测量组织直肠炎和莱蒂克药物血栓分析功效的体外系统

摘要

组织直肠炎辅助解冻分娩或利索三头肌正在开发中，用于治疗深静脉血栓形成。这里介绍了体外程序，以评估这种联合疗法的疗效。讨论了血块模型、图像引导和治疗效果评估的关键协议。

摘要

深静脉血栓（DVT）是一个全球性的健康问题。实现关键障碍物血管再扫描的主要方法是导管定向血栓分析 （CDT）。为了减轻腐蚀性副作用和与 CDT 相关的较长的治疗时间，正在开发辅助剂和替代方法。其中一种方法是组织切入，一种聚焦的超声波疗法，通过气泡云核使组织消融。临床前研究表明，组织直觉和血栓解剂在血栓降解方面具有很强的协同作用。本报告概述了一种台式方法，以评估组织直觉辅助血栓分析疗法（或利索三脚架疗法）的疗效。

用新鲜的人类静脉血制成的血块被引入一个流动通道，其尺寸和声学机械特性模仿了虹膜的静脉。该通道注入血浆和解质重组组织型质粒活化剂。气泡云在血块中产生，其聚焦超声源用于治疗股骨静脉血块。电动定位器用于沿血块长度转换源对焦。在每个振变位置，被动地记录气泡云的声学辐射，并进行光束成型以生成被动空腔图像。衡量治疗效果的指标包括血块质量损失（整体治疗功效），以及香水中D-dimer（纤维解精）和血红蛋白（溶血）的浓度。这种体外设计存在局限性，包括缺乏评估体内副作用或血块解流速动态变化的手段。总体而言，该设置提供了一种有效的方法来评估基于组织创伤的治疗 DVT 策略的有效性。

引言

血栓形成是一种本来健康的血管中凝块形成的情况，会阻碍血液循环^1，2。静脉血栓栓塞每年的医疗费用为70-100亿美元，美国有37.5万至42.5万例^。肺栓塞是肺动脉的阻塞，是静脉血栓栓塞最严重的后果。肺阻塞的主要来源是深静脉血栓，主要来自虹膜静脉部分^4，5，6。深静脉血栓（DVT）除了肺阻塞外，还有固有的后遗症，长期并发症可导致疼痛、肿胀、腿部溃疡和截肢^7、8、9。对于关键阻塞，导管定向血栓分析（CDT）是船舶再扫描¹⁰的前线方法。CDT的结果取决于许多因素，包括血栓年龄，位置，大小，组成，病因和患者风险类别^11。此外，CDT与血管损伤、感染、出血并发症和长时间的^{治疗有关。}下一代设备旨在结合机械血栓切除术与血栓切除术（即药理机械血栓切除术^{）12，13。}与CDT相比，使用这些设备可降低解质剂量，减少出血并发症，缩短治疗时间^{12、13、14。} 这些设备仍然保留出血的副作用和慢性血栓¹⁵的不完全去除的问题。因此，需要一种辅助策略，可以完全去除血栓，降低出血并发症。

一种潜在的方法是组织直觉辅助血栓分析治疗，称为淋病。组织缺陷是一种非侵入性治疗方式，使用聚焦超声波在组织¹⁶中核化气泡云。气泡活性不是通过外源性核产生的，而是通过应用具有足够张力的超声波脉冲来激活组织内在的细胞核，包括血块^17、18。气泡云的机械振荡给血块带来应变，使结构分解成细胞碎片^19。组织收缩气泡活性提供体内和体外^20，21，22的缩回和未收回的血块的有效降^解。先前^{的研究表明，}组织直肠和解质重组组织型质粒活化剂（rt-PA）的结合比单体解质或组织直觉显著提高治疗疗效。据推测，与组织精神气泡活性相关的两种主要机制是提高治疗疗效的原因:1） 由于溶解分娩增强而增加纤维化，2） 血栓内红血球溶解。血块质量的大部分由红血球²⁴组成，因此，跟踪红细胞降解是样本消融的良好替代。其他形成的血块元素也可能在组织精神泡沫活动下瓦解，但本协议中未考虑。

在这里，概述了用利索切成像治疗DVT的台式方法。该协议描述了组织精神来源的关键操作参数、治疗疗效评估和图像引导。该协议包括设计一个流动通道，模仿虹膜静脉部分和制造人类整个血块。实验过程概述了组织条纹源和成像阵列的定位，以实现沿放置在流道中的血块进行组织直视暴露。定义了相关的振振参数，以实现血块中断和最小化目标外的气泡活动。使用超声波成像来指导和评估气泡活动，如图所示^。量化治疗疗效的指标，如血块质量损失，D-dimer（纤维解析），和血红蛋白（溶血）概述23，24，25，26，27。总的来说，这项研究为执行和评估淋病治疗DVT的疗效提供了有效的手段。

研究方案

对于这里提出的结果，经当地内部审查委员会（IRB #19-1300）批准，以及志愿者捐赠者²⁴日提供的书面知情同意后，将静脉血抽到血块中形成血块。本节概述了评估利索皮条疗效的设计方案。该协议是根据博伦等人²⁴日以前的工作制定的。

1. 克洛特建模

注意:在实验当天的2周内，但超过3天，以确保血块的稳定性，并最大限度地收回^28。在获得当地机构审查委员会批准后准备血块。

1. 准备储存血液的硅酸盐巴斯德移液器（参见移液器规格的 材料表 ）。由于促进血小板活化和血栓^缩回的材料的亲水性质，使用玻硅酸盐管。通过在邦森燃烧器上加热来密封移液器的尖端。
2. 画出新鲜的人类静脉血。以每所所需血块2 mL增量抽取的总血液。将每个 2 mL 的阿利库特转移到一个巴斯德移液器。
   注:在抽血后约3分钟内执行第1.2步，以便血液在转移到移液器之前不会凝固。此外，确保自愿捐赠者不服用任何可能改变凝血级联的药物（例如血液稀释剂或血小板抑制剂）。
3. 在 37 °C 的水浴中将移液器内的血小块（等于所需的血块数量）孵育 3 小时。
4. 在4°C下将移液器存放至少3天，以收回血块^28。当血块缩回时，血清会被观察到在移液器内血块顶部积累。在收回²⁸后，血块的rt-PA反应在2周内保持稳定。

2. 水箱准备

1. 给水箱加满反渗透水。使用吸音材料将罐底表面排成一行，以减少治疗反射或成像超声波脉冲。使用水处理系统对水进行脱气和过滤，以最大限度地减少气泡核。
   注:过滤水的一种方法是使用内联过滤器。用于产生具有代表性结果的袋子的规格在 材料表中给出。
2. 将两个加热元件放在油箱底部表面。将水加热到37.3°C，以达到最大解质酶活性^30。
3. 设置图 1A中显示的流量通道。流道由管子、具有代表虹膜静脉的材料和几何特性的模型容器、等离子体储层以及储层最端的注射器（材料表）组成。注射器连接到泵上，以调节实验期间通过通道的流量。
4. 在脱气/过滤/加热阶段（步骤 2.1 和 2.2）期间手动淹没水箱中的流道，使水道达到物理温度。

3. 等离子体和 rt-PA 混合物的制备

1. 在实验日之前
   注:当存储在-80°C，等离子体是稳定的至少2.5年³¹ 和rt-PA是稳定的至少7年^32。因此，在这些期间内随时执行步骤 3.1 以确保两个组件的稳定性。
   1. 将从制造商获得的粉末状 rt-PA 稀释到无菌水中的 1 毫克/毫升。
   2. Aliquot 100 μL 稀释 rt-PA 进入 0.5 mL 离心机管，并存储在 -80 °C 下。
   3. 50 mL 离心机管中 35 mL 的人体新鲜冷冻 O 型等离子体。将管子存放在 -80 °C 下。
2. 在实验日
   1. 从冰箱中取回等离子体等离子体。检索当天要测试的血块数量一样多的白化物。将冷冻的白糖浸入37°C的水浴中解冻（+10分钟）。
   2. 一旦等离子体解冻，倒入用超纯水三倍冲洗的烧杯中。用铝箔轻轻盖住烧嘴口，防止污染，并将烧嘴放入水浴中。让铝箔足够松动，让空气接触等离子体。
   3. 让等离子体在37°C的大气压力下平衡至少2小时。
   4. 取出冷冻的 rt-PA 小瓶，放在冰上直到需要为止，每次实验运行时都有一个小瓶。
   5. 在 50 mL 烧瓶中，通过在超纯水中溶解高糖，使低凝胶糖（2%）。选择总量的阿加罗斯溶液，以便每个标本分析大约 2 mL。在微波炉中的烧瓶中加热溶液，直到冒泡。用防水螺丝盖固定烧瓶。将烧瓶浸入水浴中，与等离子体一起浸入水中。
      注:此步骤可确保在组织直振后可用于保护暴露的血块片段，以便进行组织学分析。

4. 设置组织心理源和成像阵列

1. 使用制造商提供的指示和命令，确保机动定位器能够从编程平台的运行时间环境中进行控制。检查系统的电机是否与运行时间环境的计算机的相应端口相连。
2. 如 图1B所示，在机动定位系统上安装组织心理源。
3. 通过制造商指定的适当连接器（如 BNC 电缆）将组织直线器源连接到其驱动电子设备（例如功率放大器和功能发生器）。
   注:确保组织精神源的驱动电子设备可以通过第 4.1 步使用的运行时间环境进行控制。
4. 用探针盖覆盖成像阵列，并将阵列可轴向地贴在直系肌源的光圈中，如图 2所示。请务必了解成像平面相对于组织条纹源的方向。
5. 将成像阵列连接到超声波扫描系统。确保该系统能够根据扫描仪制造商提供的命令控制成像阵列的操作和触发，并收集成像数据。
6. 将组织条纹源/成像阵列浸入油箱中，同时像 图1A所示，进行排气。使用注射器从组织精神来源或成像阵列表面轻轻去除任何气泡。
   注:操作前将组织精神源和成像阵列完全浸入水中。避免接触组织条纹源的表面。
7. 使用成像阵列和扫描仪的内置命令以每秒 20 帧的速度获取 B 模式图像。调整成像窗口，确保这些实时图像中组织条纹源的焦点可视化。
   注:假定治疗来源的重点区域的尺寸是已知的。
8. 设置组织条纹源的操作参数， 包括基本频率（例如，1.5 MHz）、脉冲重复频率（例如，20-100 Hz）、脉冲持续时间（例如，每个脉冲1-20个周期）和每个位置的脉冲总数（例如，100-2，000）18、23、24、33。如果未实现足够的血块裂解，或者气泡活动超出模型容器的流明，则修改这些参数。要设置这些参数，请使用源制造商提供的协议或使用可以与源通信的编程平台（第 4.3 步）。
9. 使用第 4.8 步中使用的制造商协议或编程平台，仅在脱气水中运行设置参数的组织条纹源，在周围环境中没有任何阻碍。增加施加到组织条纹源的电压，直到形成气泡云。
10. 使用第 4.7 步的实时成像，调整共焦传感器打开内的成像阵列的位置，直到气泡云位于图像窗口的中心。气泡云是成像平面中超音速像素的区域（图3）。拧紧螺丝，将成像阵列牢牢地固定在传感器开口中。
    注:如果阵列对齐正确，气泡云的气泡位置应约为成像平面的 0 mm。成像阵列可能从治疗源的内部表面略有投影，因此气泡云的范围位置可能与源焦距不同。
11. 识别成像平面中的气泡云位置。将组织条纹源的焦点分配为气泡云的中心（图3）。
12. 记录成像窗口中检测到的焦距位置（步骤 4.11）（图 3）。标记焦距位置的可能方法是放置光标，以注明成像窗口中的位置（如果与成像平台一起可用）。
13. 停止调谐，并将应用于组织条纹源的电压设置为 0 V。

5. 克洛特准备

1. 用钳子切割密封端，从移液器中取出血块。让血块与血清一起滑入培养皿中。如果血块不脱落，通过盐水冲洗轻轻施加来自移液器另一端的压力，以去除血块。
2. 使用手术刀将血块切割到 1 厘米长，目标是从中心获得一块均匀的块（即远离移液器顶部或底部形成的血块部分）。
3. 使用清洁擦拭轻轻涂抹血块的切口部分，以去除多余的液体。
4. 使用钳子，将血块部分轻轻放在称重秤上并记录重量。
5. 手动将流道从水箱中抬出，并将模型容器从流道中移出。
6. 使用钳子将血块放在模型容器中，并将模型容器再次连接到流道上。
   注:尼龙棒可以放置在模型容器内，以防止血块因流量而向下游移动。
7. 降低进入储罐的流量通道，使相对于储层的阶段近端与相差一侧相比较低。当等离子体通过第 6.1 步通过流动通道绘制时，以这种方式对舞台进行垂钓可防止模型容器中气泡的捕获。
8. 使用移液器向储层添加 30 mL 等离子体，并监控温度，直到温度达到至少 36 °C。
9. 使用移液器将 rt-PA（30 mL 等离子体中的 80.4 μg，2.68 μg/mL）分配到等离子储层中。用移液器搅拌等离子体，以确保在储层内均匀的 rt-PA 分布。

6. 启动流量通道

1. 通过注射器泵将等离子体从储层中抽入流道，直到等离子体填充模型容器。
   注意:如果血块没有与尼龙棒齐平，请使用 60 mL/min 的短泵抽水，尝试迫使血浆向下游的血块或手动抽取通过注射器。限制在此过程中绘制的等离子体量，或使用额外的等离子体/rt-PA 重新填充储层，以确保流道中的溶液为 30 mL。
2. 使用电动定位器，使用成像脚本（步骤 4.7）将成像阵列与血块长度平行。平行对齐使用户能够在视觉上确保血块的正确放置和模型容器内没有气泡。
3. 手动和视觉上对模型容器进行平级，确保使用成像窗口（第 4.7 步）不存在气泡。

7. 实验程序

1. 治疗前
   注:此步骤是规划一条路径，用于组织条纹源/成像阵列，以便沿着血块长度进行均匀的组织条纹暴露。
   1. 使用电动定位器对齐成像阵列，使成像平面与血块的横截面平行（即垂直于第 6.2 步中描述的方向）。
   2. 在通过成像窗口（第 4.7 步）的引导下，使用电动定位器将组织切合源移动到与储层相对的血块的近端。此时，调整组织条纹源位置，使步骤 4.12 中的标记焦距与血块中心对齐。
   3. 确定沿血块长度的振振路径。要定义此路径，沿血块长度设置三个路点（即在血块中包含组织气泡活动的电机位置），以 5 mm 的增量。对齐路径点，使沿路径的组织条纹源的整体运动与系统中的流量一起升级（即，第一个路口位于相对于储层的血块的最近端，第三个路口相对于储层处于令人失望的位置）。
   4. 在确定每个航点之前，从直方体源发射的火测试脉冲与步骤 4.8 具有相同的振振参数，但将总体暴露在 10 个总脉冲中。如有必要，使用电动定位器调整组织条纹源的位置，以控制血块内的气泡活动。
   5. 在每个航点，使用制造商提供的命令（类似于步骤 4.1）保存电机位置。
2. 治疗
   注:此步骤根据治疗前步骤中定义的路径定义沿其长度处理血块的程序。
   1. 以 0.65 mL/min 的速度运行注射器泵，等待等离子体的半月板移动。这个流速模仿了近乎完全封闭的虹膜血管^24，34。
   2. 将第 7.1.3 步创建的路径与固定步数大小（例如 0.5 mm）的既定路口之间的中间步骤进行插值。选择的步幅大小小于沿血块长度（成像阵列的高程方向）测量的焦点区域宽度的一半。使用电机定位器在每个路径位置移动组织条纹源，其中第 4.8 步中定义了振振参数。
   3. 使用成像窗口（步骤 4.7）在每个路径位置应用组织条纹脉冲时监控/图像气泡活动。将图像集中在直面轴焦点上，图像尺寸覆盖在 azimuth 和范围内 15 mm。在每个位置应用直觉脉冲之前，通过在编程平台中创建脚本，获取 B 模式图像，以提供血块和模型容器的可视化。确保脚本使用制造商的命令与扫描仪建立通信。
   4. 在组织脉冲的应用过程中，在脚本第7.2.3步中实现声学排放的采集，在特写³⁵后形成被动空腔图像。每10个治疗脉冲后获得一个被动空腔图像。在 8 增量深度下应用平面时间获得 50 补偿，直到成像深度结束。选择适当的采集窗口大小，使整个信号从血块捕获与最小的能量损失，由于窗口^35。
   5. 如果存在脱靶气泡云，请与电动定位器就地调整传感器位置。
      注意:监视成像阵列中错过的触发器。调整已获取的成像数据集数量，以确保在随后的触发之前完成数据存储。

8. 实验后程序

1. 手动将模型容器从水箱中抬出，通过重力排出香水。请务必保持流量通道平移，以防止血块在排水过程中向下游和从模型容器中移出。
2. 通过以非常低的流速从流道中抽取等离子溶液通过注射器泵，收集整个香水，在小烧嘴（图4A）中进行进一步分析。
3. 断开模型容器并移除血块。如有必要，将少量盐水注入模型容器，轻轻地清除血块。
4. 擦拭类似于步骤 1.2.3 的血块。在称量秤上称量血块，以评估血块质量损失。
5. 要分析 D-dimer 含量，在微中心管中加入 100 毫克氨基丙酸，然后加入 1 mL 的香水，然后使用移液器混合好。执行乳胶免疫浊度测定，以量化样本³⁶中的D-dimer。
6. 要评估溶血，在离心机管中加入1mL香水，在610 x g（3，500 rpm）下旋转10分钟。 将0.5mL超高纳坦（浓缩物）与0.5mL的德拉布金斯溶液混合，让混合物在室温下休息15分钟。 将 200 μL 转移到井板，如图4B所示。使用板读卡器读取 540 nm 的吸水性，图 4C（德拉布金斯测定^37）。
7. 团体学评估
   1. 用手术刀从血块中心切开一段长约2-3毫米的血块。
   2. 将部分添加到盒式磁带中。保持该节相对于组织直方体脉冲传播方向的方向。
   3. 将第 3.2.5 步准备的 2 mL 低凝胶糖溶液添加到盒式磁带中，以固定到位的血块。
   4. 将样品固定在 10% 正式素中 24 小时。将样品在24小时后将样品放入70%的酒精中，并执行标准的血氧西林-奥辛染色^38。

9. 被动空腔图像分析

1. 使用基于强健的 Capon 光束前³⁹ 的算法处理在组织精神激发期间从成像阵列获得的信号（第 7.2.4 步），以创建每个处理位置气泡云产生的声学辐射图像。
   注:要生成定量图像，请按照 Haworth 等人描述的^{步骤进行生成}。否则，图像中的每个像素值应表示每个对应位置的相对气泡云声能量（V²单位）。
2. 将 B 模式图像分段为 7.2.3 步，以区分表示血块的像素和模型容器。
3. 与 图 5B中显示的 B 模式图像共同注册被动空腔图像。总结暴露期³⁵期间血块内的声学能量。

结果

本研究中概述的协议突出了静脉血块建模、血栓中断的裂解和 DVT 体外设置中的超声波成像的细节。通过的程序演示了评估由于 rt-PA 和组织条纹气泡云活动的综合影响而所需的步骤。台式机设置旨在模仿静脉虹膜静脉的特征。 图1A 显示了具有虹膜静脉声学、机械性和几何特性的模型容器。血块被放置在模型容器内，以模仿部分封闭的血栓。血块以0.65 mL/min的速度从储层中抽?...

讨论

拟议的协议提出了一个模型来量化淋病的治疗效果。虽然已经讨论了关键细节，但要使本议定书取得成功，需要考虑某些关键方面。rt-PA的酶活性有阿雷纽斯温度依赖^性30。温度也是水和组织中声音速度的一个促成因素，温度的变化可能导致焦点区几何形状的轻微变化。因此，水温应在37°C下小心调节。协议中使用的 rt-PA 剂量 （2.68 μg/mL） 与临床上用于其他药理机械血栓切除术?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing sheets	Precision acoustics	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes	Fisher Scientific	1367820A	14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL capacity
Drabkin's assay	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Draw syringe	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Filter bags	McMaster-Carr	5162K111	Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing	McMaster-Carr	5154K25	Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements	Won Brothers	HT 300 Titanium	Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array	Verasonics	L11-5v	128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose	Millipore Sigma	A9414
Model vessel	McMaster-Carr	5234K98	6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma frozen within 24 hours
Plate reader	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	For haemoglobin quantification
Probe cover	Civco	610-362
Programming platform	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservoir	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Syringe pump	Cole-Parmer	EW-74900-20	pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer	In-house customized		Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system	Verasonics		Vantage Research Ultrasound System
Water tank	Advanced acrylics	C133	14 x 14 x 12, 1/2"