מערכת במבחנה לאמוד את היעילות התרומבוליטית של היסטוטרפסיה וסם ליטיק

Summary

לידה ליטית בסיוע היסטוטרפסיה או ליזוזטריפסיה נמצאת בפיתוח לטיפול פקקת ורידים עמוקים. הליך במבחנה מוצג כאן כדי להעריך את היעילות של טיפול משולב זה. פרוטוקולים מרכזיים עבור מודל קריש דם, הדרכת תמונה, והערכה של יעילות הטיפול נדונים.

Abstract

פקקת ורידים עמוקים (DVT) היא דאגה בריאותית עולמית. הגישה העיקרית להשגת recanalization כלי עבור חסימות קריטיות היא תרומבוליטיקה מכוונת צנתר (CDT). כדי למתן את תופעות הלוואי הקאוסטית ואת זמן הטיפול הארוך הקשורים CDT, אדג'ובנט וגישות חלופיות נמצאים בפיתוח. גישה אחת כזו היא היסטומטרפסיה, טיפול אולטרסאונד ממוקד כדי לנפח רקמה באמצעות התגרענות ענן בועה. מחקרים פרה-קליניים הראו סינרגיה חזקה בין היסטוטרפסיה וטרומבוליטיקה להשפלת קריש. דו"ח זה מתאר שיטת ספסל כדי להעריך את היעילות של טיפול תרומבוליטי בסיוע היסטוטרפסיה, או ליזוזטריפסיה.

קרישי דם המיוצרים מדם ורידים אנושי טרי הוכנסו לערוץ זרימה שמידותיו ומאפייניו האקוסטו-מכניים מחקים וריד איליו-פיומורלי. הערוץ היה מנוטרל בפלזמה ובמפעיל פלסמינוגן מסוג רקמה ליטית. ענני בועה נוצרו קריש עם מקור אולטרסאונד ממוקד המיועד לטיפול של קרישי וריד הירך. מיצובים ממונעים שימשו לתרגום מוקד המקור לאורך אורך הקריש. בכל מיקום הסתה, פליטות אקוסטיות מענן הבועה תועדו באופן פסיבי, וצורת קרן כדי ליצור תמונות cavitation פסיביות. מדדים לאמוד יעילות הטיפול כללו אובדן מסת קריש (יעילות הטיפול הכוללת), ואת הריכוזים של D-dimer (פיברינוליזה) והמוגלובין (המוליזה) ב perfusate. ישנן מגבלות על עיצוב במבחנה זו, כולל חוסר אמצעים להעריך תופעות לוואי vivo או שינויים דינמיים בקצב הזרימה כמו ליס קריש. בסך הכל, ההתקנה מספקת שיטה יעילה להערכת היעילות של אסטרטגיות מבוססות היסטוטריפסיה לטיפול ב- DVT.

Introduction

פקקת היא מצב של היווצרות קריש בכלי דם בריא אחרת שחוסם את זרימת הדם^1,2. תרומבואמבוליזם ורידים יש עלות בריאות שנתית של $7-10 מיליארד, עם 375,000-425,000 מקרים בארצות הברית³. תסחיף ריאתי הוא חסימה של עורק הריאות והוא התוצאה החמורה ביותר של תרומבואמבוליזם ורידים. המקור העיקרי לחסימת ריאות הוא תרומבי וריד עמוק, בעיקר מקטעים ורידיים iliofemoral^4,5,6. פקקת ורידים עמוקים (DVT) יש sequela אינהרנטי מלבד חסימות ריאות, עם סיבוכים לטווח ארוך שגורמים לכאב, נפיחות, כיבים ברגל, קטיעות גפיים^7,8,9. עבור מכשולים קריטיים, תרומבוליטיקה מכוונת קטטר (CDT) הם הגישה החזיתית עבור recanalization כלי¹⁰. התוצאה של CDT תלויה במספר גורמים, כולל גיל תרומבוס, מיקום, גודל, הרכב, אטיולוגיה, וקטגוריה סיכון המטופל¹¹. יתר על כן, CDT קשורה נזק לכלי הדם, זיהומים, סיבוכים דימום, וזמן טיפול ארוך¹⁰. התקנים הדור הבא שואפים לשלב פקקת מכנית עם תרומבוליטיקה (כלומר, פקקת פרמקומכנית)^12,13. השימוש במכשירים אלה להוריד את המינון lytic המוביל סיבוכים דימום מופחת, וקיצר את זמן הטיפול^12,13,14 בהשוואה CDT. התקנים אלה עדיין לשמור על בעיות של תופעות לוואי דימומיות והסרה חלקית של תרומבי כרוני¹⁵. אסטרטגיה אדג'ובנטית ולכן יש צורך שיכול להסיר את פקקת לחלוטין עם סיבוכים דימום נמוך יותר.

גישה פוטנציאלית אחת היא טיפול תרומבוליטי בסיוע היסטוטרפסיה, המכונה ליזוטריפסיה. היסטוטריפסיה היא שיטות טיפול לא פולשניות המשתמשת באולטרסאונד ממוקד כדי לגרעין ענני בועה ברקמות¹⁶. פעילות הבועה נוצרת לא באמצעות גרעינים אקסוגניים, אלא על ידי יישום של פולסים אולטרסאונד עם מתח מספיק כדי להפעיל גרעינים מהותיים לרקמות, כולל קריש^17,18. התנודה המכנית של ענן הבועה מקנה מאמץ לקריש הדם, מתפוררת את המבנה לפסולת אסלורית¹⁹. פעילות בועת היסטוטרפסיה מספקת השפלה יעילה של קרישי דם נסוגים ובלתי מתמשכים הן ב- vivo והן במבחנה^20,21,22. מחקרים קודמים הראו^כי השילוב של היסטוטריפסיה ופעיל פלסמינוגן מסוג רקמה ליטית (rt-PA) מגביר באופן משמעותי את יעילות הטיפול בהשוואה ליטיק לבד או היסטוטריפסיה בלבד. ההשערה היא כי שני מנגנונים עיקריים הקשורים לפעילות בועת היסטוטרפסיה אחראים על יעילות הטיפול המשופרת: 1) פיברינוליזה מוגברת עקב מסירת ליטיק משופרת, ו -2) המוליזה של תאי דם אדומים בתוך הקריש. עיקר מסת קריש מורכב מתאי דם אדומים²⁴, ולכן, מעקב אחר השפלת אריתרוציטים היא תחליף טוב עבור אבלציה של המדגם. אלמנטים אחרים נוצר קריש הם גם צפויים להתפורר תחת פעילות בועת היסטוטרפסיה אבל אינם נחשבים בפרוטוקול זה.

כאן, גישה benchtop לטיפול DVT במבחנה עם ליזוזטריפסיה הוא מתואר. הפרוטוקול מתאר פרמטרי הפעלה קריטיים של מקור היסטוטריפסיה, הערכת יעילות הטיפול והדרכה בתמונה. הפרוטוקול כולל תכנון ערוץ זרימה כדי לחקות קטע ורידים iliofemoral וייצור קרישי דם שלמים אנושיים. ההליך הניסיוני מתאר את המיקום של מקור היסטוטרפסיה ומערך הדמיה כדי להשיג חשיפה היסטוטרפסיה לאורך הקריש להציב בערוץ הזרימה. מוגדרים פרמטרי אינסונציה רלוונטיים להשגת הפרעות קריש ולמזער פעילות בועת מחוץ למטרה. השימוש בהדמיית אולטרסאונד להדרכה והערכה של פעילות הבועה מאויר²⁴. מדדים לכימות יעילות הטיפול כגון אובדן מסת קריש דם, D-dimer (פיברינוליזה) ומוגלובין (המוליזה) מפורטים^{23,24,25,26,27}. בסך הכל, המחקר מספק אמצעי יעיל לביצוע והערכה של היעילות של ליזוזטריפסיה לטיפול ב- DVT.

Protocol

לתוצאות המוצגות כאן, דם אנושי ורידי נמשך כדי ליצור קרישי דם לאחר אישור ועדת הבדיקה הפנימית המקומית (IRB #19-1300) והסכמה מדעת בכתב הניתנת על ידי תורמים מתנדבים²⁴. סעיף זה מתאר פרוטוקול עיצוב להערכת יעילות ליזוזטריפסיה. הפרוטוקול מבוסס על עבודה קודמת של בולן ואח^'24.

1. דוגמנות קריש

הערה: הכן את קרישי הדם בתוך 2 שבועות אבל יותר מ 3 ימים לפני יום הניסוי כדי להבטיח יציבות קריש למקסם את^{נסיגה 28}. הכן את קריש הדם לאחר אישור ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכן פיפטת פסטר בורוסיליקט לאחסון הדם (ראה טבלת חומרים למפרט של הפיפטה). צינורות Borosilicate משמשים בגלל האופי ההידרופילי של החומר אשר מקדם הפעלת טסיות דם ונסיגה קריש²⁹. לאטום את קצה הפיפטה באמצעות חימום מעל מבער בונזן.
2. לצייר דם ורידים אנושי טרי. Aliquot סך הדם נמשך במרווחים 2 מ"ל לכל קריש הרצוי. העבירו כל 2 מ"ל אליקווט לפיפטה פסטר אחת.
   הערה: בצע את שלב 1.2 בתוך כ 3 דקות של בדיקת דם, כך הדם לא קריש לפני המעבר pipettes. כמו כן, ודא התורם המתנדב אינו על תרופות שעשויות לשנות את מפל קרישה (למשל מדללי דם או מעכבי טסיות דם).
3. לדגור על עליות הדם בתוך פיפטות (שווה למספר קרישי הדם הנדרשים) באמבט מים במשך 3 שעות ב 37 °C (50 °F).
4. לאחסן את pipettes במשך מינימום של 3 ימים ב 4 °C (55 °F) כדי לאפשר נסיגה של קרישי דם²⁸. כמו קרישי לסגת, סרום יהיה נצפה לצבור בחלק העליון של קריש בתוך pipette. תגובת RT-PA של קרישי דם נשאר יציב במשך שבועיים לאחר^{נסיגה 28}.

2. הכנת מיכלי מים

1. מלא את מיכל המים במי אוסמוזה הפוכים. קו המשטח התחתון של הטנק עם חומר סופג אקוסטי כדי להפחית את ההשתקפות של טיפול או הדמיה פולסים אולטרסאונד. השתמש במערכת טיפול במים כדי degas ולסנן את המים כדי למזער גרעיני בועה.
   הערה: דרך אחת לסנן את המים היא שימוש במסנן מוטבע. המפרטים של התיק המשמש להפקת התוצאות הייצוגיות ניתנים בטבלת החומרים.
2. מניחים שני גופי חימום על המשטח התחתון של המיכל. מחממים את המים ל 37 °C (37 °F) כדי להשיג את הפעילות אנזימטית lytic המרבי³⁰.
3. הגדר ערוץ זרימה כפי שמוצג באיור 1A. ערוץ הזרימה מורכב צינורות, כלי מודל עם תכונות חומריות וגיאומטריות המייצגות וריד איליופומורלי, מאגר לפלסמה ומזרק בקצה הדיסטלי ביותר של המאגר (שולחן חומרים). המזרק מחובר למשאבה כדי לווסת זרימה דרך הערוץ במהלך הניסוי.
4. הטביעו ידנית את תעלת הזרימה במיכל המים כדי להביא את הערוץ לטמפרטורה פיזיולוגית במהלך שלב הסילוק/סינון/חימום (שלבים 2.1 ו-2.2).

3. הכנת תערובת פלזמה ו- RT-PA

1. לפני יום הניסוי
   הערה: כאשר מאוחסן ב -80 °C (80 °F), פלזמה יציבה לפחות 2.5 שנים³¹ ו rt-PA יציב לפחות 7 שנים³². לכן, בצע את שלב 3.1 בכל עת בתקופות אלה כדי להבטיח יציבות של שני הרכיבים.
   1. לדלל את rt-PA המתקבל מיצרן בצורת אבקה ל 1 מ"ג / מ"ל במים סטריליים.
   2. Aliquot 100 μL של rt-PA מדולל לתוך צינורות צנטריפוגות 0.5 מ"ל ולאחסן אותם ב -80 °C (50 °F).
   3. Aliquot 35 מ"ל של אדם טרי קפוא סוג O פלזמה ב 50 mL צינורות צנטריפוגות. לאחסן את הצינורות ב -80 °C (50 °F).
2. ביום הניסוי
   1. לאחזר aliquots פלזמה מהמקפיא. לאחזר aliquots רבים כמו מספר קרישי הדם להיבדק באותו יום. לטבול את aliquots קפוא באמבט מים ב 37 °C (37 °F) כדי להפשיר (~ 10 דקות).
   2. לאחר שהפלזמה הפשיר, יוצקים אותו לתוך כי הוא שטף טריפ עם מים אולטרה pure. מכסים קלות את פיו של הכיס בנייר אלומיניום כדי למנוע זיהום ומניחים את הכיס באמבט המים. אפשר רדיד אלומיניום להיות רופף מספיק כדי לאפשר לאוויר ליצור קשר עם הפלזמה.
   3. תן פלזמה שיווי משקל ב 37 °C ללחץ אטמוספרי לפחות 2 שעות.
   4. מוציאים את בקבוקוני RT-PA הקפואים ומניחים על הקרח עד הצורך, עם בקבוקון אחד לכל ניסוי.
   5. הפוך אגרוז ג'ל נמוך (2%) בבקבוק 50 מ"ל, על ידי המסת אגרוז במים אולטרה-דור. בחר את הכמות הכוללת של פתרון agarose כך כ 2 מ"ל זמין עבור כל דגימה להיות מנותח. מחממים את התערפס בבקבוקון במיקרוגל עד לקבלת מבעבע. אבטחו את הבקבוקון עם מכסה בורג עמיד למים עליו. תטביעו את הבקבוקון באמבט המים לצד הפלזמה.
      הערה: שלב זה מבטיח agarose זמין לאבטחת מקטעי קריש חשוף לניתוח היסטולוגיה בעקבות היסטוטרפסיה הסנסונציה.

4. הגדרת מקור היסטוטריפסיה ומערך הדמיה

1. ודא שניתן לשלוט במיצבים הממונעים מסביבת זמן הריצה של פלטפורמת תיכנות, באמצעות הוראות הגעה ופקודות שסופקו על-ידי היצרן. ודא שהמנועים של המערכת מחוברים ליציאה המתאימה של המחשב עם סביבת זמן הריצה.
2. הר את מקור ההיסטוטריפסיה במערכת המיקום הממונע כפי שמוצג באיור 1B.
3. חבר את מקור ההיסטוטריפסיה לאלקטרוניקה המניעה שלו (למשל, מגבר הספק ומחולל פונקציות) באמצעות המחברים המתאימים (למשל, כבלי BNC) כפי שצוין על-ידי היצרן.
   הערה: ודא שניתן לשלוט באלקטרוניקה המניעה של מקור היסטוטריפסיה באמצעות סביבת זמן הריצה המשמשת בשלב 4.1.
4. כסו את מערך ההדמיה בכיסוי בדיקה והדביקו את המערך באופן קואקסיאלי בצמצם מקור היסטוטריפסיה כפי שמוצג באיור 2. הקפד להבין את הכיוון של מישור ההדמיה ביחס לכיוון של מקור היסטוטריפסיה.
5. חבר את מערך ההדמיה למערכת סריקת אולטרסאונד. ודא שמערכת זו יכולה לשלוט בפעולה ובהפעלה של מערך ההדמיה ולאסוף נתוני הדמיה, בהתאם לפקודות שסופקו על-ידי יצרן הסורק.
6. הטביעו את מערך המקור/הדמיה של היסטוטריפסיה במיכל תוך כדי סילוק גיסות כפי שמוצג באיור 1A. הסר בעדינות את כל בועות האוויר באמצעות מזרק מפני השטח של מקור היסטוטריפסיה או מערך הדמיה.
   הערה: לטבול את המקור היסטוטרפסיה ואת מערך ההדמיה לחלוטין במים לפני הפעולה. הימנע מלגעת בפני השטח של מקור ההיסטוטריפסיה.
7. השג תמונות במצב B בקצב של 20 פריימים לשנייה באמצעות מערך ההדמיה והפקודות המוכללות של הסורק. התאם את חלון ההדמיה כדי להבטיח הדמיה של המוקד של מקור היסטוטריפסיה בתמונות בזמן אמת אלה.
   הערה: ההנחה היא כי הממדים של אזור המוקד של המקור הטיפולי ידועים.
8. הגדר את פרמטרי ההפעלה של מקור היסטוטריפסיה, כולל תדר בסיסי (למשל, 1.5 מגה-הרץ), תדירות החזרה על פעימות (למשל, 20-100 הרץ), משך הדופק (למשל, 1-20 מחזורים לדופק) ומספר פולסים כולל לכל מיקום (למשל, 100-2,000)^18,23,24,33. לשנות פרמטרים אלה אם תמה קריש מספיק לא מושגת או אם פעילות הבועה משתרעת מעבר לומן של כלי המודל. כדי להגדיר פרמטרים אלה, השתמש בפרוטוקול שסופק על-ידי יצרן המקור או השתמש בפלטפורמת תיכנות שיכולה לקיים תקשורת עם המקור (שלב 4.3).
9. באמצעות הפרוטוקול או פלטפורמת התכנות של היצרן המשמשים בשלב 4.8, הפעל את מקור היסטוטרפסיה בפרמטרים שנקבעו במים מנוטרלים בלבד, ללא כל חסימה בסביבה שמסביב. הגדל את המתח המוחל על מקור היסטוטריפסיה עד שנוצר ענן בועה.
10. באמצעות הדמיה בזמן אמת של שלב 4.7, התאם את המיקום של מערך ההדמיה בתוך פתח מתמר הקונפוצלי עד שענן הבועה ממוקם בערך במרכז חלון התמונה. ענן הבועה הוא האזור של הפיקסלים ההיפר-choic במישור ההדמיה(איור 3). הדקו את הברגים כדי להחזיק את מערך ההדמיה בחוזקה בפתח המתמר.
    הערה: אם המערך מיושר כראוי, המיקום אזימוטאלי של ענן הבועה צריך להיות בערך 0 מ"מ במישור ההדמיה. מערך ההדמיה עשוי להקרין מעט מפני השטח הפנימיים של מקור הטיפול, ולכן מיקום הטווח של ענן הבועה עשוי להיות שונה מאורך המוקד של המקור.
11. זהה את מיקום ענן הבועה במישור ההדמיה. הקצה את המוקד של מקור היסטוטריפסיה כמרכז ענן הבועה (איור 3).
12. הקלט את מיקום המוקד שזוהה (שלב 4.11) בחלון ההדמיה(איור 3). דרך אפשרית לסמן את מיקום המוקד היא הצבת סמן כדי לציין את המיקום בחלון ההדמיה, אם זמין עם פלטפורמת ההדמיה.
13. יש להפסיק את האינוזוניציה ולהגדיר את המתח המוחל על מקור היסטוטריפסיה על V 0.

5. הכנת קריש דם

1. הסר את הקריש מן pipette על ידי חיתוך הקצה האטום עם צבת. תן לקריש להחליק לתוך צלחת פטרי יחד עם הסרום. אם הקריש אינו נסר, יש להפעיל בעדינות לחץ מהקצה השני של הפיפטה באמצעות סומק מלוחים כדי להסיר את הקריש.
2. חותכים את הקריש לאורך של ס"מ אחד באמצעות אזמל, מכוון ליצירה אחידה מהמרכז (כלומר, הרחק מחלקים של הקריש שנוצר בחלק העליון או התחתון של הפיפטה).
3. השתמש ניגוב ניקוי כדי כתם את החלק לחתוך של קריש בעדינות כדי להסיר נוזל עודף.
4. באמצעות פינצטה, מניחים את מקטע הקריש בעדינות בסולם שקילה ומקליטים את המשקל.
5. הרימו ידנית את ערוץ הזרימה ממיכל המים והסירו את כלי הדגם מערוץ הזרימה.
6. מניחים את הקריש בכלי הדגם באמצעות פינצטה ומצמידים שוב את כלי הדגם לערוץ הזרימה.
   הערה: מוט ניילון יכול להיות ממוקם בתוך כלי המודל כדי למנוע את קריש לנוע במורד הזרם בשל הזרימה.
7. הורידו את ערוץ הזרימה למיכל באופן כזה שהקצה הפרוקסימלי של השלב ביחס למאגר נמוך בהשוואה לצד הדיסטלי. ההסתבכות של הבמה באופן זה מונעת השמנה של בועות בחללית המודל כאשר פלזמה נמשכת דרך ערוץ הזרימה בשלב 6.1.
8. הוסף 30 מ"ל של פלזמה למאגר באמצעות pipette ולעקוב אחר הטמפרטורה עד שהוא מגיע לפחות 36 °C (70 °F).
9. השתמש פיפטה כדי לחלק את rt-PA (80.4 מיקרוגרם ב 30 מ"ל של פלזמה, 2.68 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך מאגר הפלזמה. מערבבים את הפלזמה עם הפיפטה כדי להבטיח חלוקה אחידה של RT-PA בתוך המאגר.

6. תפיק את ערוץ הזרימה

1. צייר פלזמה לתוך ערוץ הזרימה מהמאגר באמצעות משאבת המזרק עד שהפלזמה ממלאת את כלי הדגם.
   הערה: אם הקריש אינו סומק עם מוט הניילון, השתמש בציורי משאבה קצרים במהירות של 60 מ"ל / דקה כדי לנסות לכפות את הפלזמה במורד הזרם של הקריש או לצייר ידנית דרך המזרק. להגביל את כמות הפלזמה נמשך בתהליך זה או למלא את המאגר באמצעות פלזמה נוספת / rt-PA כדי להבטיח 30 מ"ל של פתרון בערוץ הזרימה.
2. באמצעות מיצובים ממונעים, ליישר את מערך ההדמיה במקביל לאורך הקריש באמצעות סקריפט הדמיה (שלב 4.7). היישור המקביל מאפשר למשתמש להבטיח מיקום נכון של קריש הדם והיעדר בועות בתוך כלי הדגם.
3. יישר את כלי הדגם באופן ידני וחזותי ודא שאין בועות אוויר הקיימות באמצעות חלון ההדמיה (שלב 4.7).

7. הליך ניסוי

1. טרום טיפול
   הערה: שלב זה הוא לתכנן נתיב עבור מקור היסטוטרפסיה / מערך הדמיה לחשיפה היסטוטרפסיה אחידה לאורך אורך קריש.
   1. ישר את מערך ההדמיה באמצעות הממקמים הממונעים כך שמישור ההדמיה מקביל לחתך של קריש הדם (כלומר, בניצב לכיוון המתואר בשלב 6.2).
   2. תחת הדרכה דרך חלון ההדמיה (שלב 4.7), העבר את מקור היסטוטרפסיה לקצה הפרוקסימלי של הקריש ביחס למאגר באמצעות הממקמים הממונעים. בשלב זה, להתאים את מיקום המקור היסטוטרפסיה כך נקודת המוקד המסומנת בשלב 4.12 מיישרת קו עם מרכז הקריש.
   3. קבע את נתיב ההסתה לאורך אורך הקריש. כדי להגדיר נתיב זה, להגדיר שלוש נקודות ציון לאורך הקריש (כלומר, מיקומים של המנועים שבהם פעילות בועת היסטוטרפסיה כלולה בתוך הקריש) במרווחים של 5 מ"מ. ישר את נקודות הציון כך שהתנועה הכוללת של מקור היסטוטרפסיה לאורך הנתיב היא antegrade עם זרימה במערכת (כלומר, נקודת הציון הראשונה היא בקצה הפרוקסימלי ביותר של הקריש ביחס למאגר, ונקודת הציון השלישית נמצאת במצב דיסטלי ביחס למאגר).
   4. לפני השלמת כל נקודת ציון, בדיקות אש פולסים ממקור היסטוטריפסיה עם אותם פרמטרים אינסונציה כמו שלב 4.8 אבל להפחית את החשיפה הכוללת ל 10 פולסים הכוללים. התאם את המיקום של מקור היסטוטרפסיה באמצעות מיצובים ממונעים במידת הצורך, כדי להכיל פעילות בועה בתוך הקריש.
   5. בכל נקודת אופן, שמור את מיקומי המנוע באמצעות הפקודות שסופקו על-ידי היצרן, בדומה לשלב 4.1.
2. טיפול
   הערה: שלב זה מגדיר את ההליך לטיפול קריש לאורך אורכו על פי הנתיב המוגדר בשלב טרום הטיפול.
   1. הפעל את משאבת המזרק ב 0.65 מ"ל / דקה ולחכות מניסקוס של הפלזמה לזוז. קצב זרימה זה מחקה כמעט מוחלט של כלי כלי האיליו-פורמורלי^24,34.
   2. אינטרפולציה של הנתיב שנוצר בשלב 7.1.3 עם שלבי ביניים בין נקודות הציון שנקבעו עם גודל שלב קבוע (למשל, 0.5 מ"מ). גודל השלב נבחר להיות קטן ממחצית הרוחב של אזור המוקד כפי שנמדד לאורך אורך הקריש (כיוון גובה של מערך ההדמיה). הזז את מקור ההיסטוטריפסיה באמצעות מיצבים ממונעים בכל מיקום נתיב עם פרמטרי אינסונציה המוגדרים בשלב 4.8.
   3. צג/פעילות בועת תמונה במהלך יישום פעימת היסטוטריפסיה בכל מיקום נתיב באמצעות חלון ההדמיה (שלב 4.7). מרכז את התמונה על המוקד היסטוטריפסיה עם ממדי התמונה המכסים 15 מ"מ באזימוט ובטווח. לפני היישום של פעימת היסטוטרפסיה בכל מיקום, לרכוש תמונה במצב B כדי לספק הדמיה של כלי קריש ומודל, על ידי יצירת סקריפט בפלטפורמת תכנות. ודא שקובץ ה- Script יוצר תקשורת עם הסורק באמצעות פקודות היצרן.
   4. במהלך היישום של הדופק היסטוטריפסיה, ליישם את רכישת פליטות אקוסטיות בתסריט בשלב 7.2.3 כדי ליצור תמונות cavitation פסיבי לאחר הוק³⁵. לרכוש תמונה אחת cavitation פסיבי לאחר כל 10 פולסים טיפול. החל פיצוי רווח זמן שטוח של 50 ב 8 עומקים מצטברים עד סוף עומק ההדמיה. בחר גודל חלון רכישה מתאים כך שהאות כולו מהקריש נלכד עם אובדן מינימלי של אנרגיה עקב^{חלון 35}.
   5. אם קיימים ענני בועה מחוץ למטרה, התאם את מיקום המתמר במקום עם המיצבים הממונעים.
      הערה: נטר גורמים מפעילים שלא נענו של מערך ההדמיה. התאם את מספר ערכות נתוני ההדמיה שנרכשו כדי להבטיח שאחסן הנתונים יושלם לפני הפעלתו לאחר מכן.

8. לאחר הליך הניסוי

1. הרימו ידנית את כלי הדגם ממיכל המים כדי לנקז את ההזנה באמצעות כוח המשיכה. הקפד לשמור על ערוץ הזרימה מאוזן כדי למנוע את קריש לנוע במורד הזרם ולצאת מכלי המודל במהלך ניקוז.
2. אסוף את כל ההסתעפויות לניתוח נוסף בכוס קטנה (איור 4A) על ידי ציור פתרון פלזמה מערוץ הזרימה דרך משאבת המזרק בקצב זרימה נמוך מאוד.
3. נתק את כלי הדגם והסר את הקריש. במידת הצורך, להזריק כמות קטנה של תמיסת מלח לתוך כלי המודל כדי לחלץ בעדינות את הקריש.
4. נגב את הקריש בדומה לשלב 1.2.3. לשקול את קריש על סולם השקילה להערכת אובדן מסת קריש.
5. כדי לנתח את התוכן D-dimer, להוסיף 100 מ"ג של חומצה אמינוקפרואית לצינור microcentrifuge ואחריו 1 מ"ל של זלוף, ומערבבים היטב באמצעות pipette. בצעו מדיקה ערבידימטרית של לטקס כדי לכמת את ה-D-dimer בתוך הדגימה³⁶.
6. כדי להעריך המוליזה, להוסיף 1 מ"ל של זלוף צינורות צנטריפוגה להסתובב ב 610 x g (3,500 סל"ד) במשך 10 דקות. לשלב 0.5 מ"ל של supernatant (להתרכז) עם 0.5 מ"ל של פתרון Drabkins ולתת את התערובת לנוח בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. העבירו 200 μL ללוחות היטב, כפי שמוצג באיור 4B. השתמשו בקורא לוחות כדי לקרוא ספיגה ב-540 ננומטר, איור 4C (דראקינס³⁷).
7. הערכה היסתולוגית
   1. חותכים קטע ממרכז הקריש של כ 2-3 מ"מ אורך עם אזמל.
   2. הוסף את המקטע לקלטת. שמור על כיוון המקטע ביחס לכיוון התפשטות הפעימה היסטטריפסיה.
   3. הוסף 2 מ"ל של תמיסת אגרוז ג'ללינג נמוכה שהוכנה בשלב 3.2.5 לקלטת כדי לתקן את הקריש במקום.
   4. תקן את המדגם ב 10% פורמלין עבור 24 שעות. מניחים את המדגם ב 70% אלכוהול לאחר 24 שעות ולבצע hemotoxylin-eosin סטנדרטי מכתים³⁸.

9. ניתוח תמונת cavitation פסיבי

1. לעבד את האותות שנרכשו ממערך ההדמיה במהלך עירור היסטוטריפסיה (שלב 7.2.4) באמצעות אלגוריתם המבוסס על beamformer Capon החזק³⁹ כדי ליצור תמונה של פליטות אקוסטיות שנוצרו על ידי ענן הבועה בכל מיקום טיפול.
   הערה: כדי ליצור תמונות כמותיות, בצע את השלבים המתוארים בהוורת ' ואח^'35. אחרת, כל ערך פיקסל בתמונה אמור לייצג את האנרגיה האקוסטית היחסית של ענן הבועה (יחידות של V²) בכל מיקום מתאים.
2. פלח את התמונה במצב B בשלבים 7.2.3 כדי להבחין בין הפיקסלים המייצגים את קריש הדם וכלי הדגם.
3. יש לרשום במשותף את תמונת cavitation הפסיבית עם התמונה במצב B כפי שמוצג באיור 5B. לסכם את האנרגיה האקוסטית בתוך הקריש על פני תקופת החשיפה³⁵.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במחקר זה מדגיש את הפרטים של מידול קריש ורידים, ליזוזטריפסיה להפרעות קריש, והדמיה אולטרסאונד במבחנה של DVT. ההליך המאומץ מדגים את הצעדים הדרושים להערכת הפרעות קריש עקב ההשפעות המשולבות של פעילות ענן הבועה של rt-PA והיסטוטרפסיה. ההתקנה הספסל נועד לחקות את המאפיינים של וריד iliofe...

Discussion

הפרוטוקול המוצע מציג מודל לכימות יעילות הטיפול של ליזוטריפסיה. בעוד הפרטים העיקריים נדונו, ישנם היבטים קריטיים מסוימים שיש לקחת בחשבון להצלחת פרוטוקול זה. הפעילות האנזימטית של rt-PA יש תלות בטמפרטורת ארניוס³⁰. הטמפרטורה היא גם גורם תורם למהירות הקול במים וברקמות, ושינויים בטמפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing sheets	Precision acoustics	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes	Fisher Scientific	1367820A	14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL capacity
Drabkin's assay	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Draw syringe	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Filter bags	McMaster-Carr	5162K111	Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing	McMaster-Carr	5154K25	Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements	Won Brothers	HT 300 Titanium	Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array	Verasonics	L11-5v	128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose	Millipore Sigma	A9414
Model vessel	McMaster-Carr	5234K98	6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma frozen within 24 hours
Plate reader	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	For haemoglobin quantification
Probe cover	Civco	610-362
Programming platform	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservoir	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Syringe pump	Cole-Parmer	EW-74900-20	pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer	In-house customized		Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system	Verasonics		Vantage Research Ultrasound System
Water tank	Advanced acrylics	C133	14 x 14 x 12, 1/2"