Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Résumé

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Résumé

Le bon développement du cerveau mammifère repose sur un équilibre fin de la prolifération et de la différenciation des cellules souches neurales en différents types de cellules neurales. Cet équilibre est étroitement contrôlé par l’expression des gènes qui est peaufinée à plusieurs niveaux, y compris la transcription, la post-transcription et la traduction. À cet égard, un nombre croissant de preuves mettent en évidence un rôle essentiel de la régulation translationnelle dans la coordination des décisions relatives au sort des cellules souches neurales. La fractionnement polysome est un outil puissant pour l’évaluation du statut translationnel de l’ARNm aux niveaux génétique global et individuel. Ici, nous présentons un pipeline interne de profilage polysome pour évaluer l’efficacité translationnelle dans les cellules du cortex cérébral de souris en développement. Nous décrivons les protocoles pour la préparation de gradient de saccharose, la lyse de tissu, l’ultracentrifugation et l’analyse fractionnée-basée de l’état translationnel d’ARNm.

Introduction

Pendant le développement du cerveau des mammifères, les cellules souches neurales prolifèrent et se différencient pour générer des neurones et des^{gliales 1,2} . La perturbation de ce processus peut mener aux changements dans la structure et la fonction de cerveau, comme vu dans beaucoup de désordres neurodevelopmental^3,4. Le bon comportement des cellules souches neurales nécessite l’expression orchestrée de gènes spécifiques⁵. Tandis que le contrôle épigénétique et transcriptionnel de ces gènes a été intensivement étudié, les résultats récents suggèrent que la régulation de gène à d’autres niveaux contribue également à la coordination de la prolifération et de la différenciation neurales^{de cellules souches 6,7,8,9,10.} Ainsi, la résolution des programmes de contrôle translationnel fera grandement progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents à la décision sur le sort des cellules souches neurales et au développement du cerveau.

Trois techniques principales avec des forces différentes ont été largement appliquées pour évaluer l’état translationnel de l’ARNm, y compris le profilage ribosome, la traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) et le profilage polysome. Le profilage ribosome utilise le séquençage de l’ARN pour déterminer les fragments d’ARNm protégés par le ribosome, ce qui permet à l’analyse globale du nombre et de l’emplacement des ribosomes de traduction sur chaque transcription d’inférer indirectement le taux de traduction en le comparant à l’abondance de^{transcription 11}. TRAP tire parti des protéines ribosomiques marquées d’épitope pour capturer les ARNM ribosome-liés¹². Étant donné que les protéines ribosomiques étiquetées peuvent être exprimées dans des types de cellules spécifiques à l’aide d’approches génétiques, TRAP permet l’analyse de la traduction d’une manière spécifique au type de cellule. En comparaison, le profilage polysome, qui utilise la fractionnement du gradient de densité saccharose pour séparer la partie libre et mal traduite (monosomes plus légers) de ceux qui sont activement traduits par des ribosomes (polysomes plus lourds), fournit une mesure directe de la densité ribosome sur^{l’ARNm 13}. Un avantage de cette technique est sa polyvalence pour étudier la traduction de l’ARNm spécifique d’intérêt ainsi que l’analyse du traduislatome à l’échelle^{du génome 14}.

Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé de profilage polysome pour analyser le cortex cérébral de souris en développement. Nous utilisons un système assemblé à domicile pour préparer les gradients de densité du saccharose et recueillir des fractions pour les applications en aval. Le protocole présenté ici peut être facilement adapté pour analyser d’autres types de tissus et d’organismes.

Protocole

Toute l’utilisation des animaux a été supervisée par le Comité de protection des animaux de l’Université de Calgary. Les souris CD1 utilisées pour l’expérience ont été achetées auprès d’un fournisseur commercial.

1. Préparation de solutions

REMARQUE Pour prévenir la dégradation de l’ARN, vaporisez l’établi et tout l’équipement avec la solution de décontamination RNase. Les conseils sans RNase sont utilisés pour l’expérience. Toutes les solutions sont préparées dans l’eau sans RNase.

1. Préparer la solution de bouillon de cycloheximide (100 mg/mL) dans DMSO et conserver à -20 °C.
2. Préparez une solution de stock de saccharose de 2,2 M en ajoutant 75,3 g de saccharose à l’eau sans RNase et en recadrage du volume à 100 mL (pour une préparation de gradient ~ 16). La solution peut être maintenue à -20 °C pour le stockage à long terme.
3. Préparer 10x solution de sel (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl₂).
4. Préparez 60 % (w/v) solution de chasse au saccharose, contenant 30 g de saccharose, 5 mL de solution de sel 10x et garnir le volume jusqu’à 50 mL d’eau sans RNase.
5. En option, ajoutez un grain de bromophénol bleu ou environ 5 μL de bleu bromophénol de 1 % dans de l’eau exempte de RNase à la solution de chasse. 1.6. Conserver les solutions à 4 °C.

2. Préparation du gradient de saccharose

REMARQUE : La précision dans la préparation des gradients de saccharose est essentielle pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles.

1. Pour préparer six gradients de saccharose de 10 à 50 %, diluez la solution de saccharose de 2,2 M comme dans le tableau 1.

Solution saccharose	10%	20%	30%	40%	50%
2,2 M saccharose	2 mL	4 mL	6 mL	8 mL	10 mL
Solution de sel 10X	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL
Cycloheximide	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
Eau	11,5 mL	9,5 mL	7,5 mL	5,5 mL	3,5 mL
Volume total	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL	15 mL

Tableau 1 : Dilutions du saccharose pour la préparation des gradients de saccharose.

REMARQUE : Préparez toujours des gradients de saccharose en multiples de deux pour équilibrer le poids pendant l’ultracentrifugation.

2. Essuyez l’aiguille à extrémité émoussée en métal avec la solution de décontamination RNase. Rincez brièvement les tubes d’ultracentrifugeuse, les tubes et la seringue à l’aide d’eau sans RNase. Séchez à l’air les tubes de sorte qu’il ne reste pas de goutte d’eau dans les tubes car toute eau restante modifiera la concentration de saccharose.
3. Placez l’aiguille métallique sur le support de pince et le tube de centrifugeuse sur le stade motorisé. Pour préparer les gradients de façon uniforme, un système assemblé à domicile a été utilisé qui contient une étape motorisée pour tenir le tube d’ultracentrifugeuse et une pompe à seringues pour injecter des solutions de saccharose(figure 1, voir l’étape 9 pour plus de détails).
4. Remplissez une seringue de 30 mL avec ~16 mL de saccharose à 10% (assez pour six gradients), placez-la sur la pompe à seringues et connectez-la à l’aiguille. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue, les tubes et l’aiguille. Essuyez la pointe de l’aiguille pour enlever toute solution résiduelle.
5. Déplacez le stade motorisé vers le haut de telle sorte que la pointe de l’aiguille touche le centre du tube au fond.
6. Réglez la pompe à seringues à un débit de 2 mL/min pour un volume de 2,3 mL.
7. Après avoir distribué 2,3 mL de solution de saccharose à 10 %, descendez le stade motorisé et répétez le processus pour les six gradients.
8. Répétez les étapes 2.4-2.7 pour ajouter la solution de saccharose de 20% au fond des tubes, suivies par 30%, 40% et 50% solutions de saccharose de même.
9. Après la préparation du gradient, sceller le tube d’ultracentrifugeuse à l’aide d’un film de paraffine.
10. Laissez les tubes pendant la nuit à 4 °C de sorte que les différentes couches de saccharose diffusent ensemble pour donner un gradient continu.

3. Dissection tissulaire

REMARQUE : Les souris enceintes ont été euthanasiées par dislocation cervicale précédée par l’anesthésie avec 5% d’isoflurane.

1. Recueillir des embryons de souris CD1 au jour embryonnaire 12, ou d’autres points de temps au besoin, et placer les embryons dans une plaque de Ø 10 cm contenant la solution de sel équilibré (HBSS) de Hank glacé sur la glace pour conserver la viabilité cellulaire.
2. Sous la portée de dissection, transférer un embryon dans une plaque de Ø 6 cm contenant du HBSS glacé.
3. Utilisez des aiguilles de 21 à 23 G pour fixer la position de la tête en pénétrant dans les yeux à un angle d’environ 45 ° et appliquez de la force pour vous assurer que les aiguilles sont fixées sur la plaque (figure 2A).
4. Utilisez des forceps n° 5 pour enlever la peau et le crâne, du milieu aux côtés.
5. Utilisez des forceps pour couper les bulbes olfactifs et enlever les méninges pour exposer les tissus corticals.3.6.Use forceps incurvés pour couper les tissus corticals en 2-3 mL de milieu neurobasal sur la glace (Figure 2B). Mettre en commun les tissus corticals de différents embryons au besoin. Les tissus de 8 à 10 embryons donnent habituellement environ 200 μg d’ARN total.

4. Lyse cellulaire

1. Le jour de la dissection des tissus, préparez un tampon de lyse cellulaire fraîche tel que décrit dans le tableau 2.

solution	Concentration finale	volume
Tris-HCl (pH 7,5)	20 mM	100 μL
Kcl	100 mM	250 μL
MgCl2	5 mM	25 μL
Triton X-100	1% (v/v)	500 μL
Désoxycholate de sodium	0,5% (w/v)	500 μL
Dithiothreitol (TNT)	1 mM	5 μL
Cycloheximide	100 μg/mL	5 μL
RNase eau libre		Recharger jusqu’à 5 mL
total	5 mL	5 mL

Tableau 2 : Préparation du tampon de lyse polysome.

REMARQUE : Compléter le tampon de lyse avec des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.

2. Ajouter le cycloheximide au milieu neurobasal avec des tissus disséqués à une concentration finale de 100 μg/mL et incuber à 37 °C pendant 10 min. Cycloheximide bloque l’allongement de la traduction et, par conséquent, empêche le ruissellement ribosome ¹⁵.
3. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le supernatant.
4. Lavez les tissus deux fois avec du salin tamponné de phosphate glacé (PBS) complété par du cycloheximide de 100 μg/mL.
5. Ajouter 500 μL de tampon de lyse cellulaire complété par 4 μL d’inhibiteur de la RNase. Pipette de haut en bas pour résuspendre le tissu dans le tampon de lyse. Utilisez une aiguille à insuline pour lyser doucement le tissu.
6. Incuber les tissus sur la glace pendant 10 min avec un bref vortex toutes les 2-3 min.
   REMARQUE : Pour prévenir la dégradation des tissus, assurez-vous que toutes les étapes de la lyse tissulaire sont effectuées sur la glace.
7. Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
8. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse sur la glace.
9. Centrifugeuse à ~13 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
10. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse sur la glace.
11. Mesurer la concentration d’ARN dans le lysate tissulaire à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.
    REMARQUE : Si plusieurs échantillons sont inclus dans l’expérience, diluez les échantillons à la même concentration avec un tampon de lyse cellulaire supplémentaire pour minimiser les variations.

5. Chargement de l’échantillon et ultracentrifugation

1. Pré-refroidir le rotor d’ultracentrifugation et les seaux pivotants à 4 °C, et réglez la température de l’ultracentrifugeuse à 4 °C.
2. Gardez 20 μL du lysate tissulaire comme entrée totale d’ARN.
3. Chargez des échantillons (ARN de 50-300 μg avec un volume égal) sur le dessus des gradients de saccharose en distribuant lentement le lysate aux parois des tubes d’ultracentrifugeuse.
4. Placez délicatement les tubes d’ultracentrifugeuse dans le seau à balançoire. Assurez-vous que tous les seaux diamétralement opposés sont équilibrés.
5. Chargez les seaux de balançoire sur le rotor. Réglez l’ultracentrifugeuse à 190 000 x g (~39 000 rpm) à 4 °C pendant 90 min.
6. Placer délicatement les gradients sur la glace après centrifugation.

6. Fractionnement et collecte d’échantillons

REMARQUE : Un système de fractionnement, d’enregistrement et de collecte assemblé à la maison est utilisé pour l’analyse et la collecte d’échantillons à partir des gradients(figure 3, voir composants de l’appareil).

1. Placez un tube d’ultracentrifugeuse vide sur le perceur de tube et pénètrez doucement le tube avec l’aiguille du fond.
2. Allumez le moniteur UV et ouvrez le logiciel d’enregistrement de signaux numériques.
3. Remplissez une seringue de 30 mL avec 25 mL de solution de chasse au saccharose à 60 %. Appuyez doucement sur la seringue de sorte que la solution de chasse remplit le tube vide et passer par le moniteur UV de 254 nm pour définir la ligne de base pour la détection.
4. Appuyez automatiquement sur l’auto-zéro sur le moniteur UV pour enregistrer une ligne de base pour la détection. Appuyez sur jouer sur le logiciel pour commencer l’enregistrement.
5. Une fois que le système établit une ligne de base, mettre en pause l’enregistrement sur le logiciel et rétracter la solution de poursuite. Assurez-vous qu’aucune solution de poursuite résiduelle ne reste dans le système.
   REMARQUE : Rincez le système à l’eau sans RNase pour éliminer les solutions de saccharose résiduelles restantes de la course précédente.
6. Chargez un tube d’échantillon jusqu’au perceur à tubes. Pénétrer doucement le tube avec l’aiguille du fond.
7. Commencez à enregistrer sur le logiciel. Démarrez la pompe à seringues (débit de 1 mL/min pour un volume de 25 mL) et le collecteur de fractions pour recueillir les fractions de polysome. Réglez les paramètres de fractionneur à 30 s.
   REMARQUE : Avant chaque course, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue ou le tube en appuyant doucement sur la seringue pour laisser la solution de chasse couler continuellement à travers l’aiguille.
8. Recueillir les fractions en tubes de 1,5 mL (500 μL chacun) à l’aide d’un collecteur de fractions.
9. Les fractions peuvent être traitées immédiatement ou stockées à -80 °C.
10. Après la collecte des fractions, rincer le système avec de l’eau sans RNase pour enlever tout saccharose résiduel.

7. Extraction de l’ARN

1. À chaque fraction, ajouter 10 ng de luciferase mRNA spike-in contrôle.
2. Ajouter trois volumes de réagencé d’isolement commercial à base d’ARN à base d’hydrocholride de guanidium à chaque fraction.
3. Vortex brièvement pendant 15 s.
4. Extraire l’ARN à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN compatible avec la solution utilisée en 7.2.

8. Transcription inversée et PCR en temps réel

1. Mesurer la concentration de l’ARN à l’aide du spectrophotomètre UV-Vis.
2. Soumettons l’ARN à la transcription inverse à l’aide d’un kit de synthèse cDNA, selon le protocole du fabricant.
3. Utilisez le PCR quantitatif en temps réel (QPCR) pour examiner la distribution polysomale de l’ARNm gapdh à titre d’exemple. qPCR a été réalisé à l’aide d’un système de détection qPCR et d’un réagent mastermix qPCR, avec les conditions de cycle suivantes : 95 °C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 °C pour 15 s, 60 °C pour 30 s, 72 °C pour 40 s, suivis de 95 °C pour 60 s.
4. Obtenez les valeurs du cycle threshold (Ct) à partir des parcelles d’amplification et utilisez-les pour calculer le changement de pli à l’aide de la méthode ΔΔCt.

9. Gradient de saccharose effectuant l’assemblage de système

REMARQUE : Suivez les étapes d’assemblage de chaque composant (tel que décrit dans le tableau 3) du fabricant de gradient saccharose (figure 1).

1. Monter deux supports verticaux (A2) sur la planche à pain de base (A1).
2. Utilisez deux supports minces à angle droit (B2) pour monter l’actionneur de scène linéaire sur la planche à pain de base (A1).
3. Utilisez le setcrew sur le poteau en aluminium Ø12.7 mm (C2) pour le fixer sur la planche à pain de base du support du tube (C1) comme support pour le support du tube.
4. Assemblez l’angle droit Ø1/2 » à la pince post-Ø6 mm (C3) avec le poteau (C2) et le poteau optique de mini-série (C4).
5. Utilisez le setcrew sur le poteau optique (C4) pour connecter une petite pince en V (C5) comme support de tube.
6. Mettez un tube de centrifugeuse dans le support du tube et ajustez l’angle pour le rendre vertical. Marquez la position du tube et montez le porte-poteau du piédestal (C6) sur la planche à pain de base (C1) pour soutenir le tube.
7. De l’autre côté de la planche à pain (A1), utilisez la taille du poteau en aluminium de Ø12,7 mm (D1) pour le fixer et connecter un poteau optique de mini-série (D3) à l’aide d’un angle droit Ø1/2 » à la pince post-Ø6 mm (D2).
8. Connectez la pince en V miniature (D4) à l’aiguille à extrémité émoussée (D5) au poteau (D3). Ajustez l’angle de la pince pour régler l’aiguille verticalement et ajustez la longueur du poteau pour vous assurer que l’aiguille rencontre le tube de centrifugeuse.
9. Connectez l’actionneur (B1) au conducteur du moteur stepper (E1) et utilisez le tableau de contrôle R3 de l’ONU et le module joystick du kit de démarrage de l’ONU (E2) pour contrôler l’actionneur. Un adaptateur de puissance (p. ex., adaptateur de puissance réglable 9-24 V AC/DC) peut être utilisé pour conduire le moteur séparément.
10. Placez la pompe à seringues (F) à côté de la station de fabrication de gradient et connectez la seringue avec l’aiguille.
11. Contrôlez le support du tube de haut en bas à l’aide du joystick.

composant	article
B1 (en)	Actionneur de scène linéaire
E1 (E1)	Conducteur de moteur de stepper
E2 (e2)	Kit de démarrage super projet de l’ONU
A1 (en)	Planche à pain
A2 (en)	Support vertical
B2 (en)	Support mince à angle droit
C1 (C1)	Mini-série planche à pain
C5 (en)	Petite pince en V
D4 (en)	Pince en V miniature
C2 (C2)	Poteau en aluminium de Ø12,7 mm
C4, D3	Mini-série de post optique
D1	Poteau en aluminium de Ø12,7 mm
C3, D2	Angle droit Ø1/2 » à Ø6 mm après pince
C6 (en)	Base de support de poteau de piédestal de mini-série
D5 (en)	Aiguille d’extrémité émoussée
F	Pompe à seringues

Tableau 3 : Gradient making system components.

10. Fractionnement et détection de l’assemblage du système( figure 2).

1. Utilisez une pince rotette à mâchoire ronde régulière pour monter le module optique du moniteur UV sur le perceur de tube. Fixez une extrémité du tube (1 cm de long et 0,56 mm de diamètre interne) au raccordement du perceur de tube et l’autre extrémité au fluide au port du module optique. Connectez le port Fluid Out au fractionneur.
2. Connectez le module optique avec l’unité de commande du moniteur UV selon le manuel du fabricant.
3. Utilisez un câble d’éclatement pour connecter la prise de sortie du signal au convertisseur numérique au sol et les connexions d’entrée analogiques, selon le manuel du fabricant.
4. Connectez le convertisseur numérique à un ordinateur portable à l’aide d’un câble USB ordinaire et enregistrez les signaux numériques convertis à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données.

Résultats

À titre de démonstration, le lysate cortical contenant 75 ARN μg (mis en commun à partir de 8 embryons) a été séparé par le gradient de saccharose en 12 fractions. Pics d’absorption UV à 254 nm fractions identifiées contenant le sous-unité 40S, sous-unité 60S, monosome 80S et polysomes (Figure 4A). Analyse des fractions par tache occidentale pour la grande sous-unité ribosomique, Rpl10 a montré sa présence dans la sous-unité 60S (fraction 3), monosome (fraction 4) et polyso...

Discussion

Le profilage polysome est une technique couramment utilisée et puissante pour évaluer l’état translationnel à la fois au niveau d’un seul gène et à l’échelle du^{génome 14} . Dans ce rapport, nous présentons un protocole de profilage polysome à l’aide d’une plate-forme assemblée à domicile et son application pour analyser le cortex de souris en développement. Cette plate-forme rentable est facile à assembler et à générer des gradients de saccharose robustes et reproductible...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL RNA free microtubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm dish	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G needle	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL syringe	BD	302832
Blunt end needle	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromophenol blue	Sigma	115-39-9
CD1 mouse		Charles River Laboratory
Curved tip forceps	Sigma	#Z168785
Cycloheximide		Sigma	66-81-9
Data acquisition software TracerDAQ	Measurement Computing
Digital converter		Measurement Computing	USB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kit	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 forceps	Sigma	#F6521
Fraction collector	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Linear stage actuator	Rattmmotor	CBX1605-100A
Luciferase control RNA	Promega	L4561
Maxima first strand cDNA synthesis kit	Themo Fisher	M1681
Miniature V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Mini-series breadboard	Thorlabs	MSB7515/M
Mini-series optical post	Thorlabs	MS2R/M
Mini-series pedestal post holder base	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Neurobasal media	Gibco	21103-049
Ø12.7 mm aluminum post	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR green fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Phosphate buffered saline (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Right-angle clamp	Thorlabs	RA90/M
Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
RNase free tips	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
RNase free water	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Slim right-angle bracket	Thorlabs	AB90B/M
Small V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Sodium deoxycholate	Sigma	302-95-4
Stepper motor driver	SongHe	TB6600
Sucrose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Tube piercer	Brandel	BR-184
Ultracentrifuge		Beckman Coulter	L8-70M
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
UNO project super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
UV monitor	Bio-Rad	EM-1 Econo
Vertical bracket	Thorlabs	VB01A/M