Un système in vitro pour évaluer l’efficacité thrombolytique de l’histotripsie et d’un médicament lytique

Résumé

L’accouchement lytique assisté par histotripsie ou lysotripsie est en cours de développement pour le traitement de la thrombose veineuse profonde. Une procédure in vitro est présentée ici pour évaluer l’efficacité de cette thérapie combinée. Les principaux protocoles pour le modèle de caillot, les conseils d’image et l’évaluation de l’efficacité du traitement sont discutés.

Résumé

La thrombose veineuse profonde (TVPH) est un problème de santé mondial. La principale approche pour obtenir la recanalisation des vaisseaux pour les obstructions critiques est la thrombolytique dirigée par cathéter (CDT). Pour atténuer les effets secondaires caustiques et la longue durée du traitement associée à la TDC, des approches adjuvantes et alternatives sont en cours de développement. L’une de ces approches est l’histotripsie, une thérapie par ultrasons focalisés pour ablater les tissus via la nucléation des nuages de bulles. Des études précliniques ont démontré une forte synergie entre l’histotripsie et les thrombolytiques pour la dégradation des caillots. Ce rapport décrit une méthode de paillasse pour évaluer l’efficacité du traitement thrombolytique assisté par histotripsie, ou lysotripsie.

Des caillots fabriqués à partir de sang veineux humain frais ont été introduits dans un canal d’écoulement dont les dimensions et les propriétés acousto-mécaniques imitent une veine iliofémorale. Le canal a été perfusé avec du plasma et l’activateur lytique recombinant de type tissulaire plasminogène. Des nuages de bulles ont été générés dans le caillot avec une source d’ultrasons focalisée conçue pour le traitement des caillots veineux fémoraux. Des positionneurs motorisés ont été utilisés pour traduire le foyer source le long de la longueur du caillot. À chaque emplacement d’insonation, les émissions acoustiques du nuage de bulles ont été enregistrées passivement et formées par faisceau pour générer des images de cavitation passive. Les mesures permettant d’évaluer l’efficacité du traitement comprenaient la perte de masse de caillots (efficacité globale du traitement) et les concentrations de D-dimère (fibrinolyse) et d’hémoglobine (hémolyse) dans le perfusate. Cette conception in vitro présente des limites, notamment le manque de moyens pour évaluer les effets secondaires in vivo ou les changements dynamiques du débit à mesure que le caillot se lyse. Dans l’ensemble, la configuration fournit une méthode efficace pour évaluer l’efficacité des stratégies basées sur l’histotripsie pour traiter la TVC.

Introduction

La thrombose est l’état de formation de caillots dans un vaisseau sanguin par ailleurs sain qui obstrue la circulation^1,2. La thromboembolie veineuse a un coût annuel des soins de santé de 7 à 10 milliards de dollars, avec 375 000 à 425 000 cas aux États-Unis^3. L’embolie pulmonaire est l’obstruction de l’artère pulmonaire et est la conséquence la plus grave de la thromboembolie veineuse. La principale source d’obstruction pulmonaire est le thrombus veineux profond, principalement à partir des segments veineux iliofémoraux^4,5

Protocole

Pour les résultats présentés ici, du sang humain veineux a été prélevé pour former des caillots après approbation du comité d’examen interne local (CISR no 19-1300) et consentement éclairé écrit fourni par des donneurs bénévoles²⁴. Cette section décrit un protocole de conception pour évaluer l’efficacité de la lysotripsie. Le protocole est basé sur un travail antérieur de Bollen et al.²⁴.

1. Modélisation des caillots

REMARQUE: Préparez les caillots dans les 2 semaines mais plus de 3 jours avant le jour de l’expérience pour assurer la stabilité des caillots et maximise....

Résultats

Le protocole décrit dans cette étude met en évidence les détails de la modélisation des caillots veineux, de la lysotripsie pour la perturbation des caillots et de l’imagerie échographique dans une configuration in vitro de TVP. La procédure adoptée démontre les étapes nécessaires pour évaluer la perturbation des caillots due aux effets combinés de la rt-PA et de l’activité des nuages de bulles d’histotripsie. La configuration de la paillasse a été conçue pour imiter les caractéristiques d’une v.......

Discussion

Le protocole proposé présente un modèle pour quantifier l’efficacité du traitement de la lysotripsie. Bien que les détails clés aient été discutés, il y a certains aspects critiques à considérer pour le succès de ce protocole. L’activité enzymatique de rt-PA a une dépendance de température d’Arrhenius³⁰. La température est également un facteur contribuant à la vitesse du son dans l’eau et les tissus, et les variations de température peuvent entraîner des modifications m.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing sheets	Precision acoustics	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes	Fisher Scientific	1367820A	14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL capacity
Drabkin's assay	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Draw syringe	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Filter bags	McMaster-Carr	5162K111	Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing	McMaster-Carr	5154K25	Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements	Won Brothers	HT 300 Titanium	Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array	Verasonics	L11-5v	128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose	Millipore Sigma	A9414
Model vessel	McMaster-Carr	5234K98	6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma frozen within 24 hours
Plate reader	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	For haemoglobin quantification
Probe cover	Civco	610-362
Programming platform	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservoir	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Syringe pump	Cole-Parmer	EW-74900-20	pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer	In-house customized		Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system	Verasonics		Vantage Research Ultrasound System
Water tank	Advanced acrylics	C133	14 x 14 x 12, 1/2"