Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Özet

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Özet

Memeli beyninin doğru gelişimi, nöral kök hücre çoğalması ve farklı nöral hücre tiplerine farklılaşmanın ince bir dengesine dayanır. Bu denge, transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri dahil olmak üzere birden fazla düzeyde ince ayarlı gen ekspresyonu ile sıkı bir şekilde kontrol edilir. Bu bağlamda, büyüyen bir kanıt kütlesi, nöral kök hücre kader kararlarının koordinasyonunda çeviri düzenlemesinin kritik bir rolünü vurgulamaktadır. Polizom fraksiyonasyonu, mRNA çeviri durumunun hem küresel hem de bireysel gen düzeylerinde değerlendirilmesi için güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan fare serebral korteksinden hücrelerde çevirisel verimliliği değerlendirmek için şirket içi bir polisome profilleme boru hattı sunuyoruz. Sükroz gradyan hazırlama, doku lizisi, ultrasantrifüjasyon ve mRNA çeviri durumunun fraksiyonasyona dayalı analizi için protokolleri açıklıyoruz.

Giriş

Memeli beyninin gelişimi sırasında, sinirsel kök hücreler nöronlar oluşturmak için çoğalır ve farklılaşır ve glia^1,2 . Bu sürecin pertürbasyonu, birçok nörogelişimsel bozuklukta görüldüğü gibi beyin yapısında ve işlevinde değişikliklere yol açabilir^3,4. Nöral kök hücrelerin uygun davranışı, belirli genlerin düzenlenmiş ifadesini gerektirir⁵. Bu genlerin epigenetik ve transkripsiyonel kontrolü yoğun olarak çalışılmış olsa da, son bulgular diğer seviyelerde gen düzenlemesinin nöral kök hücre çoğalması ve farklılaşması 6 ,⁷, 8^,9,10koordinasyonuna da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu nedenle, çevirisel kontrol programlarını ele almak, nöral kök hücre kader kararının ve beyin gelişiminin altında kalan mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde ilerletecektir.

Ribozom profilleme, ribozom benzeşim saflaştırma (TRAP) ve polisome profilleme dahil olmak üzere mRNA'nın çeviri durumunu değerlendirmek için farklı güçlere sahip üç ana teknik yaygın olarak uygulanmıştır. Ribozom profilleme, ribozom korumalı mRNA parçalarını belirlemek için RNA dizilimini kullanır ve her transkriptteki ribozomların çeviri sayısının ve konumunun küresel analizinin, transkript bolluğu ile karşılaştırarak dolaylı olarak çeviri oranını çıkarabilmesini sağlar¹¹. TRAP, ribozomlara bağlı mRNA'ları yakalamak için epitop etiketli ribozomal proteinlerden yararlanır¹². Etiketli ribozomal proteinlerin genetik yaklaşımlar kullanılarak belirli hücre tiplerinde ifade edilebildiği göz önüne alındığında TRAP, çevirinin hücre tipine özgü bir şekilde analiz edilmesine izin verir. Buna karşılık, serbest ve kötü çevrilmiş kısmı (daha hafif monosomes) ribozomlar (daha ağır poliomlar) tarafından aktif olarak çevrilenlerden ayırmak için sakkaroz yoğunluğu gradyan fraksiyonunu kullanan polisome profilleme, mRNA¹³üzerinde ribozom yoğunluğunun doğrudan ölçümünü sağlar. Bu tekniğin sunduğu avantajlardan biri, belirli bir mRNA'nın çevirisini ve genom çapında translatom analizini incelemek için çok yönlülüğüdür¹⁴.

Bu yazıda, gelişmekte olan fare serebral korteksini analiz etmek için ayrıntılı bir polisome profilleme protokolünü açıklıyoruz. Sakkaroz yoğunluk gradyanları hazırlamak ve aşağı akış uygulamaları için fraksiyonları toplamak için ev yapımı bir sistem kullanıyoruz. Burada sunulan protokol, diğer doku ve organizma türlerini analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.

Protokol

Tüm hayvan kullanımı Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından denetlendi. Deney için kullanılan CD1 fareleri ticari satıcıdan satın alındı.

1. Çözümlerin hazırlanması

NOT RNA bozulmasını önlemek için, RNase dekontaminasyon çözeltisi ile tezgahı ve tüm ekipmanları püskürtün. Deney için RNase içermeyen ipuçları kullanılır. Tüm çözümler RNase içermeyen suda hazırlanır.

1. DMSO'da sikloeximide stok çözeltisi (100 mg/mL) hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
2. RNase içermeyen suya 75,3 g sakkaroz ekleyerek ve hacmi 100 mL'ye yükselterek 2,2 M sakkaroz stok çözeltisi hazırlayın (~16 gradyan hazırlığı için). Çözelti uzun süreli depolama için -20 °C'de tutulabilir.
3. 10x tuz çözeltisi hazırlayın (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl_2).
4. 30 g sakkaroz, 5 mL 10x tuz çözeltisi içeren% 60 (w/ v) sakkaroz kovalama çözeltisi hazırlayın ve hacmi RNase içermeyen su ile 50 mL'ye kadar üst üste yerleştirin.
5. İsteğe bağlı olarak, kovalama çözümüne RNase içermeyen suda bromofenol mavisi veya yaklaşık 5 μL% 1 bromofenol mavisi ekleyin. 1.6. Çözümleri 4 °C'de saklayın.

2. Sakkaroz gradyanının hazırlanması

NOT: Sakkaroz gradyanlarının hazırlanmasında doğruluk, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmede kritik öneme sahiptir.

1. Altı adet % 10-50 sakkaroz gradyan hazırlamak için, Tablo 1'deolduğu gibi 2,2 M sakkaroz çözeltisini seyreltin.

Sakkaroz çözeltisi	10%	20%	30%	40%	50%
2.2 M sakaroz	2 mL	4 mL	6 mL	8 mL	10 mL
10X tuz çözeltisi	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL
Cycloheximide	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
Su	11,5 mL	9,5 mL	7,5 mL	5,5 mL	3,5 mL
Toplam birim	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL

Tablo 1: Sakkaroz gradyanlarının preparatları için sakkaroz seyreltmeleri.

NOT: Ultrasantrifüjleme sırasında ağırlığı dengelemek için her zaman sakkaroz gradyanlarını iki kat olarak hazırlayın.

2. Metal künt uç iğnesini RNase dekontaminasyon çözeltisi ile silin. Ultracentrifuge tüplerini, boruları ve şırınnayı RNase içermeyen su kullanarak kısaca durulayın. Tüpleri, kalan su sakkaroz konsantrasyonu değiştireceği için tüplerde su damlası kalmayacak şekilde havayla kurutun.
3. Metal iğneyi kelepçe tutucusuna ve santrifüj tüpünü motorlu sahneye yerleştirin. Degradeleri tutarlı bir şekilde hazırlamak için, ultrasantrifüj tüpünü tutmak için motorlu bir aşama ve sakkaroz çözeltilerini enjekte etmek için bir şırıngar pompası içeren ev yapımı bir sistem kullanılmıştır (Şekil 1, ayrıntılar için adım 9'a bakın).
4. 30 mL'lik bir şırıngayı ~16 mL%10 sakkarozla doldurun (altı gradyan için yeterlidir), şırınga pompasına yerleştirin ve iğneye bağlayın. Şırınga, tüp ve iğnede hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Kalan çözeltiyi çıkarmak için iğnenin ucunu silin.
5. Motorlu sahneyi, iğnenin ucu alttaki tüpün ortasına değdirene kadar yukarı taşıyın.
6. Şırınd pompasını 2,3 mL hacim için 2 mL/dk akış hızına ayarlayın.
7. % 10 sakkaroz çözeltisinin 2,3 mL'sini dağıttıktan sonra, motorlu aşamadan aşağı hareket edin ve altı degradenin tümü için işlemi tekrarlayın.
8. Tüplerin altına% 20 sakkaroz çözeltisi eklemek için 2.4-2.7 adımlarını tekrarlayın, ardından% 30, % 40 ve% 50 sakkaroz çözeltileri benzer şekilde.
9. Degradenin hazırlanmasından sonra, ultracentrifuge tüpünü bir parafin filmi kullanarak kapatın.
10. Tüpleri 4 °C'de bir gece bırakın, böyle şekilde farklı sakkaroz katmanları birlikte yayılarak sürekli bir gradyan verin.

3. Doku diseksiyonu

NOT: Gebe fareler% 5 izofluran ile anesteziden önce servikal çıkık ile ötenaziye tabi edildi.

1. Embriyonik 12. günde veya gerektiğinde diğer zaman noktalarında CD1 fare embriyolarını toplayın ve hücre canlılığını korumak için embriyoları buz gibi Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren Ø 10 cm'lik bir tabağa yerleştirin.
2. Diseksiyon kapsamı altında, bir embriyoyu buz gibi HBSS içeren Ø 6 cm'lik bir plakaya aktarın.
3. Yaklaşık 45° açıyla gözlerden geçerek başın konumunu sabitlemek için 21-23 G iğneler kullanın ve iğnelerin plakaya sabit olduğundan emin olmak için kuvvet uygulayın (Şekil 2A).
4. Deriyi ve kafatasını ortadan yanlara çıkarmak için No.5 tokmak kullanın.
5. Koku ampullerini kesmek ve kortikal dokuları ortaya çıkarmak için menenjileri çıkarmak içinps kullanın.3.6.Kortikal dokuları buz üzerinde 2-3 mL nörobakal ortama kesmek için kavisli önksezi kullanın(Şekil 2B). Gerektiğinde farklı embriyolardan kortikal dokuları havuza edin. 8-10 embriyodan dokular genellikle ~200 μg toplam RNA verir.

4. Hücre lizisi

1. Doku diseksiyonu gününde, Tablo 2'de açıklandığı gibi taze hücre liziz tamponu hazırlayın.

çözüm	Son konsantrasyon	hacim
Tris-HCl (pH 7.5)	20 mM	100 μL
Kartal	100 mM	250 μL
MgCl2	5 mM	25 μL
Triton X-100	%1 (v/v)	500 μL
Sodyum deoksikolat	%0,5 (w/v)	500 μL
Dithiothreitol (DTT)	1 mM	5 μL
Cycloheximide	100 μg/mL	5 μL
RNase ücretsiz su		5 mL'ye kadar yükleme
toplam	5 mL	5 mL

Tablo 2: Polizom liziz tamponunun hazırlanması.

NOT: Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile takviye lizis tamponu.

2. 100 μg/mL'lik son konsantrasyona parçalanmış dokularla nörobakal ortama sikloeximide ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Cycloheximide çeviri uzamasını engeller ve bu nedenle ribozom çalıştırmasını önler ¹⁵.
3. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.
4. Dokuları 100 μg/mL sikloeximid ile desteklenmiş buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
5. 4 μL RNaz inhibitörü ile desteklenmiş 500 μL hücre liziz tamponu ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı lizis tamponunda dokuyu yeniden dirsindirmek için. Dokuyu hafifçe imsilmek için bir insülin iğnesi kullanın.
6. Her 2-3 dakikada bir kısa girdap ile buzdaki dokuları 10 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Doku bozulmasını önlemek için doku lizizinin tüm adımlarının buz üzerinde gerçekleştirilmesini sağlayın.
7. 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj.
8. Süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
9. 4 °C'de 5 dakika boyunca ~13.000 x g'da santrifüj.
10. Süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
11. UV-Vis spektrofotometresi kullanarak doku lysate'deki RNA konsantrasyonunu ölçün.
    NOT: Deneye birden fazla örnek dahil edilirse, varyasyonu en aza indirmek için örnekleri ekstra hücre liziz tamponu ile aynı konsantrasyonda seyreltin.

5. Örnek yükleme ve ultrasantrifüjleme

1. Ultracentrifugation rotorunu ve salıncak kovalarını 4 °C'de önceden soğutun ve ultrasantrifüjün sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın.
2. Toplam RNA girişi olarak doku lysate 20 μL tutun.
3. Numuneleri (eşit hacimli 50-300 μg RNA) sakkaroz gradyanlarının üstüne, lisatı ultracentrifuge tüplerinin duvarlarına yavaşça dağıtarak yükleyin.
4. Ultracentrifuge tüplerini salıncak kovasına hafifçe yerleştirin. Tüm çapraz zıt kovaların dengeli olduğundan emin olun.
5. Salıncak kovalarını rotora yükleyin. Ultrasantrifüjü 90 dakika boyunca 4 °C'de 190.000 x g (~39.000 rpm) olarak ayarlayın.
6. Santrifüjlemeden sonra degradeleri yavaşça buza yerleştirin.

6. Fraksiyonasyon ve örnek toplama

NOT: Analiz ve degradelerden numune toplamak için ev yapımı kesirleme, kayıt ve toplama sistemi kullanılır (Şekil 3, bkz. Cihaz bileşenleri).

1. Tüp delicisine boş bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve alttan iğne ile tüpü hafifçe delin.
2. UV monitörünü açın ve dijital sinyal kayıt yazılımını açın.
3. 30 mL'lik bir şırınnayı % 60 sakkaroz kovalama çözümünün 25 mL'si ile doldurun. Şırındağa yavaşça bastırın, böylece kovalama çözeltisi boş tüpü doldurur ve algılama için taban çizgisini ayarlamak için 254 nm UV monitöründen geçer.
4. Algılama için bir taban çizgisi kaydetmek için UV monitöründe otomatik sıfıra basın. Kayda başlamak için yazılım üzerinde oynat tuşuna basın.
5. Sistem bir taban çizgisi oluşturduktan sonra, yazılımdaki kaydı duraklatın ve chase çözümünü geri alın. Sistemde artık chase çözümü kalmadığından emin olun.
   NOT: Önceki çalıştırmadan kalan artık sakkaroz çözeltilerini çıkarmak için sistemi RNase içermeyen suyla durulayın.
6. Tüp delicisine bir örnek tüp yükleyin. Alttan iğne ile tüpe hafifçe nüfuz edin.
7. Yazılıma kaydetmeye başlayın. Şırınd pompasını (25 mL hacim için 1 mL/ dk akış hızı) ve kesir toplayıcıyı polisome fraksiyonları toplamak için başlatın. Kesirleyici ayarlarını 30 s olarak ayarlayın.
   NOT: Her çalıştırmadan önce, kovalamaca çözeltisinin iğneden sürekli akmasını sağlamak için şırıngaya hafifçe bastırarak şırıngada veya boruda hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
8. Kesirleri bir kesir toplayıcı kullanarak 1,5 mL tüpler (her biri 500 μL) halinde toplayın.
9. Kesirler hemen işlenebilir veya -80 °C'de saklanabilir.
10. Fraksiyon toplamadan sonra, herhangi bir kalıntı sakkarozunu çıkarmak için sistemi RNase içermeyen suyla durulayın.

7. RNA'nın Çıkarılması

1. Her kesir için 10 ng luciferaz mRNA çivili kontrol ekleyin.
2. Her kesir için üç hacim guanidiyum hidrokalrid bazlı ticari RNA izolasyon reaktifi ekleyin.
3. Vortex kısaca 15 sn.
4. 7.2'de kullanılan çözelti ile uyumlu bir RNA çıkarma kiti kullanarak RNA çıkarın.

8. Ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı PCR

1. UV-Vis spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.
2. Üreticinin protokolüne göre RNA'yı bir cDNA sentez kiti kullanarak ters transkripsiyona tabi edin.
3. Örnek olarak gapdh mRNA'nın polizomal dağılımını incelemek için nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) kullanın. qPCR, aşağıdaki bisiklet koşullarına sahip bir qPCR algılama sistemi ve bir qPCR mastermix reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi: 10 dakika için 95 °C, daha sonra 15 s için 95 °C 40 döngü, 30 s için 60 °C, 40 s için 72 °C, ardından 60 s için 95 °C.
4. Amplifikasyon çizimlerinden Eşik döngüsü (Ct) değerleri elde edin ve ΔΔCt yöntemini kullanarak kat değişimini hesaplamak için kullanılır.

9. Sakkaroz gradyan yapma sistemi montajı

NOT: Sakkaroz degrade makinesinin her bileşenini (Tablo 3'teaçıklandığı gibi) birleştirmek için adımları izleyin (Şekil 1).

1. Temel ekmek tahtasına (A1) iki dikey braket (A2) takın.
2. Doğrusal kademeli aktüatörü temel ekmek tahtasına (A1) monte etmek için iki ince dik açılı braket (B2) kullanın.
3. Ø12,7 mm alüminyum direk (C2) üzerindeki set vidasını tüp tutucu taban ekmek tahtasına (C1) sabitlemek için tüp tutucu için bir stand olarak kullanın.
4. Dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm posta kelepçesini (C3) post (C2) ve mini serisi optik direk (C4) ile monte edin.
5. Tüp tutucu olarak küçük bir V kelepçesi (C5) bağlamak için optik direkteki (C4) set vidasını kullanın.
6. Tüp tutucusuna bir santrifüj tüpü koyun ve dikey hale getirmek için açıyı ayarlayın. Tüpün konumunu işaretleyin ve tüpü desteklemek için kaide posta tutucusunu (C6) temel ekmek tahtasına (C1) monte edin.
7. Ekmek tahtasının (A1) diğer tarafında, düzeltmek için Ø12,7 mm alüminyum direğin (D1) set vidasını kullanın ve dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm post clamp (D2) kullanarak mini seri optik direği (D3) bağlayın.
8. Minyatür V kelepçesini (D4) künt uçlu iğne (D5) ile direğe (D3) bağlayın. İğneyi dikey olarak ayarlamak için kelepçenin açısını ayarlayın ve iğnenin santrifüj tüpüyle buluştuğundan emin olmak için direğin uzunluğunu ayarlayın.
9. Aktüatörü (B1) step motor sürücüsüne (E1) bağlayın ve aktüatörü kontrol etmek için UNO R3 kontrol panosunu ve UNO marş kitinin (E2) joystick modülünü kullanın. Motoru ayrı ayrı sürmek için bir güç adaptörü (örneğin, 9-24 V AC/DC ayarlanabilir güç adaptörü) kullanılabilir.
10. Şırınga pompasını (F) gradyan yapma istasyonunun yanına yerleştirin ve şırıngayı iğneye bağlayın.
11. Kumanda çubuğunu kullanarak tüp tutucu aşamasını yukarı ve aşağı kontrol edin.

parça	madde
B1	Doğrusal sahne aktüatörü
E1	Step motor sürücüsü
E2	UNO projesi süper başlangıç kiti
A1	Ekmek tahtası
A2	Dikey köşeli ayraç
B2	İnce dik açılı braket
C1	Mini seri ekmek tahtası
C5	Küçük V kelepçesi
D4	Minyatür V kelepçesi
C2	Ø12.7 mm alüminyum direk
C4, D3	Mini serisi optik direk
D1	Ø12.7 mm alüminyum direk
C3, D2	Dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm direk kelepçesi
C6	Mini seri kaide direği tutucu tabanı
D5	Künt uç iğnesi
F	Şırınd pompası

Tablo 3: Degrade yapma sistemi bileşenleri.

10. Kesirleme ve sistem montajının algılanıyor (Şekil 2).

1. UV monitörün optik modülünü tüp deliiciye monte etmek için normal yuvarlak çeneli burette kelepçe kullanın. Borunun bir ucunu (1 cm uzunluğunda ve 0,56 mm iç çap) tüp delicinin bağlantı elemanına, diğer ucunu ise optik modülün Akışkan Giriş portine takın. Fluid Out bağlantı noktasını kesirleyiciye bağlayın.
2. Optik modülü, üreticinin el kitabına göre UV monitörün kontrol ünitesine bağlayın.
3. Üretici kılavuzuna göre, sinyal çıkış soketini yerdeki dijital dönüştürücüye ve analog giriş bağlantılarına bağlamak için bir koparma kablosu kullanın.
4. Dijital dönüştürücüyü normal bir USB kablosu kullanarak bir dizüstü bilgisayara bağlayın ve veri toplama yazılımını kullanarak dönüştürülen dijital sinyalleri kaydedin.

Sonuçlar

Bir gösteri olarak, 75 μg RNA (8 embriyodan havuza) içeren kortikal lisat, sakkaroz gradyanı tarafından 12 fraksiyona ayrıldı. 254 nm'deki UV emicilik zirveleri, 40S alt birliğini, 60S alt birliğini, 80S monozomunu ve polizomlarını içeren fraksiyonları tanımladı (Şekil 4A). Büyük ribozomal alt bira için batı lekesi ile fraksiyonların analizi, Rpl10 60S alt birliği (fraksiyon 3), monozom (fraksiyon 4) ve polisomes (fraksiyonlar 5-12) (Şekil 4B)

Tartışmalar

Polisome profilleme, çeviri durumunu hem tek gen hem de genom çapında değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir tekniktir¹⁴ . Bu raporda, ev yapımı bir platform ve gelişmekte olan fare korteksini analiz etmek için uygulamasını kullanarak polisome profilleme protokolü sunuyoruz. Bu uygun maliyetli platformun montajı ve yüksek hassasiyete sahip sağlam, tekrarlanabilir sakkaroz gradyanları ve polisome profilleme üretilmesi kolaydır.

T...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M