نظام في المختبر لقياس فعالية الجلطات من الهستوتريبوسي ودواء لاتيك

Summary

يتم تطوير الولادة اللتيتيكية بمساعدة Histotripsy أو lysotripsy لعلاج تجلط الأوردة العميقة. يتم تقديم إجراء في المختبر هنا لتقييم فعالية هذا العلاج المركب. وتناقش البروتوكولات الرئيسية لنموذج الجلطة، والتوجيه الصورة، وتقييم فعالية العلاج.

Abstract

تجلط الأوردة العميقة (DVT) هو مصدر قلق صحي عالمي. النهج الأساسي لتحقيق إعادة اركان الأوعية للانسدادات الحرجة هو الجلاطات الموجهة بالقسطرة (CDT). للتخفيف من الآثار الجانبية الكاوية ووقت العلاج الطويل المرتبط ب CDT ، يتم تطوير نهج بديلة ومواكبة. أحد هذه النهج هو histotripsy ، وهو علاج بالموجات فوق الصوتية مركزة ل ablate الأنسجة عبر نواة سحابة فقاعة. وقد أظهرت الدراسات ما قبل السريرية التآزر القوي بين الهستوتريبس والجلطات لتدهور الجلطة. يحدد هذا التقرير طريقة على سطح المقعد لتقييم فعالية العلاج بالجلطات بمساعدة الهستوتريبوسي، أو الlysotripsy.

تم إدخال الجلطات المصنعة من الدم الوريدي البشري الطازج إلى قناة تدفق تحاكي أبعادها وخصائصها الميكانيكية الوريدية. تم تغلغل القناة مع البلازما ومنشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة المتشنجة اللتيكية. تم توليد غيوم فقاعة في الجلطة مع مصدر الموجات فوق الصوتية مركزة مصممة لعلاج الجلطات الوريدية الفخذية. واستخدمت المواقع الآلية لترجمة التركيز المصدر على طول الجلطة. في كل موقع إنساق، تم تسجيل الانبعاثات الصوتية من سحابة الفقاعة بشكل سلبي، وتم تشكيلها لتوليد صور التجويف السلبية. وشملت مقاييس لقياس فعالية العلاج فقدان كتلة الجلطة (فعالية العلاج الشاملة)، وتركيزات د-ديمر (انحلال الفيبرينو) والهيموغلوبين (انحلال الدم) في اليرفوسات. هناك قيود على هذا التصميم في المختبر، بما في ذلك عدم وجود وسائل لتقييم الآثار الجانبية في الجسم الحي أو التغيرات الديناميكية في معدل التدفق كما يس جلطة. بشكل عام ، يوفر الإعداد طريقة فعالة لتقييم فعالية الاستراتيجيات القائمة على الهستوتريبس لعلاج DVT.

Introduction

تجلط الدم هو حالة تكوين الجلطة في وعاء دموي صحي يعيق الدورة الدموية^1،2. الجلطات الوريدية لديها تكلفة الرعاية الصحية السنوية من 7-10 مليار دولار، مع 375،000-425،000 حالة في الولايات المتحدة³. الانسداد الرئوي هو انسداد الشريان الرئوي وهو أخطر نتيجة للجلطات الوريدية. المصدر الرئيسي للانسداد الرئوي هو خثرة الأوردة العميقة ، في المقام الأول من الأجزاء الوريدية iliofemoral^4،5،6. تجلط الأوردة العميقة (DVT) له تتمة متأصلة إلى جانب انسداد الرئة ، مع مضاعفات طويلة الأجل تؤدي إلى الألم والتورم وتقرحات الساق وبتر الأطراف^7و8و9. بالنسبة للعقبات الحرجة ، تعد الجلاطات الموجهة للقسطرة (CDT) هي نهج الخط الأمامي لإعادة تهيئة^{الأوعية 10.} تعتمد نتيجة CDT على عدد من العوامل ، بما في ذلك عمر الجلطة ، والموقع ، والحجم ، والتركيب ، والمسببات ، وفئة خطر المريض^11. وعلاوة على ذلك، يرتبط CDT مع تلف الأوعية الدموية، والالتهابات، ومضاعفات النزيف، والعلاج لفترة طويلة¹⁰. تهدف أجهزة الجيل التالي إلى الجمع بين استئصال الجلطات الميكانيكية والجلطات (أي استئصال الجلطات الدوائية)^12و13. استخدام هذه الأجهزة خفض الجرعة الليكية مما يؤدي إلى انخفاض مضاعفات النزيف, وتقصير وقت العلاج^12,13,14 بالمقارنة مع CDT. هذه الأجهزة لا تزال تحتفظ بقضايا الآثار الجانبية النزفية وإزالة غير مكتملة من thrombi المزمن¹⁵. وبالتالي هناك حاجة إلى استراتيجية المساعد التي يمكن إزالة الجلطة تماما مع مضاعفات النزيف أقل.

أحد النهج المحتملة هو العلاج الجلطات بمساعدة histotripsy، ويشار إليها باسم lysotripsy. Histotripsy هو طريقة العلاج غير الغازية التي تستخدم الموجات فوق الصوتية مركزة لنوى فقاعة الغيوم في الأنسجة¹⁶. يتم إنشاء نشاط فقاعة ليس عن طريق نواة خارجية، ولكن عن طريق تطبيق نبضات الموجات فوق الصوتية مع التوتر الكافي لتنشيط النوى الجوهرية للأنسجة، بما في ذلك جلطة^17،18. التذبذب الميكانيكي للسحابة فقاعة يضفي سلالة على الجلطة، وتفكك الهيكل إلى حطام الخلية¹⁹. Histotripsy فقاعة النشاط يوفر تدهور فعال للجلطات الدموية تراجع وغير المسترجعة سواء في الجسم الحي وفي المختبر^20,21,22. وقد أظهرت الدراسات السابقة^23,24 أن الجمع بين الهستوتريبوسي والأنسجة المؤتلفة lytic من نوع المنشط البلازمينوجين (RT-PA) يزيد بشكل كبير من فعالية العلاج بالمقارنة مع الليك وحدها أو histotripsy وحدها. من المفترض أن آليتين أساسيتين مرتبطتين بنشاط فقاعة الهستوتريبسي مسؤولتان عن تحسين فعالية العلاج: 1) زيادة انحلال الألياف الليفية بسبب الولادة اللائية المعززة ، و 2) انحلال الدم لخلايا الدم الحمراء داخل الجلطة. يتكون الجزء الأكبر من كتلة الجلطة من خلايا الدم الحمراء²⁴، وبالتالي ، فإن تتبع تدهور كريات الدم الحمراء هو بديل جيد لاجتثاث العينة. ومن المرجح أيضا أن تتفكك عناصر الجلطة المتشكلة الأخرى تحت نشاط فقاعة الهستوتريبس ولكن لا يتم النظر فيها في هذا البروتوكول.

هنا ، يتم تحديد نهج benchtop لعلاج DVT في المختبر مع lysotripsy. يصف البروتوكول معلمات التشغيل الحرجة لمصدر الهستوتريبس، وتقييم فعالية العلاج، وتوجيه الصورة. ويشمل البروتوكول تصميم قناة تدفق لمحاكاة شريحة وريدية iliofemoral وتصنيع جلطات الدم البشرية الكاملة. يحدد الإجراء التجريبي تحديد موقع مصدر الهستوتريبسي ومجموعة التصوير لتحقيق التعرض الهستوتريبسي على طول الجلطة الموضوعة في قناة التدفق. يتم تعريف معلمات التساين ذات الصلة لتحقيق اضطراب الجلطة وتقليل نشاط الفقاعة خارج الهدف. ويتضح استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية لتوجيه وتقييم نشاط فقاعة²⁴. وترد مقاييس لقياس فعالية العلاج مثل فقدان كتلة الجلطة، د-ديمر (انحلال الفيبرينو)، والهيموغلوبين (انحلال الدم)^{23،24،25،26،27}. بشكل عام ، توفر الدراسة وسيلة فعالة لتنفيذ وتقييم فعالية اليسوتريبس لعلاج DVT.

Protocol

للنتائج المعروضة هنا، تم سحب الدم البشري الوريدي لتشكيل الجلطات بعد موافقة مجلس المراجعة الداخلية المحلية (IRB # 19-1300) والموافقة المستنيرة الخطية المقدمة من المتبرعين المتطوعين²⁴. يحدد هذا القسم بروتوكول تصميم لتقييم فعالية اليسوتريب. ويستند البروتوكول على عمل سابق لبولين^{وآخرون.}

1. جلطة النمذجة

ملاحظة: إعداد الجلطات في غضون 2 أسابيع ولكن أكثر من 3 أيام قبل يوم التجربة لضمان الاستقرار جلطة وتحقيق أقصى قدر من التراجع²⁸. إعداد الجلطة بعد موافقة مجلس المراجعة المؤسسية المحلية.

1. إعداد بوروسيليكات باستور ماصة لتخزين الدم (انظر جدول المواد لمواصفات ماصة). وتستخدم أنابيب Borosilicate بسبب الطبيعة الهيدروفيلية للمادة التي تعزز تنشيط الصفائح الدموية وتراجع جلطة²⁹. ختم غيض من ماصة عن طريق التدفئة على الموقد بونسن.
2. رسم دماء بشرية وريدية جديدة. Aliquot مجموع الدم المسحوبة في 2 مل زيادات لكل جلطة المطلوب. نقل كل 2 مل aliquot إلى ماصة باستور واحد.
   ملاحظة: تنفيذ الخطوة 1.2 في غضون 3 دقائق تقريبا من سحب الدم بحيث لا تجلط الدم قبل نقل إلى ماصة. أيضا، تأكد من أن المتبرع المتطوع ليس على أي أدوية قد تغير سلسلة التخثر (مثل مميعات الدم أو مثبطات الصفائح الدموية).
3. احتضان aliquots الدم داخل ماصة (يساوي عدد الجلطات المطلوبة) في حمام مائي لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.
4. تخزين ماصة لمدة لا تقل عن 3 أيام في 4 درجة مئوية للسماح للتراجع عن الجلطات²⁸. كما تراجع الجلطات، وسوف يلاحظ المصل تتراكم في الجزء العلوي من الجلطة داخل ماصة. استجابة RT-PA من الجلطات لا تزال مستقرة لمدة 2 أسابيع بعد التراجع²⁸.

2. إعداد خزان المياه

1. ملء خزان المياه مع المياه التناضح العكسي. خط السطح السفلي للدبابات مع مادة امتصاص الصوتية للحد من انعكاس العلاج أو التصوير النبضات بالموجات فوق الصوتية. استخدام نظام معالجة المياه لdgas وتصفية المياه لتقليل نواة فقاعة.
   ملاحظة: طريقة واحدة لتصفية المياه باستخدام عامل تصفية مضمن. يتم إعطاء مواصفات الحقيبة المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية في جدول المواد.
2. ضع عنصرين للتدفئة في السطح السفلي للخزان. سخني الماء إلى 37.3 درجة مئوية لتحقيق أقصى نشاط إنزيمي lytic³⁰.
3. إعداد قناة تدفق كما هو موضح في الشكل 1A. تتكون قناة التدفق من أنابيب ، وعاء نموذجي مع خصائص مادية وهندسية ممثلة للوريد iliofemoral ، وخزان للبلازما ، وحقنة على الطرف الأكبر من الخزان (جدول المواد). يتم توصيل المحاقن بمضخة لتنظيم التدفق عبر القناة أثناء التجربة.
4. غمر قناة التدفق يدويا في خزان المياه لجلب القناة إلى درجة الحرارة الفسيولوجية أثناء مرحلة إزالة الغاز / التصفية / التدفئة (الخطوتان 2.1 و 2.2).

3. إعداد البلازما وخليط RT-PA

1. قبل يوم التجربة
   ملاحظة: عند تخزينها في -80 درجة مئوية، البلازما مستقرة لمدة 2.5 سنة على الأقل³¹ و RT-PA مستقرة لمدة 7 سنوات على الأقل³². لذلك، تنفيذ الخطوة 3.1 في أي وقت خلال هذه الفترات لضمان استقرار المكونين.
   1. تمييع RT-PA التي تم الحصول عليها من الشركة المصنعة في شكل مسحوق إلى 1 ملغم / مل في الماء العقيم.
   2. Aliquot 100 ميكرولتر من المخفف RT-PA في أنابيب الطرد المركزي 0.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
   3. Aliquot 35 مل من الإنسان الطازج المجمدة نوع O البلازما في أنابيب الطرد المركزي 50 مل. تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية.
2. في يوم التجربة
   1. استرداد أليكوتس البلازما من الثلاجة. استرداد العديد من aliquots كما عدد من الجلطات ليتم اختبارها في ذلك اليوم. تزج aliquots المجمدة في حمام مائي في 37 درجة مئوية لذوبان (~ 10 دقيقة).
   2. بمجرد إذابة البلازما، صبها في كوب يتم شطفه ثلاث مرة بالماء فائق النبور. تغطية طفيفة فم الكأس مع رقائق الألومنيوم لمنع التلوث ووضع الكأس في حمام الماء. السماح احباط لتكون فضفاضة بما فيه الكفاية للسماح للهواء للاتصال البلازما.
   3. السماح توازن البلازما في 37 درجة مئوية للضغط الجوي لمدة 2 ساعة على الأقل.
   4. أخرج قنينات RT-PA المجمدة وضعها على الجليد حتى الحاجة، مع قارورة واحدة لكل تجربة تشغيل.
   5. جعل agarose هلام منخفضة (2٪) في قارورة 50 مل، عن طريق حل الآغاروز في المياه فائقة البور. اختر الكمية الإجمالية من محلول الآغاروز بحيث يتوفر ما يقرب من 2 مل لكل عينة يتم تحليلها. سخني المحلول في قارورة في ميكروويف حتى يصبح شمبانيا. تأمين قارورة مع غطاء المسمار للماء على ذلك. غمر القارورة في حمام الماء جنبا إلى جنب مع البلازما.
      ملاحظة: تضمن هذه الخطوة توفر الآغاروز لتأمين شرائح الجلطة المكشوفة لتحليل الأنسجة بعد التكشير الهستوتريبوسي.

4. إعداد مصدر histotripsy ومجموعة التصوير

1. تأكد من إمكانية التحكم في المواضع الآلية من بيئة وقت التشغيل في نظام برمجة أساسي، باستخدام الاتجاهات والأوامر المقدمة من الشركة المصنعة. تحقق من أن محركات النظام متصلة بالمنفذ المناسب للكمبيوتر مع بيئة وقت التشغيل.
2. جبل مصدر histotripsy على نظام تحديد المواقع الآلية كما هو مبين في الشكل 1B.
3. قم بتوصيل مصدر الهستوتريبنسي بالإلكترونيات الدافعة (مثل مكبر الصوت ومولد الوظائف) عبر الموصلات المناسبة (مثل كابلات BNC) كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة.
   ملاحظة: تأكد من أنه يمكن التحكم في الالكترونيات القيادة من مصدر histotripsy عبر بيئة وقت التشغيل المستخدمة في الخطوة 4.1.
4. تغطية مجموعة التصوير مع غطاء التحقيق ولصق الصفيف متحد المحور في فتحة مصدر histotripsy كما هو مبين في الشكل 2. تأكد من فهم اتجاه الطائرة التصوير بالنسبة إلى اتجاه مصدر histotripsy.
5. قم بتوصيل صفيف التصوير بنظام المسح بالموجات فوق الصوتية. تأكد من أن هذا النظام يمكن التحكم في تشغيل وتشغيل صفيف التصوير، وجمع بيانات التصوير، وفقا للأوامر المقدمة من قبل الشركة المصنعة للماسح الضوئي.
6. غمر المصدر histotripsy / مجموعة التصوير في الخزان في حين degassing كما هو مبين في الشكل 1A. إزالة بلطف أي فقاعات الهواء باستخدام حقنة من سطح مصدر histotripsy أو مجموعة التصوير.
   ملاحظة: تزج مصدر histotripsy ومجموعة التصوير تماما في الماء قبل العملية. تجنب لمس سطح مصدر الهستوتريبسي.
7. الحصول على صور الوضع B بمعدل 20 إطارا في الثانية باستخدام صفيف التصوير والأوامر المضمنة للماسح الضوئي. ضبط نافذة التصوير لضمان التصور من التركيز من مصدر histotripsy في هذه الصور في الوقت الحقيقي.
   ملاحظة: من المفترض أن أبعاد المنطقة المحورية للمصدر العلاجي معروفة.
8. تعيين معلمات التشغيل لمصدر histotripsy، بما في ذلك التردد الأساسي (على سبيل المثال، 1.5 ميغاهرتز)، وتردد تكرار النبض (على سبيل المثال، 20-100 هرتز)، ومدة النبض (على سبيل المثال، 1-20 دورة لكل نبضة)، والعدد الإجمالي للبقول لكل موقع (على سبيل المثال، 100-2000)^{18و23و24و33.} تعديل هذه المعلمات إذا لم يتحقق تحلل تجلط كافية أو إذا كان النشاط فقاعة يمتد إلى ما وراء تجويف السفينة نموذج. لتعيين هذه المعلمات، استخدم البروتوكول الذي توفره الشركة المصنعة للمصدر أو استخدم منصة برمجة يمكنها الاتصال بالمصدر (الخطوة 4.3).
9. باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة أو منصة البرمجة المستخدمة في الخطوة 4.8، تشغيل مصدر histotripsy في المعلمات مجموعة في المياه degassed فقط، دون أي عرقلة في البيئة المحيطة بها. زيادة الجهد المطبق على مصدر histotripsy حتى يتم تشكيل سحابة فقاعة.
10. باستخدام التصوير في الوقت الحقيقي للخطوة 4.7، قم بضبط موضع صفيف التصوير داخل فتحة محول الكونفوجال حتى تقع سحابة الفقاعة تقريبا في وسط نافذة الصورة. سحابة الفقاعة هي منطقة بكسل hyperechoic في الطائرة التصوير (الشكل 3). تشديد مسامير لعقد مجموعة التصوير بقوة في افتتاح محول.
    ملاحظة: إذا تمت محاذاة الصفيف بشكل صحيح، يجب أن يكون موضع azimuthal سحابة الفقاعة تقريبا في 0 مم في مستوى التصوير. قد تظهر مجموعة التصوير قليلا من السطح الداخلي لمصدر العلاج ، وبالتالي قد يختلف موضع نطاق سحابة الفقاعة عن البعد البؤري للمصدر.
11. تحديد موقع سحابة الفقاعة في مستوى التصوير. تعيين التركيز من مصدر histotripsy كمركز سحابة فقاعة (الشكل 3).
12. سجل الموقع البؤري المكتشف (الخطوة 4.11) في إطار التصوير(الشكل 3). وهناك طريقة ممكنة لوضع علامة على الموضع البؤري هو وضع مؤشر لملاحظة الموقع في إطار التصوير ، إذا كان متاحا مع منصة التصوير.
13. وقف الرنانة وتعيين الجهد المطبق على مصدر histotripsy إلى 0 V.

5. إعداد جلطة

1. إزالة الجلطة من ماصة عن طريق قطع نهاية مختومة مع كماشة. دع الجلطة تنزلق إلى طبق بيتري جنبا إلى جنب مع المصل. إذا لم تطرد الجلطة، فاضغط بلطف من الطرف الآخر من المصصة عن طريق تدفق ملحي لإزالة الجلطة.
2. قطع الجلطة إلى 1 سم طول باستخدام مشرط، تهدف إلى قطعة موحدة من المركز (أي، بعيدا عن أجزاء من الجلطة التي تشكلت في الجزء العلوي أو السفلي من ماصة).
3. استخدمي مسحة تنظيف لمسح مقطع قطع الجلطة برفق لإزالة السوائل الزائدة.
4. باستخدام ملاقط، ضع قسم الجلطة برفق على مقياس الوزن وسجل الوزن.
5. رفع قناة التدفق يدويا من خزان المياه وإزالة السفينة النموذجية من قناة التدفق.
6. ضع الجلطة في وعاء النموذج باستخدام ملاقط وإرفاق السفينة النموذجية مرة أخرى بقناة التدفق.
   ملاحظة: يمكن وضع قضيب نايلون داخل السفينة النموذجية لمنع الجلطة من التحرك في المصب بسبب التدفق.
7. خفض قناة التدفق إلى الخزان بطريقة أن نهاية قريبة من المرحلة بالنسبة للخزان منخفضة بالمقارنة مع الجانب البعيدة. الصيد من المرحلة بهذه الطريقة يمنع محاصرة فقاعات في السفينة نموذج عندما يتم رسم البلازما من خلال قناة تدفق في الخطوة 6.1.
8. أضف 30 مل من البلازما إلى الخزان باستخدام ماصة وراقب درجة الحرارة حتى تصل إلى 36 درجة مئوية على الأقل.
9. استخدام ماصة للاستغناء عن RT-PA (80.4 ميكروغرام في 30 مل من البلازما, 2.68 ميكروغرام / مل) في خزان البلازما. تحريك البلازما مع ماصة لضمان توزيع RT-PA موحدة داخل الخزان.

6. فتيلة قناة تدفق

1. رسم البلازما في قناة تدفق من الخزان عن طريق مضخة حقنة حتى البلازما يملأ السفينة نموذج.
   ملاحظة: إذا لم يتم تدفق الجلطة مع قضيب النايلون، استخدم مضخة قصيرة توجه في 60 مل / دقيقة في محاولة لإجبار البلازما المصب الجلطة أو رسم يدويا من خلال الحقنة. الحد من كمية البلازما المسحوبة في هذه العملية أو إعادة ملء الخزان باستخدام البلازما / RT-PA إضافية لضمان 30 مل من الحل في قناة التدفق.
2. باستخدام المواضع الآلية، قم بمحاذاة صفيف التصوير الموازي لطول الجلطة باستخدام برنامج التصوير النصي (الخطوة 4.7). المحاذاة المتوازية تمكن المستخدم من ضمان بصريا الموضع السليم للتجلط وعدم وجود فقاعات داخل السفينة نموذج.
3. قم بتسوية وعاء النموذج يدويا وبصرا لضمان عدم وجود فقاعات هوائية باستخدام نافذة التصوير (الخطوة 4.7).

7. إجراء التجربة

1. العلاج قبل العلاج
   ملاحظة: هذه الخطوة هي لتخطيط مسار المصدر histotripsy / مجموعة التصوير للتعرض histotripsy موحدة على طول جلطة.
   1. قم بمحاذاة صفيف التصوير باستخدام المواضع الآلية بحيث تكون مستوي التصوير موازيا للمقطع العرضي للجلطة (أي عمودي على الاتجاه الموضح في الخطوة 6.2).
   2. تحت التوجيه عبر نافذة التصوير (الخطوة 4.7)، نقل مصدر الهستوتريبسي إلى الطرف القريب من الجلطة نسبة إلى الخزان باستخدام المواقع الآلية. عند هذه النقطة، ضبط موقف مصدر histotripsy بحيث نقطة محورية ملحوظ في الخطوة 4.12 محاذاة مع مركز الجلطة.
   3. تحديد مسار الرنانة على طول الجلطة. لتحديد هذا المسار، حدد ثلاث نقاط طريق على طول الجلطة (أي مواقع المحركات حيث يتم احتواء نشاط فقاعة الهستوتريبس داخل الجلطة) بزيادات 5 مم. محاذاة نقاط الطريق بحيث يكون الحركة الإجمالية لمصدر الهستوتريبسي على طول المسار متبقة مع تدفق في النظام (أي أن نقطة الطريق الأولى هي في الطرف الأقرب من الجلطة بالنسبة للخزان ، ونقطة الطريق الثالثة هي في الموضع البعيدة بالنسبة للخزان).
   4. قبل وضع اللمسات الأخيرة على كل نقطة اتجاه، نبضات اختبار النار من مصدر الهستوتريبسي مع نفس معلمات التسجم مثل الخطوة 4.8 ولكن تقليل التعرض الكلي لنبضات مجموع 10. ضبط موقف مصدر histotripsy باستخدام الموضعيات الآلية إذا لزم الأمر، لاحتواء نشاط فقاعة داخل الجلطة.
   5. عند كل نقطة، احفظ المواضع الحركية باستخدام الأوامر التي توفرها الشركة المصنعة، على غرار الخطوة 4.1.
2. العلاج
   ملاحظة: تحدد هذه الخطوة الإجراء لعلاج الجلطة بطولها وفقا للمسار المحدد في خطوة ما قبل العلاج.
   1. تشغيل مضخة حقنة في 0.65 مل / دقيقة وانتظر الغضروف المفصلي للبلازما للتحرك. هذا معدل تدفق يحاكي انسداد شبه كامل من الأوعية الدموية iliofemoral^24،34.
   2. إعادة تحديد المسار الذي تم إنشاؤه في الخطوة 7.1.3 مع خطوات متوسطة بين نقاط الطريق المحددة بحجم خطوة ثابت (على سبيل المثال، 0.5 مم). يتم اختيار حجم الخطوة ليكون أصغر من نصف عرض المنطقة البؤرية كما يقاس على طول الجلطة (الاتجاه الارتفاعي لمجموعة التصوير). نقل مصدر histotripsy باستخدام المواقع الآلية في كل موقع مسار مع معلمات التساوق المحددة في الخطوة 4.8.
   3. رصد / نشاط فقاعة الصورة أثناء تطبيق نبض histotripsy في كل موقع المسار باستخدام إطار التصوير (الخطوة 4.7). مركز الصورة على التركيز histotripsy مع أبعاد الصورة التي تغطي 15 ملم في السمت والمدى. قبل تطبيق نبض histotripsy في كل موقع، والحصول على صورة وضع B لتوفير التصور للجلطة ونموذج السفينة، من خلال إنشاء سيناريو في منصة البرمجة. تأكد من أن البرنامج النصي يؤسس الاتصال مع الماسح الضوئي باستخدام أوامر الشركة المصنعة.
   4. أثناء تطبيق نبض histotripsy، تنفيذ اقتناء الانبعاثات الصوتية في السيناريو في الخطوة 7.2.3 لتشكيل صور التجويف السلبي بعد مخصص³⁵. الحصول على صورة واحدة التجويف السلبي بعد كل 10 نبضات العلاج. تطبيق تعويض كسب الوقت شقة من 50 في 8 أعماق تدريجية حتى نهاية عمق التصوير. اختيار حجم نافذة اقتناء مناسبة بحيث يتم التقاط إشارة كاملة من جلطة مع الحد الأدنى من فقدان الطاقة بسبب النوافذ³⁵.
   5. إذا كانت السحب الفقاعة خارج الهدف موجودة، قم بضبط موضع المحول في الموقع مع الموضعيات الآلية.
      ملاحظة: مراقبة مشغلات غاب عن صفيف التصوير. ضبط عدد مجموعات بيانات التصوير المكتسبة لضمان اكتمال تخزين البيانات قبل التشغيل اللاحق.

8. إجراء ما بعد التجربة

1. رفع يدويا السفينة نموذج للخروج من خزان المياه لاستنزاف perfusate عن طريق الجاذبية. تأكد من الحفاظ على قناة تدفق تعادل لمنع الجلطة من التحرك المصب والخروج من السفينة نموذج أثناء استنزاف.
2. جمع perfusate كامل لمزيد من التحليل في كوب صغير (الشكل 4A) عن طريق رسم محلول البلازما من قناة تدفق من خلال مضخة حقنة بمعدل تدفق منخفض جدا.
3. قطع السفينة نموذج وإزالة الجلطة. إذا لزم الأمر، حقن كمية صغيرة من المالحة في وعاء نموذج لطرد بلطف الجلطة.
4. مسح الجلطة مماثلة للخطوة 1.2.3. وزن الجلطة على مقياس الوزن لتقييم فقدان كتلة الجلطة.
5. لتحليل محتوى D-dimer، أضف 100 ملغ من حمض أمينوكابرويك إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق يليه 1 مل من البيرفوسات، واخلط جيدا باستخدام ماصة. إجراء اختبار اللاتكس المناعي turbidimetric لقياس مد دي ديتر داخل العينة³⁶.
6. لتقييم انحلال الهيمولي، أضف 1 مل من التشوه إلى أنابيب الطرد المركزي وتدور بسرعة 610 × جم (3500 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق. اجمع 0.5 مل من الناموست الفائق (ركز) مع 0.5 مل من محلول درابكينز ودع الخليط يستريح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. نقل 200 ميكرولتر إلى لوحات البئر، كما هو مبين في الشكل 4B. استخدام قارئ لوحة لقراءة امتصاص في 540 نانومتر، الشكل 4C (Drabkins المقايسة³⁷).
7. تقييم الأنسجة
   1. قطع قسم من وسط جلطة من حوالي 2-3 ملم في الطول مع مشرط.
   2. أضف المقطع إلى شريط كاسيت. الحفاظ على اتجاه القسم بالنسبة إلى اتجاه انتشار نبض الهستوتريبسي.
   3. إضافة 2 مل من محلول agarose gelling منخفضة أعدت في الخطوة 3.2.5 في كاسيت لإصلاح الجلطة في مكان.
   4. إصلاح العينة في 10٪ الفورماتين لمدة 24 ساعة. وضع العينة في 70٪ الكحول بعد 24 ح وأداء معيار hemotoxylin-eosin^{تلطيخ 38}.

9. تحليل صورة التجويف السلبي

1. معالجة الإشارات المكتسبة من صفيف التصوير أثناء الإثارة histotripsy (الخطوة 7.2.4) باستخدام خوارزمية تستند إلى شعاع كابون^{قوية 39} لخلق صورة من الانبعاثات الصوتية التي تولدها سحابة فقاعة في كل موقع العلاج.
   ملاحظة: لإنشاء صور كمية، اتبع الخطوات الموضحة في هاوورث^{وآخرون.} وإلا، يجب أن تمثل كل قيمة بكسل في الصورة الطاقة الصوتية سحابة فقاعة النسبية (وحدات من V²⁾في كل موقع المقابلة.
2. قطع صورة الوضع B التي تم طلها في الخطوات 7.2.3 للتمييز بين وحدات البكسل التي تمثل الجلطة ووعاء النموذج.
3. شارك في تسجيل صورة التجويف السلبي مع صورة وضع B كما هو موضح في الشكل 5B. تلخيص الطاقة الصوتية داخل الجلطة خلال فترة التعرض³⁵.

النتائج

يسلط البروتوكول المبين في هذه الدراسة الضوء على تفاصيل نمذجة الجلطة الوريدية ، والlysotripsy لتعطيل الجلطة ، والتصوير بالموجات فوق الصوتية في إعداد المختبر ل DVT. يوضح الإجراء المعتمد الخطوات اللازمة لتقييم اضطراب الجلطة بسبب الآثار المشتركة لنشاط سحابة الفقاعة rt-PA والهستوتريب. تم تصميم إعداد...

Discussion

ويقدم البروتوكول المقترح نموذجا لتحديد فعالية العلاج من اليسوتريبس. 10- وفي حين نوقشت التفاصيل الرئيسية، هناك جوانب حاسمة معينة ينبغي النظر فيها لنجاح هذا البروتوكول. النشاط الأنزيمي من RT-PA لديه الاعتماد على درجة حرارة أرهينيوس³⁰. درجة الحرارة هي أيضا عامل مساهم في سرعة الصوت ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing sheets	Precision acoustics	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes	Fisher Scientific	1367820A	14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL capacity
Drabkin's assay	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Draw syringe	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Filter bags	McMaster-Carr	5162K111	Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing	McMaster-Carr	5154K25	Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements	Won Brothers	HT 300 Titanium	Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array	Verasonics	L11-5v	128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose	Millipore Sigma	A9414
Model vessel	McMaster-Carr	5234K98	6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma frozen within 24 hours
Plate reader	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	For haemoglobin quantification
Probe cover	Civco	610-362
Programming platform	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservoir	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Syringe pump	Cole-Parmer	EW-74900-20	pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer	In-house customized		Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system	Verasonics		Vantage Research Ultrasound System
Water tank	Advanced acrylics	C133	14 x 14 x 12, 1/2"