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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’accouchement lytique assisté par histotripsie ou lysotripsie est en cours de développement pour le traitement de la thrombose veineuse profonde. Une procédure in vitro est présentée ici pour évaluer l’efficacité de cette thérapie combinée. Les principaux protocoles pour le modèle de caillot, les conseils d’image et l’évaluation de l’efficacité du traitement sont discutés.

Résumé

La thrombose veineuse profonde (TVPH) est un problème de santé mondial. La principale approche pour obtenir la recanalisation des vaisseaux pour les obstructions critiques est la thrombolytique dirigée par cathéter (CDT). Pour atténuer les effets secondaires caustiques et la longue durée du traitement associée à la TDC, des approches adjuvantes et alternatives sont en cours de développement. L’une de ces approches est l’histotripsie, une thérapie par ultrasons focalisés pour ablater les tissus via la nucléation des nuages de bulles. Des études précliniques ont démontré une forte synergie entre l’histotripsie et les thrombolytiques pour la dégradation des caillots. Ce rapport décrit une méthode de paillasse pour évaluer l’efficacité du traitement thrombolytique assisté par histotripsie, ou lysotripsie.

Des caillots fabriqués à partir de sang veineux humain frais ont été introduits dans un canal d’écoulement dont les dimensions et les propriétés acousto-mécaniques imitent une veine iliofémorale. Le canal a été perfusé avec du plasma et l’activateur lytique recombinant de type tissulaire plasminogène. Des nuages de bulles ont été générés dans le caillot avec une source d’ultrasons focalisée conçue pour le traitement des caillots veineux fémoraux. Des positionneurs motorisés ont été utilisés pour traduire le foyer source le long de la longueur du caillot. À chaque emplacement d’insonation, les émissions acoustiques du nuage de bulles ont été enregistrées passivement et formées par faisceau pour générer des images de cavitation passive. Les mesures permettant d’évaluer l’efficacité du traitement comprenaient la perte de masse de caillots (efficacité globale du traitement) et les concentrations de D-dimère (fibrinolyse) et d’hémoglobine (hémolyse) dans le perfusate. Cette conception in vitro présente des limites, notamment le manque de moyens pour évaluer les effets secondaires in vivo ou les changements dynamiques du débit à mesure que le caillot se lyse. Dans l’ensemble, la configuration fournit une méthode efficace pour évaluer l’efficacité des stratégies basées sur l’histotripsie pour traiter la TVC.

Introduction

La thrombose est l’état de formation de caillots dans un vaisseau sanguin par ailleurs sain qui obstrue la circulation1,2. La thromboembolie veineuse a un coût annuel des soins de santé de 7 à 10 milliards de dollars, avec 375 000 à 425 000 cas aux États-Unis3. L’embolie pulmonaire est l’obstruction de l’artère pulmonaire et est la conséquence la plus grave de la thromboembolie veineuse. La principale source d’obstruction pulmonaire est le thrombus veineux profond, principalement à partir des segments veineux iliofémoraux4,5,6. La thrombose veineuse profonde (TVV) a des séquelles inhérentes en plus des obstructions pulmonaires, avec des complications à long terme qui entraînent de la douleur, de l’enflure, des ulcérations de la jambe et des amputations de membres7,8,9. Pour les obstructions critiques, les thrombolytiques dirigés par cathéter (CDT) sont l’approche de première ligne pour la recanalisation des vaisseaux10. Le résultat de la CDT dépend d’un certain nombre de facteurs, y compris l’âge du thrombus, l’emplacement, la taille, la composition, l’étiologie et la catégorie de risque du patient11. De plus, la TDC est associée à des lésions vasculaires, des infections, des complications hémorragiques et une longue durée de traitement10. Les dispositifs de nouvelle génération visent à combiner la thrombectomie mécanique avec des thrombolytiques (c.-à-d. thrombectomie pharmacomécanique)12,13. L’utilisation de ces dispositifs réduit la posologie lytique, ce qui réduit les complications hémorragiques et raccourcit le temps de traitement12,13,14 par rapport à la CDT. Ces dispositifs conservent encore des problèmes d’effets secondaires hémorragiques et d’élimination incomplète des thrombuschroniques 15. Une stratégie adjuvante est donc nécessaire pour éliminer complètement le thrombus avec des complications hémorragiques plus faibles.

Une approche potentielle est le traitement thrombolytique assisté par histotripsie, appelé lysotripsie. L’histotripsie est une modalité de traitement non invasive qui utilise des ultrasons focalisés pour nucléer les nuages de bulles dans les tissus16. L’activité des bulles n’est pas générée par des noyaux exogènes, mais par l’application d’impulsions ultrasonores avec une tension suffisante pour activer les noyaux intrinsèques aux tissus, y compris le caillot17,18. L’oscillation mécanique du nuage de bulles confère une contrainte au caillot, désintégrant la structure en débris acellulaires19. L’activité des bulles d’histotripsie permet une dégradation efficace des caillots sanguins rétractés et non rétractés à la fois in vivo et in vitro20,21,22. Des études antérieures ont démontré23,24 que la combinaison de l’histotripsie et de l’activateur plasminogène de type tissulaire recombinant lytique (rt-PA) augmente significativement l’efficacité du traitement par rapport au lytique seul ou à l’histotripsie seule. On émet l’hypothèse que deux mécanismes principaux associés à l’activité de la bulle d’histotripsie sont responsables de l’amélioration de l’efficacité du traitement: 1) augmentation de la fibrinolyse due à l’amélioration de l’administration lytique, et 2) hémolyse des globules rouges dans le caillot. La majeure partie de la masse du caillot est composée de globules rouges24, et, par conséquent, le suivi de la dégradation des érythrocytes est un bon substitut pour l’ablation de l’échantillon. D’autres éléments de caillot formés sont également probablement désintégrés sous l’activité de bulle d’histotripsie, mais ne sont pas pris en compte dans ce protocole.

Ici, une approche de paillasse pour traiter la TVP in vitro avec lysotripsie est décrite. Le protocole décrit les paramètres de fonctionnement critiques de la source d’histotripsie, l’évaluation de l’efficacité du traitement et le guidage par image. Le protocole comprend la conception d’un canal d’écoulement pour imiter un segment veineux iliofémoral et la fabrication de caillots de sang total humain. La procédure expérimentale décrit le positionnement de la source d’histotripsie et du réseau d’imagerie pour obtenir une exposition à l’histotripsie le long du caillot placé dans le canal d’écoulement. Des paramètres d’insonation pertinents pour atteindre la perturbation des caillots et minimiser l’activité des bulles hors cible sont définis. L’utilisation de l’imagerie par ultrasons pour le guidage et l’évaluation de l’activité des bulles estillustrée 24. Les mesures permettant de quantifier l’efficacité du traitement, telles que la perte de masse des caillots, le D-dimère (fibrinolyse) et l’hémoglobine (hémolyse), sont décrites23,24,25,26,27. Dans l’ensemble, l’étude fournit un moyen efficace d’exécuter et d’évaluer l’efficacité de la lysotripsie pour traiter la TVP.

Protocole

Pour les résultats présentés ici, du sang humain veineux a été prélevé pour former des caillots après approbation du comité d’examen interne local (CISR no 19-1300) et consentement éclairé écrit fourni par des donneurs bénévoles24. Cette section décrit un protocole de conception pour évaluer l’efficacité de la lysotripsie. Le protocole est basé sur un travail antérieur de Bollen et al.24.

1. Modélisation des caillots

REMARQUE: Préparez les caillots dans les 2 semaines mais plus de 3 jours avant le jour de l’expérience pour assurer la stabilité des caillots et maximiser la rétraction28. Préparer le caillot après l’approbation du comité d’examen de l’établissement local.

  1. Préparer la pipette Borosilicate Pasteur pour le stockage du sang (voir tableau des matériaux pour les spécifications de la pipette). Les tubes en borosilicate sont utilisés en raison de la nature hydrophile du matériau qui favorise l’activation plaquettaire et la rétraction des caillots29. Scellez l’extrémité de la pipette en chauffant sur un brûleur Bunsen.
  2. Dessinez du sang veineux humain frais. Aliquote le sang total prélevé par incréments de 2 mL par caillot désiré. Transférer chaque aliquote de 2 mL sur une pipette Pasteur.
    REMARQUE: Exécutez l’étape 1.2 dans un délai d’environ 3 minutes après la prise de sang afin que le sang ne coagule pas avant d’être transféré dans des pipettes. Assurez-vous également que le donneur volontaire ne reçoit aucun médicament pouvant altérer la cascade de coagulation (p. ex. anticoagulants ou inhibiteurs plaquettaires).
  3. Incuber les aliquotes de sang dans les pipettes (égal au nombre de caillots requis) au bain-marie pendant 3 h à 37 °C.
  4. Conserver les pipettes pendant au moins 3 jours à 4 °C pour permettre la rétraction des caillots28. Au fur et à mesure que les caillots se rétractent, on observera que le sérum s’accumule au sommet du caillot dans la pipette. La réponse rt-PA des caillots reste stable pendant 2 semaines après la rétraction28.

2. Préparation du réservoir d’eau

  1. Remplissez le réservoir d’eau avec de l’eau d’osmose inverse. Tapisser la surface inférieure du réservoir avec un matériau absorbant acoustique pour réduire la réflexion des impulsions ultrasonores de thérapie ou d’imagerie. Utilisez un système de traitement de l’eau pour dégazer et filtrer l’eau afin de minimiser les noyaux de bulles.
    REMARQUE: Une façon de filtrer l’eau est d’utiliser un filtre en ligne. Les spécifications du sac utilisé pour générer les résultats représentatifs sont données dans le tableau des matériaux.
  2. Placez deux éléments chauffants sur la surface inférieure du réservoir. Chauffer l’eau à 37,3 °C pour obtenir l’activité enzymatique lytique maximale30.
  3. Configurez un canal d’écoulement comme illustré à la figure 1A. Le canal d’écoulement se compose d’un tube, d’un récipient modèle avec des propriétés matérielles et géométriques représentatives d’une veine iliofémorale, d’un réservoir de plasma et d’une seringue à l’extrémité la plus distale du réservoir (Table des matériaux). La seringue est connectée à une pompe pour réguler un débit à travers le canal pendant l’expérience.
  4. Immergez manuellement le canal d’écoulement dans le réservoir d’eau pour amener le canal à une température physiologique pendant l’étape de dégazage/filtrage/chauffage (étapes 2.1 et 2.2).

3. Préparation du plasma et du mélange rt-PA

  1. Avant la journée d’expérimentation
    REMARQUE: Lorsqu’il est stocké à -80 °C, le plasma est stable pendant au moins 2,5 ans31 et le rt-PA est stable pendant au moins 7 ans32. Par conséquent, exécutez l’étape 3.1 à tout moment dans ces périodes pour assurer la stabilité des deux composants.
    1. Diluer le rt-PA obtenu d’un fabricant sous forme de poudre à 1 mg/mL dans de l’eau stérile.
    2. Aliquote 100 μL de rt-PA dilué dans des tubes centrifuges de 0,5 mL et les stocker à -80 °C.
    3. Aliquote 35 mL de plasma humain frais congelé de type O dans des tubes centrifuges de 50 mL. Conserver les tubes à -80 °C.
  2. Le jour de l’expérience
    1. Récupérez les aliquotes de plasma du congélateur. Récupérez autant d’aliquotes que le nombre de caillots à tester ce jour-là. Immergez les aliquotes congelées dans un bain-marie à 37 °C pour les décongeler (~10 min).
    2. Une fois le plasma décongelé, versez-le dans un bécher qui est triplement rincé à l’eau ultrapure. Couvrez légèrement la bouche du bécher avec du papier d’aluminium pour éviter toute contamination et placez le bécher au bain-marie. Laissez la feuille être suffisamment lâche pour permettre à l’air d’entrer en contact avec le plasma.
    3. Laisser le plasma s’équilibrer à 37 °C à la pression atmosphérique pendant au moins 2 h.
    4. Sortez les flacons de rt-PA congelés et placez-les sur la glace jusqu’à ce que nécessaire, avec un flacon pour chaque expérience.
    5. Faire de l’agarose à faible teneur gélifiante (2%) dans une fiole de 50 mL, en dissolvant l’agarose dans de l’eau ultrapure. Choisissez la quantité totale de solution d’agarose de telle sorte qu’environ 2 mL soient disponibles pour chaque échantillon à analyser. Chauffer la solution en fiole au micro-ondes jusqu’à ce qu’elle soit pétillante. Fixez la fiole avec un couvercle à vis étanche. Immergez la fiole dans le bain-marie à côté du plasma.
      REMARQUE: Cette étape garantit que l’agarose est disponible pour sécuriser les segments de caillot exposés pour l’analyse histologique après l’insonation par histotripsie.

4. Configuration de la source d’histotripsie et du réseau d’imagerie

  1. Assurez-vous que les positionneurs motorisés peuvent être contrôlés à partir de l’environnement d’exécution d’une plate-forme de programmation, à l’aide des instructions et des commandes fournies par le fabricant. Vérifiez que les moteurs du système sont connectés au port approprié de l’ordinateur avec l’environnement d’exécution.
  2. Montez la source d’histotripsie sur le système de positionnement motorisé comme illustré à la figure 1B.
  3. Connectez la source d’histotripsie à son électronique d’alimentation (par exemple, amplificateur de puissance et générateur de fonctions) via les connecteurs appropriés (par exemple, les câbles BNC) comme spécifié par le fabricant.
    REMARQUE: Assurez-vous que l’électronique de conduite de la source d’histotripsie peut être contrôlée via l’environnement d’exécution utilisé à l’étape 4.1.
  4. Couvrez le réseau d’imagerie avec un couvercle de sonde et apposez le réseau coaxialement dans l’ouverture de la source d’histotripsie comme illustré à la figure 2. Assurez-vous de comprendre l’orientation du plan d’imagerie par rapport à l’orientation de la source d’histotripsie.
  5. Connectez le réseau d’imagerie à un système d’échographie. Assurez-vous que ce système peut contrôler le fonctionnement et le déclenchement de la matrice d’imagerie et collecter des données d’imagerie, conformément aux commandes fournies par le fabricant du scanner.
  6. Immergez la source d’histotripsie/réseau d’imagerie dans le réservoir pendant le dégazage, comme illustré à la figure 1A. Retirez doucement toutes les bulles d’air à l’aide d’une seringue de la surface de la source d’histotripsie ou du réseau d’imagerie.
    REMARQUE: Immergez complètement la source d’histotripsie et le réseau d’imagerie dans l’eau avant le fonctionnement. Évitez de toucher la surface de la source d’histotripsie.
  7. Acquérez des images en mode B à une vitesse de 20 images par seconde à l’aide du réseau d’imagerie et des commandes intégrées du scanner. Ajustez la fenêtre d’imagerie pour assurer la visualisation de la mise au point de la source d’histotripsie dans ces images en temps réel.
    NOTE: On suppose que les dimensions de la région focale de la source thérapeutique sont connues.
  8. Définissez les paramètres de fonctionnement de la source d’histotripsie, y compris la fréquence fondamentale (par exemple, 1,5 MHz), la fréquence de répétition des impulsions (par exemple, 20-100 Hz), la durée de l’impulsion (par exemple, 1-20 cycles par impulsion) et le nombre total d’impulsions par emplacement (par exemple, 100-2 000)18,23,24,33. Modifiez ces paramètres si une lyse de caillot suffisante n’est pas atteinte ou si l’activité de la bulle s’étend au-delà de la lumière du vaisseau modèle. Pour définir ces paramètres, utilisez le protocole fourni par le fabricant de la source ou utilisez une plate-forme de programmation capable de communiquer avec la source (étape 4.3).
  9. À l’aide du protocole ou de la plate-forme de programmation du fabricant utilisé à l’étape 4.8, exécutez la source d’histotripsie aux paramètres définis dans de l’eau dégazée uniquement, sans aucune obstruction dans l’environnement environnant. Augmentez la tension appliquée à la source d’histotripsie jusqu’à ce qu’un nuage de bulles se forme.
  10. À l’aide de l’imagerie en temps réel de l’étape 4.7, ajustez la position du réseau d’imagerie à l’intérieur de l’ouverture du transducteur confocal jusqu’à ce que le nuage de bulles soit situé approximativement au centre de la fenêtre d’image. Le nuage de bulles est la région des pixels hyperéchoïques dans le plan d’imagerie (Figure 3). Serrez les vis pour maintenir fermement le réseau d’imagerie dans l’ouverture du transducteur.
    REMARQUE: Si le réseau est aligné correctement, la position azimutale du nuage de bulles doit être d’environ 0 mm dans le plan d’imagerie. Le réseau d’imagerie peut se projeter légèrement à partir de la surface interne de la source de thérapie et, par conséquent, la position de portée du nuage de bulles peut différer de la distance focale de la source.
  11. Identifiez l’emplacement du nuage de bulles dans le plan d’imagerie. Assignez le foyer de la source d’histotripsie comme centre du nuage de bulles (Figure 3).
  12. Enregistrez l’emplacement focal détecté (étape 4.11) dans la fenêtre d’imagerie (Figure 3). Un moyen possible de marquer la position focale consiste à placer un curseur pour noter l’emplacement dans la fenêtre d’imagerie, si disponible avec la plate-forme d’imagerie.
  13. Interrompre l’insonation et régler la tension appliquée à la source d’histotripsie sur 0 V.

5. Préparation des caillots

  1. Retirez le caillot de la pipette en coupant l’extrémité scellée avec une pince. Laissez le caillot glisser dans une boîte de Petri avec le sérum. Si le caillot ne se déloge pas, appliquez doucement une pression de l’autre extrémité de la pipette via une chasse d’eau saline pour enlever le caillot.
  2. Coupez le caillot à 1 cm de longueur à l’aide d’un scalpel, en visant une pièce uniforme à partir du centre (c.-à-d. loin des sections du caillot formées en haut ou en bas de la pipette).
  3. Utilisez une lingette nettoyante pour éponger doucement la section coupée du caillot afin d’éliminer l’excès de liquide.
  4. À l’aide d’une pince à épilez, placez doucement la section du caillot sur une balance et enregistrez le poids.
  5. Soulevez manuellement le canal d’écoulement hors du réservoir d’eau et retirez le récipient modèle du canal d’écoulement.
  6. Placez le caillot dans le récipient modèle à l’aide d’une pince à épiler et fixez à nouveau le récipient modèle au canal d’écoulement.
    REMARQUE: Une tige en nylon peut être placée dans le récipient modèle pour empêcher le caillot de se déplacer en aval en raison de l’écoulement.
  7. Abaissez le canal d’écoulement dans le réservoir de manière à ce que l’extrémité proximale de l’étage par rapport au réservoir soit faible par rapport au côté distal. L’inclinaison de la scène de cette manière empêche le piégeage des bulles dans le récipient modèle lorsque le plasma est aspiré à travers le canal d’écoulement à l’étape 6.1.
  8. Ajouter 30 mL de plasma au réservoir à l’aide d’une pipette et surveiller la température jusqu’à ce qu’elle atteigne au moins 36 °C.
  9. Utilisez une pipette pour distribuer le rt-PA (80,4 μg dans 30 mL de plasma, 2,68 μg/mL) dans le réservoir de plasma. Remuez le plasma avec la pipette pour assurer une distribution rt-PA uniforme dans le réservoir.

6. Amorçage du canal d’écoulement

  1. Aspirez le plasma dans le canal d’écoulement du réservoir via la pompe à seringue jusqu’à ce que le plasma remplisse le récipient modèle.
    REMARQUE: Si le caillot n’est pas au ras de la tige de nylon, utilisez des tirages de pompe courts à 60 mL / min pour essayer de forcer le plasma en aval du caillot ou de tirer manuellement à travers la seringue. Limitez la quantité de plasma prélevée dans ce processus ou remplissez le réservoir à l’aide de plasma/rt-PA supplémentaire pour assurer 30 mL de solution dans le canal d’écoulement.
  2. À l’aide des positionneurs motorisés, alignez le réseau d’imagerie parallèlement à la longueur du caillot à l’aide du script d’imagerie (étape 4.7). L’alignement parallèle permet à l’utilisateur d’assurer visuellement un placement correct du caillot et l’absence de bulles à l’intérieur du récipient modèle.
  3. Nivelez le modèle de récipient manuellement et visuellement pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est présente à l’aide de la fenêtre d’imagerie (étape 4.7).

7. Procédure expérimentale

  1. Prétraitement
    REMARQUE: Cette étape consiste à planifier un chemin pour la source d’histotripsie / réseau d’imagerie pour une exposition uniforme à l’histotripsie le long de la longueur du caillot.
    1. Aligner le réseau d’imagerie à l’aide des positionneurs motorisés de manière à ce que le plan d’imagerie soit parallèle à la section transversale du caillot (c.-à-d. perpendiculaire à l’orientation décrite à l’étape 6.2).
    2. Sous guidage via la fenêtre d’imagerie (étape 4.7), déplacez la source d’histotripsie à l’extrémité proximale du caillot par rapport au réservoir à l’aide des positionneurs motorisés. À ce stade, ajustez la position de la source d’histotripsie de manière à ce que le point focal marqué à l’étape 4.12 s’aligne sur le centre du caillot.
    3. Déterminez le chemin d’insonation le long de la longueur du caillot. Pour définir ce chemin, définissez trois points de cheminement le long du caillot (c’est-à-dire les positions des moteurs où l’activité de la bulle d’histotripsie est contenue dans le caillot) par incréments de 5 mm. Aligner les points de cheminement de telle sorte que le mouvement global de la source d’histotripsie le long du chemin soit antégrade avec l’écoulement dans le système (c.-à-d. que le premier point de cheminement est à l’extrémité la plus proximale du caillot par rapport au réservoir, et le troisième point de cheminement est en position distale par rapport au réservoir).
    4. Avant de finaliser chaque waypoint, les impulsions d’essai au feu proviennent de la source d’histotripsie avec les mêmes paramètres d’insonation que l’étape 4.8, mais réduisent l’exposition globale à 10 impulsions totales. Ajustez la position de la source d’histotripsie à l’aide des positionneurs motorisés si nécessaire, pour contenir l’activité des bulles dans le caillot.
    5. À chaque waypoint, enregistrez les positions du moteur à l’aide des commandes fournies par le fabricant, similaires à l’étape 4.1.
  2. Traitement
    REMARQUE: Cette étape définit la procédure pour traiter le caillot sur toute sa longueur en fonction du chemin défini dans l’étape de prétraitement.
    1. Exécutez la pompe à seringue à 0,65 mL/min et attendez que le ménisque du plasma se déplace. Ce débit imite une occlusion quasi totale du système vasculaire iliofémoral24,34.
    2. Interpoler le chemin créé à l’étape 7.1.3 avec des étapes intermédiaires entre les points de cheminement établis avec une taille de pas fixe (par exemple, 0,5 mm). La taille du pas est choisie pour être inférieure à la moitié de la largeur de la région focale mesurée le long de la longueur du caillot (direction d’élévation du réseau d’imagerie). Déplacez la source d’histotripsie à l’aide de positionneurs motorisés à chaque emplacement de chemin avec des paramètres d’insonation définis à l’étape 4.8.
    3. Surveiller l’activité de la bulle d’image pendant l’application de l’impulsion d’histotripsie à chaque emplacement de chemin à l’aide de la fenêtre d’imagerie (étape 4.7). Centrez l’image sur la mise au point histotripsie avec les dimensions de l’image couvrant 15 mm dans l’azimut et la plage. Avant l’application de l’impulsion d’histotripsie à chaque emplacement, acquérez une image en mode B pour fournir une visualisation du caillot et du vaisseau modèle, en créant un script dans une plate-forme de programmation. Assurez-vous que le script établit la communication avec le scanner à l’aide des commandes du fabricant.
    4. Lors de l’application de l’impulsion d’histotripsie, mettre en œuvre l’acquisition d’émissions acoustiques dans le script à l’étape 7.2.3 pour former des images de cavitation passive post hoc35. Acquérir une image de cavitation passive après chaque 10 impulsions de traitement. Appliquez une compensation de gain de temps plat de 50 à 8 profondeurs incrémentielles jusqu’à la fin de la profondeur d’imagerie. Choisissez une taille de fenêtre d’acquisition appropriée de sorte que le signal entier du caillot soit capturé avec une perte d’énergie minimale due au fenêtrage35.
    5. Si des nuages de bulles hors cible sont présents, ajustez la position du transducteur in situ avec les positionneurs motorisés.
      REMARQUE: Surveillez les déclencheurs manqués de la baie d’imagerie. Ajustez le nombre d’ensembles de données d’imagerie acquis pour vous assurer que le stockage des données est terminé avant le déclenchement ultérieur.

8. Procédure post-expérience

  1. Soulevez manuellement le récipient modèle hors du réservoir d’eau pour drainer le perfusate par gravité. Assurez-vous de maintenir le canal d’écoulement à niveau pour empêcher le caillot de se déplacer en aval et hors du récipient modèle pendant le drainage.
  2. Recueillir le perfusate entier pour une analyse plus approfondie dans un petit bécher(Figure 4A)en prétrait une solution plasmatique du canal d’écoulement à travers la pompe à seringue à un débit très faible.
  3. Débranchez le récipient modèle et retirez le caillot. Si nécessaire, injectez une petite quantité de solution saline dans le récipient modèle pour déloger doucement le caillot.
  4. Essuyez le caillot de la même manière que l’étape 1.2.3. Peser le caillot sur la balance pour évaluer la perte de masse du caillot.
  5. Pour analyser la teneur en D-dimère, ajouter 100 mg d’acide aminocaproïque dans un tube de microcentrifugation suivi de 1 mL de perfusate et bien mélanger à l’aide d’une pipette. Effectuer un test immunoturbidimétrique au latex pour quantifier le dimère D dans l’échantillon36.
  6. Pour évaluer l’hémolyse, ajouter 1 mL de perfusate dans les tubes de centrifugeuse et filer à 610 x g (3 500 tr/min) pendant 10 min. Mélanger 0,5 mL de surnageant (concentré) avec 0,5 mL de solution de Drabkins et laisser reposer le mélange à température ambiante pendant 15 min. Transférer 200 μL sur des plaques de puits, comme le montre la figure 4B. Utilisez un lecteur de plaques pour lire l’absorbance à 540 nm, Figure 4C (Drabkins assay37).
  7. Évaluation histologique
    1. Coupez une section du centre du caillot d’environ 2-3 mm de long avec un scalpel.
    2. Ajoutez la section à une cassette. Maintenir l’orientation de la section par rapport à la direction de propagation de l’impulsion d’histotripsie.
    3. Ajouter 2 mL de solution d’agarose à faible teneur en gélification préparée à l’étape 3.2.5 dans la cassette pour fixer le caillot en place.
    4. Fixer l’échantillon dans du for formel à 10 % pendant 24 h. Placer l’échantillon dans de l’alcool à 70% après 24 h et effectuer une coloration standard à l’hemotoxyline-éosine38.

9. Analyse d’image par cavitation passive

  1. Traiter les signaux acquis à partir du réseau d’imagerie pendant l’excitation de l’histotripsie (étape 7.2.4) à l’aide d’un algorithme basé sur le robuste Capon beamformer39 pour créer une image des émissions acoustiques générées par le nuage de bulles à chaque lieu de traitement.
    REMARQUE : Pour générer des images quantitatives, suivez les étapes décrites dans Haworth et al.35. Sinon, chaque valeur de pixel dans l’image doit représenter l’énergie acoustique relative du nuage de bulles (unités de V2) à chaque emplacement correspondant.
  2. Segmentez l’image en mode B acquis à l’étape 7.2.3 pour faire la distinction entre les pixels représentant le caillot et le récipient modèle.
  3. Co-enregistrez l’image de cavitation passive avec l’image en mode B comme illustré à la figure 5B. Résumer l’énergie acoustique à l’intérieur du caillot au cours de la période d’exposition35.

Résultats

Le protocole décrit dans cette étude met en évidence les détails de la modélisation des caillots veineux, de la lysotripsie pour la perturbation des caillots et de l’imagerie échographique dans une configuration in vitro de TVP. La procédure adoptée démontre les étapes nécessaires pour évaluer la perturbation des caillots due aux effets combinés de la rt-PA et de l’activité des nuages de bulles d’histotripsie. La configuration de la paillasse a été conçue pour imiter les caractéristiques d’une v...

Discussion

Le protocole proposé présente un modèle pour quantifier l’efficacité du traitement de la lysotripsie. Bien que les détails clés aient été discutés, il y a certains aspects critiques à considérer pour le succès de ce protocole. L’activité enzymatique de rt-PA a une dépendance de température d’Arrhenius30. La température est également un facteur contribuant à la vitesse du son dans l’eau et les tissus, et les variations de température peuvent entraîner des modifications m...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par les National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Kevin Haworth pour son aide au test de Drabkin et le Dr Viktor Bollen pour son soutien dans la conception du protocole. Les auteurs sont également reconnaissants au Dr Adam Maxwell pour ses conseils sur la conception de la source d’histotripsie.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Absorbing sheetsPrecision acousticsF28-SMALL-M300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettesFisher Scientific1367820A14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubesEppendorf223641111.5 mL capacity
Drabkin's assaySigma AldrichD5941-6VL
Draw syringeCole-ParmerEW-07945-4360 mL capacity
Filter bagsMcMaster-Carr5162K111Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubingMcMaster-Carr5154K25Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elementsWon BrothersHT 300 TitaniumTitanium rods placed at the bottom of tank
Imaging arrayVerasonicsL11-5v128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agaroseMillipore SigmaA9414
Model vesselMcMaster-Carr5234K986.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure waterBarnsteadNanopure DiamondASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
PlasmaVitalant4PF000Plasma frozen within 24 hours
Plate readerBiotekSynergy Neo HST Plate ReaderFor haemoglobin quantification
Probe coverCivco610-362
Programming platformMATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)GenentechActivase
ReservoirCole-ParmerEW-07945-4360 mL capacity
Syringe pumpCole-ParmerEW-74900-20pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
TransducerIn-house customizedEight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning systemVerasonicsVantage Research Ultrasound System
Water tankAdvanced acrylicsC13314 x 14 x 12, 1/2"

Références

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