JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Гистотрипсия с помощью литической доставки или лизотрипсии находится в стадии разработки для лечения тромбоза глубоких вен. Процедура in vitro представлена здесь для оценки эффективности этой комбинированной терапии. Обсуждаются ключевые протоколы для модели сгустка, руководство по изображению и оценка эффективности лечения.

Аннотация

Тромбоз глубоких вен (ТГВ) является глобальной проблемой здравоохранения. Основным подходом к достижению реканализации сосудов при критических препятствиях являются тромболитики, направленные на катетер (CDT). Для смягчения едких побочных эффектов и длительного времени лечения, связанного с CDT, разрабатываются адъювантные и альтернативные подходы. Одним из таких подходов является гистотрипсия, сфокусированная ультразвуковая терапия для абляции тканей через заромание пузырьковых облаков. Доклинические исследования продемонстрировали сильную синергию между гистотрипсией и тромболитиками для деградации сгустка. В этом отчете описывается настольный метод оценки эффективности тромболитической терапии с помощью гистотрипсии или лизотрипсии.

Сгустки, изготовленные из свежей венозной крови человека, были введены в прототочный канал, размеры и акустомеханические свойства которого имитируют подвычеловечную вену. Канал перфузировали плазмой и литическим рекомбинантным активатором плазминогена тканевого типа. Пузырьковые облака были сгенерированы в сгустке с помощью сфокусированного ультразвукового источника, предназначенного для лечения бедренных венозных сгустков. Моторизованные позиционеры использовались для перевода фокуса источника по длине сгустка. В каждом месте инсонации акустические излучения пузырькового облака пассивно регистрировались и формировались пучком для создания пассивных кавитационных изображений. Показатели для оценки эффективности лечения включали потерю массы сгустка (общая эффективность лечения) и концентрации D-димера (фибринолиз) и гемоглобина (гемолиз) в перфузате. Существуют ограничения для этой конструкции in vitro, в том числе отсутствие средств для оценки побочных эффектов in vivo или динамических изменений скорости потока по мере того, как сгусток лизируется. В целом, установка обеспечивает эффективный метод оценки эффективности стратегий на основе гистотрипсии для лечения ТГВ.

Введение

Тромбоз - это состояние образования сгустка в здоровом кровеносном сосуде, который препятствует циркуляции1,2. Венозная тромбоэмболия имеет ежегодные расходы на здравоохранение в размере 7-10 миллиардов долларов, с 375 000-425 000 случаев в Соединенных Штатах3. Тромбоэмболия легочной артерии является обструкцией легочной артерии и является наиболее серьезным последствием венозной тромбоэмболии. Основным источником легочной обструкции являются тромбы глубоких вен, в первую очередь из подвычелюстных венозных сегментов4,5,6. Тромбоз глубоких вен (ТГВ) имеет врожденные последствия, помимо легочных обструкций, с долгосрочными осложнениями, которые приводят к боли, отеку, изъязвлению ног и ампутациям конечностей7,8,9. Для критических обструкций катетерные тромболитики (CDT) являются фронтальным подходом для реканализации сосудов10. Исход CDT зависит от ряда факторов, включая возраст тромба, местоположение, размер, состав, этиологию и категорию риска пациента11. Кроме того, CDT связан с повреждением сосудов, инфекциями, осложнениями кровотечения и длительным временемлечения 10. Устройства следующего поколения направлены на сочетание механической тромбэктомии с тромболитиками (т.е. фармакомеханической тромбэктомией)12,13. Использование этих устройств снижает литическую дозировку, что приводит к уменьшению осложнений кровотечения и сокращениювремени лечения на 12,13,14 по сравнению с CDT. Эти устройства по-прежнему сохраняют проблемы геморрагических побочных эффектов и неполного удаления хронических тромбов15. Таким образом, необходима адъювантная стратегия, которая может полностью удалить тромб с более низкими осложнениями кровотечения.

Одним из потенциальных подходов является тромблитическое лечение с помощью гистотрипсии, называемое лизотрипсией. Гистотрипсия является неинвазивным методом лечения, который использует сфокусированный ультразвук для нуклеатильных пузырьковых облаков в тканях16. Пузырьковая активность генерируется не через экзогенные ядра, а путем применения ультразвуковых импульсов с достаточным напряжением для активации ядер, присущих тканям, включая сгусток17,18. Механическое колебание пузырькового облака придает деформацию сгустку, распадая структуру на бесклеточные обломки19. Гистотрипсия активности пузырьков обеспечивает эффективную деградацию втянутых и невытягивающихся тромбов как invivo,так и in vitro20,21,22. Предыдущие исследованияпоказали 23,24 продемонстрированные, что сочетание гистотрипсии и литического рекомбинантного активатора плазминогена тканевого типа (rt-PA) значительно повышает эффективность лечения по сравнению с только литическим или только гистотрипсией. Предполагается, что два основных механизма, связанных с активностью пузырьков гистотрипсии, ответственны за повышение эффективности лечения: 1) увеличение фибринолиза из-за усиленной доставки литики и 2) гемолиз эритроцитов в сгустке. Основная часть массы сгустка состоит из эритроцитов24,и, следовательно, отслеживание деградации эритроцитов является хорошим суррогатом для абляции образца. Другие сформированные элементы сгустка также, вероятно, распадаются под действием активности пузырьков гистотрипсии, но не рассматриваются в этом протоколе.

Здесь изложен настольный подход к лечению ТГВ in vitro с помощью лизотрипсии. Протокол описывает критические рабочие параметры источника гистотрипсии, оценку эффективности лечения и руководство по изображению. Протокол включает в себя проектирование протокового канала для имитации подвечерно-бедренного венозного сегмента и производство цельных сгустков крови человека. Экспериментальная процедура описывает позиционирование источника гистотрипсии и массива изображений для достижения экспозиции гистотрипсии вдоль сгустка, помещенного в канал потока. Определены соответствующие параметры инсонации для достижения разрушения сгустка и минимизации нецелевой активности пузырьков. Использование ультразвуковой визуализации для руководства и оценки активности пузырьков проиллюстрировано24. Показатели для количественной оценки эффективности лечения, такие как потеря массы сгустка, D-димер (фибринолиз) и гемоглобин (гемолиз), изложены23,24,25,26,27. В целом, исследование предоставляет эффективные средства для выполнения и оценки эффективности лизотрипсии для лечения ТГВ.

протокол

Для результатов, представленных здесь, венозная человеческая кровь была взята с образованием сгустков после одобрения местного внутреннего наблюдательного совета (IRB #19-1300) и письменного информированного согласия, предоставленного добровольными донорами24. В этом разделе описывается протокол проектирования для оценки эффективности лизотрипсии. Протокол основан на предыдущей работе Bollen et al.24.

1. Моделирование сгустка

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте сгустки в течение 2 недель, но более чем за 3 дня до дня эксперимента, чтобы обеспечить стабильность сгустка и максимизировать втягивание28. Подготовьте сгусток после одобрения местным институциональным наблюдательным советом.

  1. Подготовьте боросиликатную пипетку Пастера для хранения крови (см. Таблицу материалов для спецификаций пипетки). Боросиликатные трубки используются из-за гидрофильной природы материала, который способствует активации тромбоцитов и втягивания сгустка29. Запечатайте наконечник пипетки с помощью нагрева над горелкой Бунзена.
  2. Нарисуйте свежую венозную кровь человека. Аликвот общая кровь, взятая с шагом 2 мл на желаемый сгусток. Переложите каждые 2 мл аликвоты на одну пипетку Пастера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаг 1.2 в течение примерно 3 минут после забора крови, чтобы кровь не сгустись перед переходом в пипетки. Кроме того, убедитесь, что донор-доброволец не принимает никаких лекарств, которые могут изменить каскад свертывания крови (например, разбавители крови или ингибиторы тромбоцитов).
  3. Инкубировать аликвоты крови в пипетках (равные требуемому количеству сгустков) на водяной бане в течение 3 ч при 37 °C.
  4. Храните пипетки в течение минимум 3 дней при 4 °C, чтобы обеспечить втягивание сгустков28. По мере втягивания сгустков будет наблюдаться накопление сыворотки в верхней части сгустка внутри пипетки. Реакция rt-PA сгустков остается стабильной в течение 2 недель после втягивания28.

2. Подготовка резервуара для воды

  1. Наполните резервуар для воды водой обратного осмоса. Выровнуйте нижнюю поверхность резервуара акустическим поглощающим материалом, чтобы уменьшить отражение терапии или визуализации ультразвуковых импульсов. Используйте систему обработки воды для дегаза и фильтрации воды, чтобы свести к минимуму пузырьковые ядра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из способов фильтрации воды является использование встроенного фильтра. Технические характеристики мешка, используемого для получения репрезентативных результатов, приведены в Таблице материалов.
  2. Поместите два нагревательных элемента на нижнюю поверхность резервуара. Нагрейте воду до 37,3 °C для достижения максимальной литической ферментативной активности30.
  3. Настройте канал потока, как показано на рисунке 1A. Прототочный канал состоит из трубки, модельного сосуда с материалом и геометрическими свойствами, представляющими подвешенную вену, резервуара для плазмы и шприца на дистальном самом конце резервуара(Таблица материалов). Шприц подключается к насосу для регулирования потока через канал во время эксперимента.
  4. Вручную погружите проточные каналы в резервуар для воды, чтобы довести канал до физиологической температуры во время стадии дегазации/фильтрации/нагрева (этапы 2.1 и 2.2).

3. Приготовление плазменной и rt-PA смеси

  1. Перед экспериментом
    ПРИМЕЧАНИЕ: При хранении при -80 °C плазма стабильна в течение по меньшей мере 2,5 лет31 и rt-PA стабильна в течение не менее 7 лет32. Поэтому выполните шаг 3.1 в любое время в течение этих периодов, чтобы обеспечить стабильность двух компонентов.
    1. Разбавляют rt-PA, полученный от производителя, в порошкообразной форме до 1 мг/мл в стерильной воде.
    2. Аликвот 100 мкл разбавленного RT-PA в 0,5 мл центрифужных трубок и хранит их при -80 °C.
    3. Aliquot 35 мл свежезамороженной плазмы человека типа О в 50 мл центрифужных пробирок. Храните тубы при -80 °C.
  2. В день эксперимента
    1. Извлеките аликвоты плазмы из морозильной камеры. Извлеките столько аликвот, сколько сгустков будет проверено в этот день. Погрузите замороженные аликвоты в водяную баню при 37 °C до оттаивания (~10 мин).
    2. Как только плазма разморозится, налейте ее в замок, который трижды промывается сверхчистой водой. Слегка прикройте ротовую часть закройки алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить загрязнение, и поместите его на водяную баню. Позвольте фольге быть достаточно свободной, чтобы воздух контактил с плазмой.
    3. Пусть плазма уравновешивается при 37 °C до атмосферного давления в течение не менее 2 ч.
    4. Выньте замороженные флаконы rt-PA и положите на лед до тех пор, пока это не понадобится, с одним флаконом для каждого эксперимента.
    5. Сделайте агарозу с низким содержанием гелеобразования (2%) в колбе 50 мл, растворив агарозу в сверхчистой воде. Выберите общее количество раствора агарозы таким образом, чтобы для каждого анализируемого образца было доступно примерно 2 мл. Разогрейте раствор в колбе в микроволновой печи до пузырьков. Закрепите колбу водонепроницаемой винтовой крышкой. Погрузите колбу в водяную баню вместе с плазмой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг гарантирует, что агароза доступна для защиты открытых сегментов сгустка для гистологического анализа после инсонации гистотрипсии.

4. Настройка источника гистотрипсии и массива изображений

  1. Убедитесь, что моторизованными позиционорами можно управлять из среды выполнения платформы программирования, используя указания и команды, предоставленные производителем. Убедитесь, что двигатели системы подключены к соответствующему порту компьютера со средой выполнения.
  2. Установите источник гистотрипсии на моторизованную систему позиционирования, как показано на рисунке 1B.
  3. Подключите источник гистотрипсии к его движущей электронике (например, усилителю мощности и генератору функций) через соответствующие разъемы (например, кабели BNC), указанные производителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что управляющая электроника источника гистотрипсии может управляться через среду выполнения, используемую на шаге 4.1.
  4. Накройте массив визуализации крышкой зонда и прикрепите массив коаксиально в отверстии источника гистотрипсии, как показано на рисунке 2. Обязательно поймите ориентацию плоскости изображения относительно ориентации источника гистотрипсии.
  5. Подключите массив изображений к системе ультразвукового сканирования. Убедитесь, что эта система может контролировать работу и запуск массива изображений, а также собирать данные визуализации в соответствии с командами, предоставленными производителем сканера.
  6. Погрузьте источник гистотрипсии/массив визуализации в резервуар во время дегазирования, как показано на рисунке 1А. Осторожно удалите пузырьки воздуха с помощью шприца с поверхности источника гистотрипсии или массива изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью погрузить источник гистотрипсии и массив визуализации в воду перед операцией. Избегайте прикосновения к поверхности источника гистотрипсии.
  7. Получайте изображения в режиме B со скоростью 20 кадров в секунду с помощью массива изображений и встроенных команд сканера. Отрегулируйте окно изображения, чтобы обеспечить визуализацию фокуса источника гистотрипсии на этих изображениях в режиме реального времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что размеры очаговой области терапевтического источника известны.
  8. Установите рабочие параметры источника гистотрипсии, включая фундаментальную частоту (например, 1,5 МГц), частоту повторения импульсов (например, 20-100 Гц), длительность импульса (например, 1-20 циклов на импульс) и общее количество импульсов на место (например, 100-2000)18,23,24,33. Модифицируйте эти параметры, если достаточный лизис сгустка не достигнут или если активность пузырьков выходит за пределы просвета модельного сосуда. Чтобы задать эти параметры, используйте протокол, предоставленный производителем исходного кода, или используйте программную платформу, которая может взаимодействовать с источником (шаг 4.3).
  9. Используя протокол производителя или программную платформу, используемую на шаге 4.8, запустите источник гистотрипсии по заданным параметрам только в дегазированной воде, без каких-либо препятствий в окружающей среде. Увеличьте напряжение, приложенное к источнику гистотрипсии, пока не образуется пузырьковое облако.
  10. Используя визуализацию в реальном времени, как по указано в шаге 4.7, отрегулируйте положение массива изображений внутри отверстия конфокального преобразователя до тех пор, пока пузырьковое облако не будет расположено примерно в центре окна изображения. Пузырьковое облако представляет область гиперэхоических пикселей в плоскости изображения(рисунок 3). Затяните винты, чтобы прочно удерживать матрицу изображений в отверстии преобразователя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если массив выровнен правильно, азимутальное положение пузырькового облака должно быть приблизительно на уровне 0 мм в плоскости изображения. Массив визуализации может незначительно проецируемься от внутренней поверхности источника терапии, и поэтому положение диапазона пузырькового облака может отличаться от фокусного расстояния источника.
  11. Определите расположение пузырькового облака в плоскости изображения. Назначьте фокус источника гистотрипсии в качестве центра пузырькового облака(рисунок 3).
  12. Запишите обнаруженное фокального местоположения (шаг 4.11) в окне визуализации(рисунок 3). Возможным способом пометить фокальную позицию является помещение курсора для записи местоположения в окне изображения, если оно доступно с платформой визуализации.
  13. Прекратите инсонацию и установите напряжение, приложенное к источнику гистотрипсии, на 0 В.

5. Подготовка сгустка

  1. Извлеките сгусток из пипетки, разрезав герметичный конец плоскогубцами. Дайте сгустку скользить в чашку Петри вместе с сывороткой. Если сгусток не смещается, осторожно надавите на другой конец пипетки через солевой промывку, чтобы удалить сгусток.
  2. Сгусток разрезают до 1 см длиной с помощью скальпеля, нацеливаясь на однородный кусок от центра (т.е. подальше от участков сгустка, образованных в верхней или нижней части пипетки).
  3. Используйте чистящую салфетку, чтобы аккуратно промокните вырезанный участок сгустка, чтобы удалить лишнюю жидкость.
  4. С помощью пинцета аккуратно поместите сгусток на весы и запишите вес.
  5. Вручную поднимите канал потока из резервуара для воды и извлеките модель сосуда из протокового канала.
  6. Поместите сгусток в модельный сосуд с помощью пинцета и снова прикрепите модельный сосуд к каналу потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейлоновый стержень может быть помещен в сосуд модели, чтобы предотвратить движение сгустка вниз по течению из-за потока.
  7. Опустите канал потока в резервуар таким образом, чтобы проксимальный конец ступени относительно резервуара был низким по сравнению с дистальной стороной. Таким образом, улавливание ступени предотвращает улавливание пузырьков в модельном сосуде при втягивании плазмы через канал потока на шаге 6.1.
  8. Добавьте 30 мл плазмы в резервуар с помощью пипетки и контролируйте температуру до тех пор, пока она не достигнет не менее 36 °C.
  9. Используйте пипетку для дозирования rt-PA (80,4 мкг в 30 мл плазмы, 2,68 мкг/мл) в плазменный резервуар. Перемешайте плазму с пипеткой, чтобы обеспечить равномерное распределение rt-PA в резервуаре.

6. Подкачка канала потока

  1. Втягивайте плазму в канал потока из резервуара через шприцевой насос до тех пор, пока плазма не заполнит сосуд модели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если сгусток не находится вровень с нейлоновым стержнем, используйте короткие вытягивания насоса со скоростью 60 мл / мин, чтобы попытаться заставить плазму после сгустка или вручную протянуть через шприц. Ограничьте количество плазмы, втягиваемой в этом процессе, или заправьте резервуар с помощью дополнительной плазмы / rt-PA для обеспечения 30 мл раствора в канале потока.
  2. Используя моторизованные позиционеры, выровняйте массив изображений параллельно длине сгустка с помощью сценария визуализации (шаг 4.7). Параллельное выравнивание позволяет пользователю визуально обеспечить правильное размещение сгустка и отсутствие пузырьков внутри модельного сосуда.
  3. Выровньте модель судна вручную и визуально убедитесь, что с помощью окна визуализации нет пузырьков воздуха (шаг 4.7).

7. Процедура эксперимента

  1. Предварительная обработка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в планировании пути для источника гистотрипсии / массива изображений для равномерного воздействия гистотрипсии по длине сгустка.
    1. Выровняйте массив изображений с помощью моторизованных позиционеров таким образом, чтобы плоскость изображения была параллельна поперечному сечению сгустка (т.е. перпендикулярна ориентации, описанной на шаге 6.2).
    2. Под руководством через окно визуализации (шаг 4.7) переместите источник гистотрипсии к проксимальному концу сгустка относительно резервуара с помощью моторизованных позиционеров. На этом этапе отрегулируйте положение источника гистотрипсии таким образом, чтобы отмеченная фокусная точка на шаге 4.12 выравнивалась с центром сгустка.
    3. Определите путь инсонации по длине сгустка. Чтобы определить этот путь, установите три путевые точки по длине сгустка (т. Е. Положения двигателей, где активность пузырьков гистотрипсии содержится внутри сгустка) с шагом 5 мм. Выровнять путевые точки таким образом, чтобы общее движение источника гистотрипсии по пути было предшественным с потоком в системе (т. е. первая путевая точка находится в самом близком конце сгустка относительно резервуара, а третья путевая точка находится в дистальном положении относительно коллектора).
    4. Перед завершением каждой путевой точки огневые тесты импульсов от источника гистотрипсии с теми же параметрами инсонации, что и на шаге 4.8, но уменьшают общее воздействие до 10 общих импульсов. Отрегулируйте положение источника гистотрипсии с помощью моторизованных позиционеров, если это необходимо, чтобы сдержать пузырьковую активность внутри сгустка.
    5. В каждой путевой точке сохраняйте положение двигателя с помощью команд, предоставленных производителем, аналогично шагу 4.1.
  2. Лечение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг определяет процедуру обработки сгустка по его длине в соответствии с путем, определенным на этапе предварительной обработки.
    1. Запустите шприцевой насос со скоростью 0,65 мл/мин и подождите, пока мениск плазмы сдвинется с месте. Эта скорость потока имитирует почти полное окклюзию подвиженской сосудистой24,34.
    2. Интерполировать путь, созданный на шаге 7.1.3, промежуточными шагами между установленными путевыми точками с фиксированным размером шага (например, 0,5 мм). Размер шага выбирается менее половины ширины фокальной области, измеренной вдоль длины сгустка (высотное направление массива изображений). Перемещайте источник гистотрипсии с помощью моторизованных позиционеров в каждом месте контура с параметрами инсонации, определенными на шаге 4.8.
    3. Активность пузырьков монитора/изображения во время применения импульса гистотрипсии в каждом месте контура с помощью окна визуализации (шаг 4.7). Центрировать изображение на фокусе гистотрипсии с размерами изображения, охватывающими 15 мм по азимуту и диапазону. Перед применением импульса гистотрипсии в каждом месте приобретите изображение B-режима для обеспечения визуализации сгустка и модельного сосуда, создав скрипт на программной платформе. Убедитесь, что сценарий устанавливает связь со сканером с помощью команд производителя.
    4. Во время применения импульса гистотрипсии реализуют получение акустических излучений в скрипте на шаге 7.2.3 для формирования пассивных кавитационных изображений послеhoc 35. Получайте одно пассивное кавитационное изображение после каждых 10 лечебных импульсов. Примените компенсацию коэффициента усиления по фиксированному времени 50 на 8 приращенных глубинах до конца глубины изображения. Выберите подходящий размер окна сбора таким образом, чтобы весь сигнал от сгустка захватывался с минимальными потерями энергии из-за окна35.
    5. Если присутствуют нецелевые пузырьковые облака, отрегулируйте положение преобразователя на месте с помощью моторизованных позиционеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг пропущенных триггеров массива изображений. Отрегулируйте количество полученных наборов данных изображений, чтобы обеспечить выполнение хранения данных до последующего запуска.

8. Процедура после эксперимента

  1. Вручную поднимите сосуд модели из резервуара для воды, чтобы слить перфусат под действием силы тяжести. Убедитесь, что канал потока выровнялся, чтобы предотвратить движение сгустка вниз по течению и из корпуса модели во время дренажа.
  2. Соберите весь перфусат для дальнейшего анализа в небольшой ковш(рисунок 4А)путем извлечения плазменного раствора из протокового канала через шприцевой насос при очень низком расходе.
  3. Отсоедините модельный сосуд и удалите сгусток. При необходимости вводят небольшое количество физиологического раствора в модельный сосуд, чтобы аккуратно выбить сгусток.
  4. Протрите сгусток аналогично шагу 1.2.3. Взвесьте сгусток на весе для оценки потери массы сгустка.
  5. Чтобы проанализировать содержание D-димера, добавьте 100 мг аминокапроновой кислоты в микроцентрифужную трубку, а затем 1 мл перфузата и хорошо перемешайте с помощью пипетки. Выполнить латексный иммуно-турбидиметрический анализ для количественной оценки D-димера в образце36.
  6. Для оценки гемолиза добавляют 1 мл перфусата в центрифужные трубки и отжимают при 610 х г (3 500 об/мин) в течение 10 мин. Соедините 0,5 мл надпомного вещества (концентрата) с 0,5 мл раствора Драбкинса и дайте смеси отдохнуть при комнатной температуре в течение 15 мин. Переложить 200 мкл на пластины скважины, как показано на рисунке 4B. Используйте считыватель пластин для считывания поглощения при 540 нм, рисунок 4C (анализ Драбкинса37).
  7. Оценка гистологии
    1. Срезают скальпелем участок от центра сгустка длиной около 2-3 мм.
    2. Добавьте раздел в кассету. Сохраняйте ориентацию сечения относительно направления распространения импульса гистотрипсии.
    3. Добавьте 2 мл низкогелеобразующего раствора агарозы, приготовленного на этапе 3.2.5, в кассету, чтобы зафиксировать сгусток на месте.
    4. Зафиксируйте образец в 10% формалине в течение 24 ч. Поместите образец в 70% спирт через 24 ч и выполните стандартное окрашивание гемотоксилин-эозином38.

9. Пассивный кавитационный анализ изображения

  1. Обрабатывайте сигналы, полученные от массива изображений во время возбуждения гистотрипсии (этап 7.2.4), используя алгоритм, основанный на надежном пучкеCapon Beamformer 39, для создания изображения акустического излучения, генерируемого пузырьковым облаком в каждом месте обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы создать количественные изображения, выполните действия, описанные в Haworth et al.35. В противном случае каждое значение пикселя на изображении должно представлять относительную акустическую энергию пузырькового облака (единицыV2)в каждом соответствующем месте.
  2. Сегментируйте изображение в B-режиме, необходимое на шагах 7.2.3, чтобы различать пиксели, представляющие сгусток, и модель сосуда.
  3. Совместно зарегистрируйте пассивное кавитационное изображение с изображением B-режима, как показано на рисунке 5B. Суммируйте акустическую энергию внутри сгустка за период воздействия35.

Результаты

Протокол, изложенный в этом исследовании, подчеркивает детали моделирования венозного сгустка, лизотрипсии для разрушения сгустка и ультразвуковой визуализации в установке ТГВ in vitro. Принятая процедура демонстрирует шаги, необходимые для оценки разрушения сгустка из-за комбинирован?...

Обсуждение

В предлагаемом протоколе представлена модель для количественной оценки эффективности лечения лизотрипсии. Хотя ключевые детали были обсуждены, есть определенные критические аспекты, которые необходимо учитывать для успеха этого протокола. Ферментативная активность rt-PA имеет темпер...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения, грантом R01HL13334. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Кевина Хауорта за помощь в анализе Драбкина и д-ра Виктора Боллена за его поддержку в разработке протокола. Авторы также благодарны доктору Адаму Максвеллу за его руководство по разработке источника гистотрипсии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Absorbing sheetsPrecision acousticsF28-SMALL-M300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettesFisher Scientific1367820A14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubesEppendorf223641111.5 mL capacity
Drabkin's assaySigma AldrichD5941-6VL
Draw syringeCole-ParmerEW-07945-4360 mL capacity
Filter bagsMcMaster-Carr5162K111Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubingMcMaster-Carr5154K25Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elementsWon BrothersHT 300 TitaniumTitanium rods placed at the bottom of tank
Imaging arrayVerasonicsL11-5v128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agaroseMillipore SigmaA9414
Model vesselMcMaster-Carr5234K986.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure waterBarnsteadNanopure DiamondASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
PlasmaVitalant4PF000Plasma frozen within 24 hours
Plate readerBiotekSynergy Neo HST Plate ReaderFor haemoglobin quantification
Probe coverCivco610-362
Programming platformMATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)GenentechActivase
ReservoirCole-ParmerEW-07945-4360 mL capacity
Syringe pumpCole-ParmerEW-74900-20pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
TransducerIn-house customizedEight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning systemVerasonicsVantage Research Ultrasound System
Water tankAdvanced acrylicsC13314 x 14 x 12, 1/2"

Ссылки

  1. Oklu, R. Thrombosis. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, 131-133 (2017).
  2. Satoh, K., Satoh, T., Yaoita, N., Shimokawa, H. Recent advances in the understanding of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (6), 159-165 (2019).
  3. Grosse, S. D., Nelson, R. E., Nyarko, K. A., Richardson, L. C., Raskob, G. E. The economic burden of incident venous thromboembolism in the United States: A review of estimated attributable healthcare costs. Thrombosis Research. 137, 3-10 (2016).
  4. Hirsh, J., Hoak, J. Management of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Circulation. 93 (12), 2212-2245 (1996).
  5. Browse, N. L., Clemenson, G., Croft, D. N. Fibrinogen-detectable thrombosis in the legs and pulmonary embolism. British Medical Journal. 1 (5908), 603-604 (1974).
  6. Plate, G., Ohlin, P., Eklöf, B. Pulmonary embolism in acute iliofemoral venous thrombosis. British Journal of Surgery. 72 (11), 912-915 (1985).
  7. Chen, J. X., Sudheendra, D., Stavropoulos, S. W., Nadolski, G. J. Role of catheter-directed thrombolysis in management of iliofemoral deep venous thrombosis. Radiographics. 36 (5), 1565-1575 (2016).
  8. Kahn, S. R., Solymoss, S., Lamping, D. L., Abenhaim, L. Long-term outcomes after deep vein thrombosis: postphlebitic syndrome and quality of life. Journal of General Internal Medicine. 15 (6), 425-429 (2000).
  9. Oğuzkurt, L., Ozkan, U., Gülcan, O., Koca, N., Gür, S. Endovascular treatment of acute and subacute iliofemoral deep venous thrombosis by using manual aspiration thrombectomy: long-term results of 139 patients in a single center. Diagnostic and Interventional Radiology. 18 (4), 410-416 (2012).
  10. Lauw, M. N., Büller, H. R. . Current Approaches to Deep Vein Thrombosis. , 136-160 (2014).
  11. Kearon, C., et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. Chest. 141 (2), 419-496 (2012).
  12. Pouncey, A. L., et al. AngioJet Pharmacomechanical Thrombectomy and Catheter Directed Thrombolysis vs. Catheter Directed Thrombolysis Alone for the Treatment of Iliofemoral Deep Vein Thrombosis: A Single Centre Retrospective Cohort Study. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. , (2020).
  13. Tang, T., Chen, L., Chen, J., Mei, T., Lu, Y. Pharmacomechanical thrombectomy versus catheter-directed thrombolysis for iliofemoral deep vein thrombosis: a meta-analysis of clinical trials. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 25, (2019).
  14. Kuo, T. -. T., Huang, C. -. Y., Hsu, C. -. P., Lee, C. -. Y. Catheter-directed thrombolysis and pharmacomechanical thrombectomy improve midterm outcome in acute iliofemoral deep vein thrombosis. Journal of the Chinese Medical Association. 80 (2), 72-79 (2017).
  15. Donaldson, C. W., et al. Thrombectomy using suction filtration and veno-venous bypass: single center experience with a novel device. Catheterization and Cardiovascular Interventions. 86 (2), 81-87 (2015).
  16. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: Towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 145-162 (2015).
  17. Bader, K. B., Vlaisavljevich, E., Maxwell, A. D. For whom the bubble grows: Physical principles of bubble nucleation and dynamics in histotripsy ultrasound therapy. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1056-1080 (2019).
  18. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive thrombolysis using pulsed ultrasound cavitation therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (12), 1982-1994 (2009).
  19. Xu, Z., et al. Size measurement of tissue debris particles generated from pulsed ultrasound cavitational therapy-histotripsy. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (2), 245-255 (2009).
  20. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of tissue stiffness, ultrasound frequency, and pressure on histotripsy-induced cavitation bubble behavior. Physics in Medicine and Biology. 60 (6), 2271-2292 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Histotripsy thrombolysis on retracted clots. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (8), 1903-1918 (2016).
  22. Maxwell, A. D., et al. Noninvasive treatment of deep venous thrombosis using pulsed ultrasound cavitation therapy (histotripsy) in a porcine model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 22 (3), 369-377 (2011).
  23. Bader, K. B., et al. Efficacy of histotripsy combined with rt-PA in vitro. Physics in Medicine and Biology. 61 (14), 5253-5274 (2016).
  24. Bollen, V., et al. In vitro thrombolytic efficacy of single- and five-cycle histotripsy pulses and rt-PA. Ultrasound in Medicine & Biology. 46 (2), 336-349 (2020).
  25. Wang, Y. N., Khokhlova, T., Bailey, M., Hwang, J. H., Khokhlova, V. Histological and biochemical analysis of mechanical and thermal bioeffects in boiling histotripsy lesions induced by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (3), 424-438 (2013).
  26. Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Fibrin formation, structure and properties. Sub-Cellular Biochemistry. 82, 405-456 (2017).
  27. Devanagondi, R., et al. Hemodynamic and hematologic effects of histotripsy of free-flowing blood: implications for ultrasound-mediated thrombolysis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 26 (10), 1559-1565 (2015).
  28. Holland, C. K., Vaidya, S. S., Datta, S., Coussios, C. -. C., Shaw, G. J. Ultrasound-enhanced tissue plasminogen activator thrombolysis in an in vitro porcine clot model. Thrombosis Research. 121 (5), 663-673 (2008).
  29. Sutton, J. T., Ivancevich, N. M., Perrin, S. R., Vela, D. C., Holland, C. K. Clot retraction affects the extent of ultrasound-enhanced thrombolysis in an ex vivo porcine thrombosis model. Ultrasound in Medicine & Biology. 39 (5), 813-824 (2013).
  30. Shaw, G. J., Dhamija, A., Bavani, N., Wagner, K. R., Holland, C. K. Arrhenius temperature dependence of in vitro tissue plasminogen activator thrombolysis. Physics in Medicine & Biology. 52 (11), 2953 (2007).
  31. Pinto, J., et al. Human plasma stability during handling and storage: impact on NMR metabolomics. Analyst. 139 (5), 1168-1177 (2014).
  32. Shaw, G. J., Sperling, M., Meunier, J. M. Long-term stability of recombinant tissue plasminogen activator at -80 C. BMC Research Notes. 2 (1), 117 (2009).
  33. Maxwell, A. D., et al. Cavitation clouds created by shock scattering from bubbles during histotripsy. The Journal of the Acoustical Society of America. 130 (4), 1888-1898 (2011).
  34. Jensen, C. T., et al. Qualitative slow blood flow in lower extremity deep veins on doppler sonography: quantitative assessment and preliminary evaluation of correlation with subsequent deep venous thrombosis development in a tertiary care oncology center. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (9), 1867-1874 (2017).
  35. Haworth, K. J., Bader, K. B., Rich, K. T., Holland, C. K., Mast, T. D. Quantitative frequency-domain passive cavitation imaging. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 177-191 (2017).
  36. Hamano, A., et al. Latex immunoturbidimetric assay for soluble fibrin complex. Clinical Chemistry. 51 (1), 183-188 (2005).
  37. Drabkin, D. L., Austin, J. H. Spectrophotometric studies II. Preparations from washed blood cells; nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin. Journal of Biological Chemistry. 112 (1), 51-65 (1935).
  38. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
  39. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. The Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).
  40. Mori, K., Dwek, R. A., Downing, A. K., Opdenakker, G., Rudd, P. M. The activation of type 1 and type 2 plasminogen by type I and type II tissue plasminogen activator. Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 3261-3267 (1995).
  41. Righini, M., Perrier, A., De Moerloose, P., Bounameaux, H. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. Journal of Thrombosis and Haemostasis: JTH. 6 (7), 1059-1071 (2008).
  42. Hilleman, D. E., Razavi, M. K. Clinical and economic evaluation of the Trellis-8 infusion catheter for deep vein thrombosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 19 (3), 377-383 (2008).
  43. De Sensi, F., et al. Predictors of successful ultrasound guided femoral vein cannulation in electrophysiological procedures. Journal of Atrial Fibrillation. 11 (3), 2083 (2018).
  44. Vlaisavljevich, E., et al. Effects of ultrasound frequency and tissue stiffness on the histotripsy intrinsic threshold for cavitation. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (6), 1651-1667 (2015).
  45. Vlaisavljevich, E., et al. Histotripsy-induced cavitation cloud initiation thresholds in tissues of different mechanical properties. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (2), 341-352 (2014).
  46. Hendley, S. A., Paul, J. D., Bader, K. B. Mechanistic investigation of clot degradation via the action of histotripsy and thrombolytic. Joint AAPM | COMP Virtual Meeting. The American Association of Physics in Medicine. , (2020).
  47. Goss, S. A., Johnston, R. L., Dunn, F. Comprehensive compilation of empirical ultrasonic properties of mammalian tissues. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (2), 423-457 (1978).
  48. Duck, F. A., Duck, F. A. . Physical Properties of Tissues. , 137-165 (1990).
  49. Bader, K. B., Haworth, K. J., Maxwell, A. D., Holland, C. K. Post hoc analysis of passive cavitation imaging for classification of histotripsy-induced liquefaction in vitro. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (1), 106-115 (2018).
  50. Crake, C., et al. Enhancement and passive acoustic mapping of cavitation from fluorescently tagged magnetic resonance-visible magnetic microbubbles in vivo. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (12), 3022-3036 (2016).
  51. Gyongy, M., Coussios, C. Passive spatial mapping of inertial cavitation during HIFU exposure. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 57 (1), 48-56 (2010).
  52. Canney, M. S., Bailey, M. R., Crum, L. A., Khokhlova, V. A., Sapozhnikov, O. A. Acoustic characterization of high intensity focused ultrasound fields: A combined measurement and modeling approach. The Journal of the Acoustical Society of America. 124 (4), 2406-2420 (2008).
  53. Czaplicki, C., et al. Can thrombus age guide thrombolytic therapy. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 7, 186-196 (2017).
  54. Bajd, F., Vidmar, J., Blinc, A., Sersa, I. Microscopic clot fragment evidence of biochemo-mechanical degradation effects in thrombolysis. Thrombosis Research. 126 (2), 137-143 (2010).
  55. Wang, C., et al. Efficacy and safety of low dose recombinant tissue-type plasminogen activator for the treatment of acute pulmonary thromboembolism: a randomized, multicenter, controlled trial. Chest. 137 (2), 254-262 (2010).
  56. Arvanitis, C. D., Crake, C., McDannold, N., Clement, G. T. Passive acoustic mapping with the angular spectrum method. IEEE Transactions on Medical Imaging. 36 (4), 983-993 (2017).
  57. Khokhlova, V. A., et al. Histotripsy methods in mechanical disintegration of tissue: towards clinical applications. International Journal of Hyperthermia: The Official Journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group. 31 (2), 145-162 (2015).
  58. Roberts, W. W. Development and translation of histotripsy: current status and future directions. Current Opinion in Urology. 24 (1), 104-110 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены