C2) כדי לתקן אותו על לוח הלחם הבסיסי של מחזיק הצינור (C1) כמעמד למחזיק הצינור.
4. להרכיב את הזווית הימנית Ø1/2" כדי Ø6 מ"מ פוסט מהדק (C3) עם הפוסט (C2) ואת הפוסט האופטי מיני סדרה (C4).
5. השתמש ב- setscrew בעמדה האופטית (C4) כדי לחבר מהדק V קטן (C5) כמחזיק הצינור.
6. שים צינור צנטריפוגה במחזיק הצינור ולהתאים את הזווית כדי להפוך אותו אנכי. סמנו את מיקום הצינור והרכיבו את מחזיק עמוד הכן (C6) על לוח הלחם הבסיסי (C1) כדי לתמוך בצינור.
7. בצד השני של לוח הלחם (A1), השתמש בערכות של עמוד האלומיניום Ø12.7 מ"מ (D1) כדי לתקן אותו ולחבר פוסט אופטי מסדרה קטנה (D3) באמצעות זווית ישרה Ø1/2" כדי Ø6 מ"מ פוסט מהדק (D2).
8. חבר את המהדק V המיניאטורי (D4) עם מחט קהה קצה (D5) להודעה (D3). להתאים את הזווית של המהדק כדי להגדיר את המחט אנכית, ולהתאים את אורך ההודעה כדי להבטיח את המחט פוגש את הצינור צנטריפוגה.
9. חבר את המפעיל (B1) לנהג מנוע הצעד (E1) והשתמש בלוח הבקר של UNO R3 ובמודול הג'ויסטיק מערכת המתנע של UNO (E2) כדי לשלוט במפעיל. מתאם הספק (למשל, מתאם הספק מתכוונן 9-24 V AC/DC) יכול לשמש להנעת המנוע בנפרד.
10. מניחים את משאבת המזרק (F) ליד תחנת הכנת השיפוע ומחברים את המזרק עם המחט.
11. שלוט בשלב מחזיק הצינור למעלה ולמטה באמצעות מוט ההיגוי.

רכיב	פריט
B1	מפעיל שלב ליניארי
E1	נהג מנוע צעד
E2	ערכת סטרטר סופר פרויקט UNO
A1 (1)	לוח לחם
A2	סוגר מרובע אנכי
B2	סוגר דק בזווית ישרה
C1	לוח לחם מיני-סדרה
C5	מהדק V קטן
D4	מהדק V מיניאטורי
C2	עמדת אלומיניום Ø12.7 מ"מ
C4, D3	פוסט אופטי מסדרה מיני
D1	עמדת אלומיניום Ø12.7 מ"מ
C3, D2	זווית ישרה Ø1/2" כדי Ø6 מ"מ פוסט מהדק
C6	בסיס מחזיק פוסטים של סדרה מצומצמת
D5	מחט קצה קהה
פ	משאבת מזרק

טבלה 3: מעבר צבע ליצירת רכיבי מערכת.

10. מיון וזיהוי הרכבה של המערכת (איור 2).

1. השתמש במהדק בורט לסת עגול רגיל כדי להרכיב את מודול האופטיקה של צג UV על מדקר הצינור. חבר קצה אחד של הצינור (1 ס"מ אורך ו 0.56 מ"מ קוטר פנימי) לחיבור של מדקר הצינור ואת הקצה השני לנוזל ביציאה של מודול אופטיקה. חבר את יציאת Fluid Out לשבר.
2. חבר את מודול האופטיקה עם יחידת הבקרה של צג UV על פי המדריך של היצרן.
3. השתמש בכבל פריצה כדי לחבר את שקע יציאת האות לממיר הדיגיטלי בבסיס וחיבורי קלט אנלוגיים, בהתאם למדריך היצרן.
4. חבר את הממיר הדיגיטלי למחשב נישא באמצעות כבל USB רגיל והקלט את האותות הדיגיטליים המומרים באמצעות תוכנה לרכישת נתונים.

תוצאות

כהדגמה, ליסט קליפת המוח המכיל 75 מיקרוגרם RNA (מאוגד מ 8 עוברים) הופרד על ידי שיפוע סוכרוז ל 12 שברים. פסגות ספיגת UV ב-254 ננומטר זיהו שברים המכילים את יחידת המשנה 40S, יחידת משנה של 60S, מונוזום 80S ופוליזומים(איור 4A). ניתוח שברים לפי כתם מערבי עבור יחידת המשנה ריבוזומה גדולה, Rpl10 הראה את...

Discussion

פרופיל פוליזום הוא טכניקה נפוצה ורבת עוצמה להערכת מצב התרגום הן בגן יחיד והן ברמות הגנום הרחבות¹⁴ . בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול של פרופיל פוליזום באמצעות פלטפורמה ביתית והיישום שלה כדי לנתח את קליפת העכבר המתפתחת. פלטפורמה חסכונית זו קלה להרכבה ולייצור שיפוע סוכרוז חזק וניתן...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M