Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

Riepilogo

Lo sviluppo del cervello dei mammiferi richiede un adeguato controllo dell'espressione genica a livello di traduzione. Qui descriviamo un sistema di profilazione polisome con una piattaforma di gradiente di saccarosio e frazionamento facile da assemblare per valutare lo stato traslazionale degli mRNA nel cervello in via di sviluppo.

Abstract

Il corretto sviluppo del cervello dei mammiferi si basa su un buon equilibrio tra proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali in diversi tipi di cellule neurali. Questo equilibrio è strettamente controllato dall'espressione genica che viene messa a punto a più livelli, tra cui trascrizione, post-trascrizione e traduzione. A questo proposito, un crescente corpus di prove evidenzia un ruolo critico della regolamentazione traslizionale nel coordinamento delle decisioni sul destino delle cellule staminali neurali. Il frazionamento polisoma è un potente strumento per la valutazione dello stato traslazione dell'mRNA a livello genico globale e individuale. Qui presentiamo una pipeline di profilazione polisomaria internamente per valutare l'efficienza traslibrazionale nelle cellule dalla corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Descriviamo i protocolli per la preparazione del gradiente di saccarosio, la lisi tissutale, l'ultracentrifugazione e l'analisi basata sul frazionamento dello stato traslazione dell'mRNA.

Introduzione

Durante lo sviluppo del cervello dei mammiferi, le cellule staminali neurali proliferano e si differenziano per generare neuroni e glia^1,2 . La perturbazione di questo processo può portare ad alterazioni della struttura e della funzione cerebrale, come si vede in molti disturbi del neurosviluppo^3,4. Il corretto comportamento delle cellule staminali neurali richiede l'espressione orchestrata di geni^{specifici 5}. Mentre il controllo epigenetico e trascrizionale di questi geni è stato intensamente studiato, recenti scoperte suggeriscono che la regolazione genica ad altri livelli contribuisce anche alla coordinazione della proliferazione e differenziazione delle cellule staminali^{neurali 6,7,8,9,10}. Pertanto, affrontare i programmi di controllo traslizionale farà avanzare notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi alla base della decisione del destino delle cellule staminali neurali e dello sviluppo cerebrale.

Tre tecniche principali con diversi punti di forza sono state ampiamente applicate per valutare lo stato traslazionale dell'mRNA, tra cui la profilazione ribosoma, la traduzione della purificazione dell'affinità ribosoma (TRAP) e la profilazione polisome. La profilazione ribosoma utilizza il sequenziamento dell'RNA per determinare frammenti di mRNA protetti da ribosomi, permettendo all'analisi globale del numero e della posizione della traduzione dei ribosomi su ogni trascrizione di dedurre indirettamente il tasso di traslazione confrontandolo con l'abbondanza di^{trascrizione 11}. TRAP sfrutta le proteine ribosomiche taggate all'epitopo per catturare mRNA legati al ribosoma¹². Dato che le proteine ribosomiche taggate possono essere espresse in specifici tipi di cellule utilizzando approcci genetici, TRAP consente l'analisi della traduzione in modo specifico del tipo cellulare. In confronto, la profilazione polisomeria, che utilizza il frazionamento del gradiente di densità del saccarosio per separare la porzione libera e scarsamente tradotta (monosomi più leggeri) da quelli tradotti attivamente dai ribosomi (polisomi più pesanti), fornisce una misurazione diretta della densità ribosoma su mRNA¹³. Un vantaggio che questa tecnica offre è la sua versatilità per studiare la traduzione di mRNA specifici di interesse e l'analisi del trasoma a livello genomico¹⁴.

In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato di profilazione polisoma per analizzare la corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Utilizziamo un sistema assemblato in casa per preparare gradienti di densità di saccarosio e raccogliere frazioni per applicazioni a valle. Il protocollo qui presentato può essere adattato facilmente per analizzare altri tipi di tessuti e organismi.

Protocollo

Tutto l'uso degli animali è stato supervisionato dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Calgary. I mouse CD1 utilizzati per l'esperimento sono stati acquistati da un fornitore commerciale.

1. Preparazione di soluzioni

NOTA Per prevenire la degradazione dell'RNA, spruzzare il workbench e tutte le apparecchiature con soluzione di decontaminazione RNasi. Per l'esperimento vengono utilizzate punte senza RNasi. Tutte le soluzioni sono preparate in acqua priva di RNasi.

1. Preparare la soluzione di stock di cicloesiloide (100 mg/mL) in DMSO e conservare a -20 °C.
2. Preparare 2,2 M di soluzione di saccarosio aggiungendo 75,3 g di saccarosio all'acqua priva di RNasi e completando il volume a 100 mL (per ~16 preparazione gradiente). La soluzione può essere mantenuta a -20 °C per lo stoccaggio a lungo termine.
3. Preparare 10x soluzione di sale (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl₂).
4. Preparare la soluzione di inseguimento del saccarosio al 60%, contenente 30 g di saccarosio, 5 mL di soluzione salina 10x e raggiungere il volume fino a 50 mL con acqua priva di RNasi.
5. Facoltativamente, aggiungere un granello di blu bromofenolo o circa 5 μL di blu bromofenolo all'1% in acqua priva di RNasi alla soluzione di inseguimento. 1.6. Conservare le soluzioni a 4 °C.

2. Preparazione del gradiente di saccarosio

NOTA: L'accuratezza nella preparazione dei gradienti di saccarosio è fondamentale per ottenere risultati coerenti e riproducibili.

1. Per preparare sei gradienti di saccarosio del 10-50%, diluire la soluzione di saccarosio di 2,2 M come nella tabella 1.

Soluzione di saccarosio	10%	20%	30%	40%	50%
2,2 M di saccarosio	2 mL	4 mL	6 mL	8 mL	10 mL
Soluzione salina 10X	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL
cicloesimide	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
Acqua	11,5 mL	9,5 mL	7,5 mL	5,5 mL	3,5 mL
Volume totale	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL

Tabella 1: Diluizioni del saccarosio per preparazioni di gradienti di saccarosio.

NOTA: Preparare sempre gradienti di saccarosio in multipli di due per bilanciare il peso durante l'ultracentrifugazione.

2. Pulire l'ago contundente metallico con soluzione di decontaminazione RNasi. Risciacquare brevemente i tubi ultracentrifugo, i tubi e la siringa utilizzando acqua priva di RNasi. Asciugare all'aria i tubi in modo che nessuna goccia d'acqua rimanga nei tubi in quanto l'acqua rimanente altererà la concentrazione di saccarosio.
3. Posizionare l'ago metallico sul supporto del morsetto e sul tubo di centrifuga sullo stadio motorizzato. Per preparare i gradienti in modo coerente, è stato utilizzato un sistema assemblato in casa che contiene uno stadio motorizzato per contenere il tubo ultracentrifugo e una pompa per siringhe per iniettare soluzioni di saccarosio(Figura 1, vedere il passaggio 9 per i dettagli).
4. Riempire una siringa da 30 ml con ~ 16 ml di saccarosio al 10% (sufficiente per sei gradienti), posizionarla sulla pompa della siringa e collegarla all'ago. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella siringa, nei tubi e nell'ago. Pulire la punta dall'ago per rimuovere qualsiasi soluzione residua.
5. Spostare lo stadio motorizzato verso l'alto in modo che la punta dell'ago tocchi il centro del tubo nella parte inferiore.
6. Impostare la pompa della siringa a una portata di 2 ml/min per un volume di 2,3 ml.
7. Dopo aver erogato 2,3 mL di soluzione di saccarosio al 10%, spostare lungo lo stadio motorizzato e ripetere il processo per tutti e sei i gradienti.
8. Ripetere i passaggi 2.4-2.7 per aggiungere soluzione di saccarosio al 20% sul fondo dei tubi, seguita da soluzioni di saccarosio 30%, 40% e 50% allo stesso modo.
9. Dopo la preparazione del gradiente, sigillare il tubo ultracentrifugo utilizzando una pellicola di paraffina.
10. Lasciare i tubi durante la notte a 4 °C in modo che i diversi strati di saccarosio si disffondono insieme per dare un gradiente continuo.

3. Dissezione tissutale

NOTA: I topi gravidi sono stati eutanasiati dalla lussazione cervicale preceduta da anestesia con isoflurane al 5%.

1. Raccogliere embrioni di topo CD1 al giorno 12 embrionale o altri punti di tempo in base alle esigenze e posizionare gli embrioni in una piastra Ø 10 cm contenente la soluzione di sale bilanciato (HBSS) di Hank ghiacciata sul ghiaccio per mantenere la vitalità cellulare.
2. Sotto il mirino della dissezione, trasferire un embrione su una piastra di Ø 6 cm contenente HBSS ghiacciato.
3. Utilizzare aghi da 21-23 G per fissare la posizione della testa penetrando attraverso gli occhi con un angolo di circa 45 ° e applicare la forza per assicurarsi che gli aghi siano fissati sulla piastra(Figura 2A).
4. Utilizzare le forcep n. 5 per rimuovere pelle e cranio, dal centro ai lati.
5. Utilizzare le flesse per tagliare i bulbi olfattivi e rimuovere le meningi per esporre i tessuti corticali.3.6.Utilizzare forcep curve per tagliare i tessuti corticali in 2-3 mL di mezzo neurobasale sul ghiaccio (Figura 2B). Mettere in comune tessuti corticali di diversi embrioni in base alle esigenze. I tessuti da 8-10 embrioni di solito danno ~ 200 μg di RNA totale.

4.Lisi cellulare

1. Il giorno della dissezione tissutale, preparare il tampone di lisi cellulare fresca come descritto nella tabella 2.

soluzione	Concentrazione finale	volume
Tris-HCl (pH 7.5)	20 mM	100 μL
Kcl	100 mM	250 μL
MgCl2	5 mM	25 μL
Tritone X-100	1% (v/v)	500 μL
Deossicolato di sodio	0,5% (v/v)	500 μL
Ditiotrititolo (DTT)	1 mM	5 μL
cicloesimide	100 μg/mL	5 μL
RNasi acqua libera		Ricarica fino a 5 mL
totale	5 mL	5 mL

Tabella 2: Preparazione del tampone di polisomalisi.

NOTA: Tampone di lysis supplementare con proteasi e inibitori della fosfatasi.

2. Aggiungere il cicloeximide al mezzo neurobasale con tessuti sezionati ad una concentrazione finale di 100 μg/mL e incubare a 37 °C per 10 min. Il cicloeximide blocca l'allungamento della traslazione e, pertanto, previene il dependio ^{ribosoma 15}.
3. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C e scartare il supernatante.
4. Lavare i tessuti due volte con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) integrata con cicloeximide da 100 μg/mL.
5. Aggiungere 500 μL di tampone dilisi cellulare integrato con 4 μL di inibitore della RNasi. Pipetta su e giù per rimescolare il tessuto nel tampone di lysis. Utilizzare un ago di insulina per liscigere delicatamente il tessuto.
6. Incubare i tessuti sul ghiaccio per 10 minuti con un breve vortice ogni 2-3 minuti.
   NOTA: Per prevenire la degradazione dei tessuti, assicurarsi che tutte le fasi dellalisi tissutale vengano eseguite sul ghiaccio.
7. Centrifuga a 2.000 x g per 5 min a 4 °C.
8. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga su ghiaccio.
9. Centrifuga a ~13.000 x g per 5 min a 4 °C.
10. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga su ghiaccio.
11. Misurare la concentrazione di RNA nel lisato tissutale utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.
    NOTA: Se nell'esperimento sono inclusi più campioni, diluire i campioni alla stessa concentrazione con un buffer di lisi cellulare aggiuntivo per ridurre al minimo la variazione.

5. Carico del campione e ultracentrifugazione

1. Pre-raffreddare il rotore di ultracentrifugazione e le benne oscillanti a 4 °C e impostare la temperatura dell'ultracentrifugo a 4 °C.
2. Mantenere 20 μL del tessuto lysate come ingresso totale di RNA.
3. Caricare campioni (50-300 μg di RNA con un volume uguale) sulla parte superiore dei gradienti di saccarosio erogando lentamente il lysate alle pareti dei tubi ultracentrifugo.
4. Posizionare delicatamente i tubi ultracentrifugo nel secchio oscillante. Assicurarsi che tutti i bucket diametralmente opposti siano bilanciati.
5. Caricare le benne oscillanti sul rotore. Impostare l'ultracentrifugo su 190.000 x g (~ 39.000 giri/min) a 4 °C per 90 min.
6. Posizionare delicatamente le sfumature sul ghiaccio dopo la centrifugazione.

6. Frazionamento e raccolta dei campioni

NOTA: per l'analisi e la raccolta dei campioni dalle pendenze viene utilizzato un sistema di frazionamento, registrazione e raccolta assemblato in casa (Figura 3, vedere Componenti del dispositivo).

1. Posizionare un tubo ultracentrifugo vuoto sul piercer del tubo e penetrare delicatamente nel tubo con l'ago dal basso.
2. Accendere il monitor UV e aprire il software di registrazione del segnale digitale.
3. Riempire una siringa da 30 ml con 25 ml di soluzione di inseguimento al saccarosio al 60%. Premere delicatamente la siringa in modo che la soluzione di inseguimento riempia il tubo vuoto e passare attraverso il monitor UV da 254 nm per impostare la linea di base per il rilevamento.
4. Premere l'azzeramento automatico sul monitor UV per registrare una linea di base per il rilevamento. Premere play sul software per iniziare la registrazione.
5. Una volta che il sistema stabilisce una linea di base, sospendere la registrazione sul software e ritirare la soluzione di inseguimento. Assicurarsi che nel sistema non rimanga alcuna soluzione di inseguimento residua.
   NOTA: Sciacquare il sistema con acqua priva di RNasi per rimuovere le soluzioni residue di saccarosio rimanenti dalla corsa precedente.
6. Caricare un tubo campione sul piercer del tubo. Penetrare delicatamente nel tubo con l'ago dal basso.
7. Iniziare a registrare sul software. Avviare la pompa della siringa (portata di 1 ml/min per un volume di 25 ml) e il raccoglitore di frazioni per raccogliere frazioni polisoma. Impostare le impostazioni del frazionatore su 30 s.
   NOTA: Prima di ogni corsa, assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa o nel tubo premendo delicatamente la siringa per far scorrere continuamente la soluzione di inseguimento attraverso l'ago.
8. Raccogliere le frazioni in tubi da 1,5 ml (500 μL ciascuno) utilizzando un raccoglitore di frazioni.
9. Le frazioni possono essere lavorate immediatamente o conservate a -80 °C.
10. Dopo la raccolta delle frazioni, sciacquare il sistema con acqua priva di RNasi per rimuovere il saccarosio residuo.

7. Estrazione dell'RNA

1. Ad ogni frazione, aggiungere 10 ng di controllo spike-in dell'mRNA luciferasi.
2. Aggiungere tre volumi di reagente di isolamento dell'RNA commerciale basato sull'idrocolride di guanidio ad ogni frazione.
3. Vortice brevemente per 15 s.
4. Estrarre l'RNA utilizzando un kit di estrazione dell'RNA compatibile con la soluzione utilizzata nella versione 7.2.

8. Trascrizione inversa e PCR in tempo reale

1. Misurare la concentrazione dell'RNA utilizzando lo spettrofotometro UV-Vis.
2. Soggetto RNA per invertire la trascrizione utilizzando un kit di sintesi cDNA, secondo il protocollo del produttore.
3. Usa la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) per esaminare la distribuzione polisomale dell'mRNA gapdh come esempio. qPCR è stato eseguito utilizzando un sistema di rilevamento qPCR e un reagente mastermix qPCR, con le seguenti condizioni di ciclo: 95 °C per 10 minuti, quindi 40 cicli di 95 °C per 15 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 40 s, seguiti da 95 °C per 60 s.
4. Ottenere i valori del ciclo di soglia (Ct) dai grafici di amplificazione e utilizzati per calcolare la modifica della piegatura utilizzando il metodo ΔΔCt.

9. Assemblaggio del sistema di produzione del gradiente di saccarosio

NOTA: seguire i passaggi per assemblare ciascun componente (come descritto nella tabella 3) del creatore di gradienti di saccarosio (Figura 1).

1. Montare due staffe verticali (A2) sul breadboard di base (A1).
2. Utilizzare due sottili staffe ad angolo retto (B2) per montare l'attuatore lineare dello stadio sul breadboard di base (A1).
3. Utilizzare il setcrew sul palo in alluminio Ø12.7 mm (C2) per fissarlo sul breadboard di base del supporto del tubo (C1) come supporto per il supporto del tubo.
4. Assemblare il morsetto del palo da Ø1/2" a Ø6 mm (C3) con il palo (C2) e il palo ottico della miniserie (C4).
5. Utilizzare il setcrew sul palo ottico (C4) per collegare un piccolo morsetto a V (C5) come supporto del tubo.
6. Mettere un tubo di centrifuga nel supporto del tubo e regolare l'angolo per renderlo verticale. Contrassegnare la posizione del tubo e montare il portabissosta (C6) sul breadboard di base (C1) per sostenere il tubo.
7. Dall'altro lato del breadboard (A1), utilizzare il setcrew del palo in alluminio da Ø12,7 mm (D1) per fissarlo e collegare un palo ottico mini-serie (D3) utilizzando un morsetto post angolo retto da Ø1/2" a Ø6 mm (D2).
8. Collegare il morsetto a V in miniatura (D4) con l'ago a estremità smussata (D5) al palo (D3). Regolare l'angolo del morsetto per impostare l'ago verticalmente e regolare la lunghezza del palo per assicurarsi che l'ago soddisfi il tubo di centrifuga.
9. Collegare l'attuatore (B1) al driver del motore stepper (E1) e utilizzare la scheda controller UNO R3 e il modulo joystick dello starter kit UNO (E2) per controllare l'attuatore. Un adattatore di potenza (ad esempio, adattatore di potenza regolabile 9-24 V AC/DC) può essere utilizzato per guidare il motore separatamente.
10. Posizionare la pompa della siringa (F) accanto alla stazione di produzione del gradiente e collegare la siringa con l'ago.
11. Controllare lo stadio del supporto del tubo su e giù utilizzando il joystick.

componente	articolo
B1	Attuatore a stadio lineare
E1	Driver motore stepper
E2	Super starter kit progetto UNO
A1	Breadboard
A2	Staffa verticale
B2 B2	Staffa sottile ad angolo retto
C1	Breadboard miniserie
C5	Morsetto a V piccolo
D4	Morsetto a V in miniatura
C2	Palo in alluminio Ø12,7 mm
C4	Mini-serie post ottico
D1	Palo in alluminio Ø12,7 mm
C3, D2	Morsetto per palo da Ø1/2" ad Ø6 mm
C6	Base portabircierba mini-serie
D5	Ago finale smussato
F	Pompa siringa

Tabella 3: Componenti di sistema per la creazione di gradienti.

10. Frazionamento e rilevamento dell'assieme di sistema (Figura 2).

1. Utilizzare un normale morsetto burette a mascella rotonda per montare il modulo ottico del monitor UV sul piercer del tubo. Fissare un'estremità del tubo (1 cm di lunghezza e 0,56 mm di diametro interno) al connettore del piercer del tubo e l'altra estremità alla porta Fluid In del modulo ottico. Collegare la porta Fluid Out al frazionatore.
2. Collegare il modulo ottico con la centralina del monitor UV secondo il manuale del produttore.
3. Utilizzare un cavo breakout per collegare la presa di uscita del segnale al convertitore digitale a terra e connessioni di ingresso analogiche, secondo il manuale del produttore.
4. Collegare il convertitore digitale a un laptop utilizzando un normale cavo USB e registrare i segnali digitali convertiti utilizzando il software di acquisizione dati.

Risultati

Come dimostrazione, il lisato corticale contenente 75 μg di RNA (raggruppato da 8 embrioni) è stato separato dal gradiente di saccarosio in 12 frazioni. Picchi di assorbanza UV a 254 nm hanno identificato frazioni contenenti la subunità 40S, la subunità 60S, il monosome 80S e i polisomi(Figura 4A). Analisi delle frazioni per macchia occidentale per la grande subunità ribosomiale, Rpl10 ha mostrato la sua presenza nella subunità 60S (frazione 3), monosome (frazione 4) e polisomei (frazi...

Discussione

La profilazione polisoma è una tecnica comunemente usata e potente per valutare lo stato traslazione sia a livello di singolo gene che di genoma¹⁴ . In questo report, presentiamo un protocollo di profilazione polisoma utilizzando una piattaforma assemblata in casa e la sua applicazione per analizzare la corteccia del mouse in via di sviluppo. Questa piattaforma economica è facile da assemblare e generare gradienti di saccarosio robusti e riproducibili e profilazione polisoma con elevata sensibil...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M