Ein In-vitro-System zur Messung der thrombolytischen Wirksamkeit von Histotripsie und einem lytischen Medikament

Zusammenfassung

Zur Behandlung einer tiefen Venenthrombose befindet sich eine histotripsiegestützte lytische Abgabe oder Lysotripsie in der Entwicklung. Hier wird ein In-vitro-Verfahren vorgestellt, um die Wirksamkeit dieser Kombinationstherapie zu beurteilen. Schlüsselprotokolle für das Gerinnselmodell, die Bildführung und die Bewertung der Behandlungswirksamkeit werden diskutiert.

Zusammenfassung

Tiefe Venenthrombose (DVT) ist ein globales Gesundheitsproblem. Der primäre Ansatz zur Gefäßrekanalisation bei kritischen Obstruktionen sind kathetergerichtete Thrombolytika (CDT). Um ätzende Nebenwirkungen und die lange Behandlungszeit im Zusammenhang mit CDT zu mildern, werden adjuvante und alternative Ansätze entwickelt. Ein solcher Ansatz ist die Histotripsie, eine fokussierte Ultraschalltherapie zur Ablate von Gewebe durch Blasenwolkenkeimbildung. Präklinische Studien haben eine starke Synergie zwischen Histotripsie und Thrombolytika für den Gerinnselabbau gezeigt. Dieser Bericht beschreibt eine Benchtop-Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit der histotripsiegestützten thrombolytischen Therapie oder Lysotripsie.

Gerinnsel, die aus frischem menschlichem Venenblut hergestellt wurden, wurden in einen Strömungskanal eingeführt, dessen Abmessungen und akustomechanische Eigenschaften eine iliofemorale Vene nachahmen. Der Kanal wurde mit Plasma und dem lytischen rekombinanten Gewebetyp Plasminogenaktivator durchblutet. Blasenwolken wurden im Gerinnsel mit einer fokussierten Ultraschallquelle erzeugt, die für die Behandlung von femoralvenösen Gerinnseln entwickelt wurde. Motorisierte Positionierer wurden verwendet, um den Quellfokus entlang der Gerinnsellänge zu übersetzen. An jedem Insonationsort wurden akustische Emissionen aus der Blasenwolke passiv aufgezeichnet und beamgeformt, um passive Kavitationsbilder zu erzeugen. Metriken zur Messung der Behandlungswirksamkeit umfassten den Verlust der Gerinnselmasse (Gesamtwirksamkeit der Behandlung) und die Konzentrationen von D-Dimer (Fibrinolyse) und Hämoglobin (Hämolyse) im Perfusat. Es gibt Einschränkungen für dieses In-vitro-Design, einschließlich des Fehlens von Mitteln zur Beurteilung von In-vivo-Nebenwirkungen oder dynamischen Änderungen der Durchflussrate, wenn das Gerinnsel lysiert. Insgesamt bietet das Setup eine effektive Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit von Histotripsie-basierten Strategien zur Behandlung von TVT.

Einleitung

Thrombose ist der Zustand der Gerinnselbildung in einem ansonsten gesunden Blutgefäß, das die Durchblutung behindert^1,2. Venöse Thromboembolien haben jährliche Gesundheitskosten von 7-10 Milliarden US-Dollar, mit 375.000-425.000 Fällen in den Vereinigten Staaten³. Lungenembolie ist die Obstruktion der Lungenarterie und ist die schwerwiegendste Folge der venösen Thromboembolie. Die primäre Quelle der Lungenobstruktion sind tiefe Venenthrombolien, hauptsächlich aus iliofemoralen venenösen Segmenten^4,5,6. Tiefe Venenthrombose (DVT) hat inhärente Folgeerscheinungen neben Lungenobstruktionen, mit langfristigen Komplikationen, die zu Schmerzen, Schwellungen, Beingeschwüren und Gliedmaßenamputationen führen^7,8,9. Bei kritischen Obstruktionen sind kathetergerichtete Thrombolytika (CDT) der Frontline-Ansatz für die Gefäßrekanalisation¹⁰. Das Ergebnis der CDT hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter Thrombusalter, Ort, Größe, Zusammensetzung, Ätiologie und Patientenrisikokategorie¹¹. Darüber hinaus ist CDT mit Gefäßschäden, Infektionen, Blutungskomplikationen und langer Behandlungszeit verbunden¹⁰. Geräte der nächsten Generation zielen darauf ab, mechanische Thrombektomie mit Thrombolytika (d.h. pharmakomechanischer Thrombektomie) zu kombinieren^12,13. Die Verwendung dieser Geräte senkt die lytische Dosierung, was zu reduzierten Blutungskomplikationen führt, und verkürzt die Behandlungszeit^12,13,14 im Vergleich zu CDT. Diese Geräte behalten immer noch Probleme mit hämorrhagischen Nebenwirkungen und unvollständiger Entfernung chronischer Thromben¹⁵. Es bedarf daher einer adjuvanten Strategie, die den Thrombus mit geringeren Blutungskomplikationen vollständig entfernen kann.

Ein möglicher Ansatz ist die histotripsiegestützte thrombolytische Behandlung, die als Lysotripsie bezeichnet wird. Histotripsie ist eine nicht-invasive Behandlungsmodalität, die fokussierten Ultraschall verwendet, um Blasenwolken in Geweben zu nukleieren¹⁶. Die Blasenaktivität wird nicht über exogene Kerne erzeugt, sondern durch die Anwendung von Ultraschallimpulsen mit ausreichender Spannung, um Gewebekerne zu aktivieren, einschließlich Gerinnsel^17,18. Die mechanische Schwingung der Blasenwolke belastet das Gerinnsel und zerfällt die Struktur in azelluläre Trümmer¹⁹. Die Histotripsie-Blasenaktivität sorgt für einen effektiven Abbau von eingezogenen und nicht retraktierten Blutgerinnseln sowohl in vivo als auch in vitro^20,21,22. Frühere Studien haben^23,24 gezeigt, dass die Kombination von Histotripsie und dem lytischen rekombinanten Gewebetyp-Plasminogenaktivator (rt-PA) die Behandlungswirksamkeit im Vergleich zu lytischen allein oder Histotripsie allein signifikant erhöht. Es wird angenommen, dass zwei primäre Mechanismen, die mit der Histotripsie-Blasenaktivität verbunden sind, für die verbesserte Wirksamkeit der Behandlung verantwortlich sind: 1) erhöhte Fibrinolyse aufgrund einer verbesserten lytischen Abgabe und 2) Hämolyse der roten Blutkörperchen im Gerinnsel. Der Großteil der Gerinnselmasse besteht aus roten Blutkörperchen²⁴, und daher ist die Verfolgung des Erythrozytenabbaus ein guter Ersatz für die Ablation der Probe. Andere gebildete Gerinnselelemente werden wahrscheinlich auch unter Histotripsie-Blasenaktivität zerfallen, werden aber in diesem Protokoll nicht berücksichtigt.

Hier wird ein Benchtop-Ansatz zur Behandlung von TVT in vitro mit Lysotripsie skizziert. Das Protokoll beschreibt kritische Betriebsparameter der Histotripsiequelle, die Beurteilung der Behandlungswirksamkeit und die Bildführung. Das Protokoll umfasst die Entwicklung eines Strömungskanals zur Nachahmung eines iliofemoralen Venensegments und die Herstellung menschlicher Vollblutgerinnsel. Das experimentelle Verfahren beschreibt die Positionierung der Histotripsiequelle und des Bildgebungsarrays, um eine Histotripsie-Exposition entlang des im Strömungskanal platzierten Gerinnsels zu erreichen. Relevante Insonationsparameter, um gerinnselunterbrechungen zu erreichen und die Blasenaktivität außerhalb des Ziels zu minimieren, werden definiert. Die Verwendung von Ultraschallbildgebung zur Führung und Beurteilung der Blasenaktivität wird veranschaulicht²⁴. Metriken zur Quantifizierung der Behandlungswirksamkeit wie Gerinnselmassenverlust, D-Dimer (Fibrinolyse) und Hämoglobin (Hämolyse) werden^{23,24,25,26,27}beschrieben. Insgesamt bietet die Studie ein wirksames Mittel zur Durchführung und Bewertung der Wirksamkeit von Lysotripsie zur Behandlung von TVT.

Protokoll

Für die hier vorgestellten Ergebnisse wurde venöses menschliches Blut entnommen, um Gerinnsel zu bilden, nachdem das lokale interne Überprüfungsgremium (IRB # 19-1300) genehmigt und die schriftliche Einwilligung freiwilliger Spender²⁴erteilt wurde. In diesem Abschnitt wird ein Entwurfsprotokoll zur Beurteilung der Wirksamkeit der Lysotripsie beschrieben. Das Protokoll basiert auf einer früheren Arbeit von Bollen et al.²⁴.

1. Gerinnselmodellierung

HINWEIS: Bereiten Sie die Gerinnsel innerhalb von 2 Wochen, aber mehr als 3 Tage vor dem Tag des Experiments vor, um die Gerinnselstabilität zu gewährleisten und den Rückzug zu maximieren²⁸. Bereiten Sie das Gerinnsel nach der Genehmigung durch das lokale institutionelle Überprüfungsgremium vor.

1. Bereiten Sie die Borosilikat-Pasteur-Pipette für die Lagerung des Blutes vor (siehe Materialtabelle für Spezifikationen der Pipette). Borosilikatröhrchen werden wegen der hydrophilen Natur des Materials verwendet, die die Thrombozytenaktivierung und den Gerinnselrückzug fördert²⁹. Versiegeln Sie die Spitze der Pipette durch Erhitzen über einem Bunsenbrenner.
2. Ziehen Sie frisches menschliches Venenblut. Aliquot das gesamt entnommene Blut in 2-ml-Schritten pro gewünschtem Gerinnsel. Geben Sie jedes 2 ml Aliquot in eine Pasteur-Pipette.
   HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.2 innerhalb von ca. 3 Minuten nach der Blutentnahme aus, damit kein Blut gerinnt, bevor es in Pipetten überführt wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass der freiwillige Spender keine Medikamente einnimmt, die die Gerinnungskaskade verändern können (z. B. Blutverdünner oder Thrombozytenhemmer).
3. Inkubieren Sie die Blutaliquoten in den Pipetten (entspricht der Anzahl der benötigten Gerinnsel) in einem Wasserbad für 3 h bei 37 °C.
4. Lagern Sie die Pipetten mindestens 3 Tage bei 4 °C, um das Zurückziehen der Gerinnsel zu ermöglichen²⁸. Wenn sich die Gerinnsel zurückziehen, wird beobachtet, dass sich Serum an der Oberseite des Gerinnsels in der Pipette ansammelt. Die rt-PA-Reaktion von Gerinnseln bleibt 2 Wochen nach dem Rückzug stabil²⁸.

2. Vorbereitung des Wassertanks

1. Füllen Sie den Wassertank mit Umkehrosmosewasser. Bekleiden Sie die Unterseite des Tanks mit einem akustisch absorbierenden Material, um die Reflexion der Therapie oder der Ultraschallimpulse zu reduzieren. Verwenden Sie ein Wasseraufbereitungssystem, um das Wasser zu entgasen und zu filtern, um Blasenkerne zu minimieren.
   HINWEIS: Eine Möglichkeit, das Wasser zu filtern, ist die Verwendung eines Inline-Filters. Die Spezifikationen des Beutels, der zur Erzeugung der repräsentativen Ergebnisse verwendet wird, sind in der Materialtabelle angegeben.
2. Platzieren Sie zwei Heizelemente an der Unterseite des Tanks. Erhitzen Sie das Wasser auf 37,3 °C, um die maximale lytische enzymatische Aktivität³⁰zu erreichen.
3. Richten Sie einen Flusskanal ein, wie in Abbildung 1Adargestellt. Der Strömungskanal besteht aus Schläuchen, einem Modellgefäß mit Material- und geometrischen Eigenschaften, die für eine iliofemorale Vene repräsentativ sind, einem Reservoir für Plasma und einer Spritze am distalsten Ende des Reservoirs (Materialtabelle). Die Spritze wird an eine Pumpe angeschlossen, um während des Experiments einen Durchfluss durch den Kanal zu regulieren.
4. Tauchen Sie den Strömungskanal manuell in den Wassertank ein, um den Kanal während der Entgasungs-/Filter-/Heizstufe auf physiologische Temperatur zu bringen (Schritte 2.1 und 2.2).

3. Herstellung von Plasma und rt-PA-Gemisch

1. Vor dem Experimentiertag
   HINWEIS: Bei Lagerung bei -80 °C ist Plasma mindestens 2,5 Jahre³¹ und rt-PA mindestens 7 Jahre stabil³². Führen Sie daher Schritt 3.1 jederzeit innerhalb dieser Zeiträume aus, um die Stabilität der beiden Komponenten sicherzustellen.
   1. Verdünnen Sie das von einem Hersteller erhaltene rt-PA in pulverförmiger Form auf 1 mg/ml in sterilem Wasser.
   2. Aliquot 100 μL verdünntes rt-PA in 0,5 mL Zentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei -80 °C.
   3. Aliquot 35 ml menschliches frisch gefrorenes Plasma vom Typ O in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Röhrchen bei -80 °C.
2. Am Experimenttag
   1. Holen Sie Plasma-Aliquoten aus dem Gefrierschrank. Rufen Sie so viele Aliquoten ab, wie die Anzahl der gerinnsel, die an diesem Tag getestet werden sollen. Tauchen Sie die gefrorenen Aliquoten in ein Wasserbad bei 37 °C, um aufzutauen (~10 min).
   2. Sobald das Plasma aufgetaut ist, gießen Sie es in ein Becherglas, das dreifach mit Reinstwasser gespült wird. Bedecken Sie den Mund des Becherglases leicht mit Aluminiumfolie, um eine Kontamination zu vermeiden, und legen Sie das Becherglas in das Wasserbad. Lassen Sie die Folie locker genug sein, damit Luft mit dem Plasma in Kontakt treten kann.
   3. Plasma wird bei 37 °C mindestens 2 h auf Atmosphärendruck ausgeglichen.
   4. Nehmen Sie die gefrorenen rt-PA-Fläschchen heraus und legen Sie sie auf Eis, bis sie benötigt werden, mit einer Durchstechflasche für jeden Versuchslauf.
   5. Machen Sie Agarose mit niedrigem Gelieren (2%) in einem 50-ml-Kolben, indem Sie Agarose in Reinstwasser auflösen. Wählen Sie die Gesamtmenge an Agaroselösung so, dass für jede zu analysierende Probe etwa 2 ml zur Verfügung stehen. Die Lösung im Kolben in der Mikrowelle erhitzen, bis sie sprudelt. Befestigen Sie den Kolben mit einem wasserdichten Schraubdeckel darauf. Tauchen Sie den Kolben neben dem Plasma in das Wasserbad.
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass Agarose verfügbar ist, um exponierte Gerinnselsegmente für die histologische Analyse nach Histotripsiesonation zu sichern.

4. Einrichten der Histotripsiequelle und des Imaging-Arrays

1. Stellen Sie sicher, dass die motorisierten Positionierer von der Laufzeitumgebung einer Programmierplattform aus gesteuert werden können, indem Sie die vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen und Befehle verwenden. Überprüfen Sie, ob die Motoren des Systems an den entsprechenden Port des Computers mit der Laufzeitumgebung angeschlossen sind.
2. Montieren Sie die Histotripsiequelle am motorisierten Positioniersystem, wie in Abbildung 1B dargestellt.
3. Schließen Sie die Histotripsiequelle über die entsprechenden Anschlüsse (z. B. BNC-Kabel) wie vom Hersteller angegeben an ihre Antriebselektronik (z. B. Endstufe und Funktionsgenerator) an.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Antriebselektronik der Histotripsiequelle über die in Schritt 4.1 verwendete Laufzeitumgebung gesteuert werden kann.
4. Decken Sie das Imaging-Array mit einer Sondenabdeckung ab, und befestigen Sie das Array koaxial in der Blende der Histotripsiequelle, wie in Abbildung 2 dargestellt. Achten Sie darauf, die Ausrichtung der Abbildungsebene relativ zur Ausrichtung der Histotripsiequelle zu verstehen.
5. Schließen Sie das Bildgebungsarray an ein Ultraschall-Scansystem an. Stellen Sie sicher, dass dieses System den Betrieb und die Auslösung des Imaging-Arrays steuern und Imaging-Daten gemäß den Befehlen des Herstellers des Scanners sammeln kann.
6. Tauchen Sie die Histotripsiequelle/das Imaging-Array während der Entgasung in den Tank ein, wie in Abbildung 1Adargestellt. Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen mit einer Spritze von der Oberfläche der Histotripsiequelle oder des Imaging-Arrays.
   HINWEIS: Tauchen Sie die Histotripsiequelle und das Imaging-Array vor dem Betrieb vollständig in Wasser. Vermeiden Sie es, die Oberfläche der Histotripsiequelle zu berühren.
7. Erfassen Sie B-Modus-Bilder mit einer Rate von 20 Bildern pro Sekunde mit dem Imaging-Array und den integrierten Befehlen des Scanners. Passen Sie das Bildfenster an, um die Visualisierung des Fokus der Histotripsiequelle in diesen Echtzeitbildern sicherzustellen.
   HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass die Dimensionen der Fokusregion der therapeutischen Quelle bekannt sind.
8. Stellen Sie die Betriebsparameter der Histotripsiequelle ein, einschließlich Grundfrequenz (z. B. 1,5 MHz), Pulswiederholfrequenz (z. B. 20-100 Hz), Pulsdauer (z. B. 1-20 Zyklen pro Impuls) und Gesamtzahl der Impulse pro Ort (z. B. 100-2.000)^18,23,24,33. Ändern Sie diese Parameter, wenn keine ausreichende Gerinnsellyse erreicht wird oder wenn die Blasenaktivität über das Lumen des Modellgefäßes hinausgeht. Um diese Parameter einzustellen, verwenden Sie das vom Hersteller der Quelle bereitgestellte Protokoll oder verwenden Sie eine Programmierplattform, die mit der Quelle kommunizieren kann (Schritt 4.3).
9. Führen Sie die Histotripsiequelle mit dem in Schritt 4.8 verwendeten Protokoll oder der Programmierplattform des Herstellers bei den eingestellten Parametern nur in entgasten Gewässern ohne Behinderung in der Umgebung aus. Erhöhen Sie die spannungsangebrachte Histotripsiequelle, bis sich eine Blasenwolke bildet.
10. Passen Sie mithilfe der Echtzeitabbildung von Schritt 4.7 die Position des Bildgebungsarrays innerhalb der öffnung des konfokalen Wandlers an, bis sich die Blasenwolke ungefähr in der Mitte des Bildfensters befindet. Die Blasenwolke ist der Bereich hyperechoischer Pixel in der Abbildungsebene (Abbildung 3). Ziehen Sie die Schrauben fest, um das Imaging-Array fest in der Wandleröffnung zu halten.
    HINWEIS: Wenn das Array richtig ausgerichtet ist, sollte die azimutale Position der Blasenwolke ungefähr bei 0 mm in der Abbildungsebene liegen. Das bildgebungsfeld kann leicht von der inneren Oberfläche der Therapiequelle projizieren, und daher kann die Bereichsposition der Blasenwolke von der Brennweite der Quelle abweichen.
11. Identifizieren Sie die Position der Blasenwolke in der Abbildungsebene. Weisen Sie den Fokus der Histotripsiequelle als Zentrum der Blasenwolke zu (Abbildung 3).
12. Notieren Sie die erkannte Brennposition (Schritt 4.11) im Bildfenster (Abbildung 3). Eine möglichkeit, die Fokusposition zu markieren, besteht darin, einen Cursor zu platzieren, um die Position im Imaging-Fenster zu notieren, sofern dies mit der Imaging-Plattform verfügbar ist.
13. Beenden Sie die Insonation und stellen Sie die an die Histotripsiequelle angelegte Spannung auf 0 V ein.

5. Gerinnselzubereitung

1. Entfernen Sie das Gerinnsel aus der Pipette, indem Sie das versiegelte Ende mit einer Zange schneiden. Lassen Sie das Gerinnsel zusammen mit dem Serum in eine Petrischale gleiten. Wenn sich das Gerinnsel nicht löst, drücken Sie vorsichtig Druck vom anderen Ende der Pipette durch Kochsalzlösung aus, um das Gerinnsel zu entfernen.
2. Schneiden Sie das Gerinnsel mit einem Skalpell auf 1 cm Länge und zielen Sie auf ein einheitliches Stück von der Mitte aus (dh weg von Abschnitten des Gerinnsels, die oben oder unten in der Pipette gebildet werden).
3. Verwenden Sie ein Reinigungstuch, um den geschnittenen Abschnitt des Gerinnsels vorsichtig abzutuchen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
4. Legen Sie den Gerinnselabschnitt mit einer Pinzette vorsichtig auf eine Waage und notieren Sie das Gewicht.
5. Heben Sie den Strömungskanal manuell aus dem Wassertank an und entfernen Sie den Modellbehälter aus dem Strömungskanal.
6. Legen Sie das Gerinnsel mit einer Pinzette in das Modellgefäß und befestigen Sie das Modellgefäß wieder am Strömungskanal.
   HINWEIS: Ein Nylonstab kann innerhalb des Modellgefäßes platziert werden, um zu verhindern, dass sich das Gerinnsel aufgrund der Strömung stromabwärts bewegt.
7. Senken Sie den Strömungskanal so in den Tank, dass das proximale Ende der Stufe relativ zum Reservoir im Vergleich zur distalen Seite niedrig ist. Das Angeln der Stufe auf diese Weise verhindert das Einfangen von Blasen im Modellgefäß, wenn in Schritt 6.1 Plasma durch den Strömungskanal gezogen wird.
8. 30 ml Plasma werden mit einer Pipette in das Reservoir geben und die Temperatur überwacht, bis sie mindestens 36 °C erreicht.
9. Verwenden Sie eine Pipette, um das rt-PA (80,4 μg in 30 ml Plasma, 2,68 μg/ml) in das Plasmareservoir zu dosieren. Rühren Sie das Plasma mit der Pipette um, um eine gleichmäßige rt-PA-Verteilung innerhalb des Reservoirs zu gewährleisten.

6. Ansaugen des Strömungskanals

1. Ziehen Sie Plasma aus dem Reservoir über die Spritzenpumpe in den Strömungskanal, bis das Plasma das Modellgefäß füllt.
   HINWEIS: Wenn das Gerinnsel nicht bündig mit dem Nylonstab ist, verwenden Sie kurze Pumpenzuge bei 60 ml / min, um zu versuchen, das Plasma dem Gerinnsel nachgeschaltet zu zwingen oder manuell durch die Spritze zu ziehen. Begrenzen Sie die Menge an Plasma, die bei diesem Prozess entnommen wird, oder füllen Sie das Reservoir mit zusätzlichem Plasma / rt-PA auf, um 30 ml Lösung im Strömungskanal zu gewährleisten.
2. Richten Sie das Imaging-Array mithilfe der motorisierten Positionierer mithilfe des Imaging-Skripts parallel zur Länge des Gerinnsels aus (Schritt 4.7). Die parallele Ausrichtung ermöglicht es dem Benutzer, die korrekte Platzierung des Gerinnsels und das Fehlen von Blasen im Modellgefäß visuell sicherzustellen.
3. Nivellieren Sie das Modellschiff manuell und visuell, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind, indem Sie das Bildfenster verwenden (Schritt 4.7).

7. Ablauf des Experiments

1. Vorbehandlung
   HINWEIS: In diesem Schritt wird ein Pfad für die Histotripsiequelle/das Imaging-Array für eine gleichmäßige Histotripsie-Exposition entlang der Gerinnsellänge geplant.
   1. Richten Sie das Bildgebungsarray mit den motorisierten Positionierern so aus, dass die Abbildungsebene parallel zum Querschnitt des Gerinnsels verläuft (d. h. senkrecht zur in Schritt 6.2 beschriebenen Ausrichtung).
   2. Bewegen Sie unter Anleitung des Bildgebungsfensters (Schritt 4.7) die Histotripsiequelle mit den motorisierten Positionierern zum proximalen Ende des Gerinnsels relativ zum Reservoir. Passen Sie an dieser Stelle die Position der Histotripsiequelle so an, dass der markierte Brennpunkt in Schritt 4.12 mit dem Zentrum des Gerinnsels ausgerichtet ist.
   3. Bestimmen Sie den Resonanzpfad entlang der Gerinnsellänge. Um diesen Pfad zu definieren, legen Sie drei Wegpunkte entlang der Länge des Gerinnsels (d. h. Positionen der Motoren, in denen die histotripsy Blasenaktivität im Gerinnsel enthalten ist) in Schritten von 5 mm fest. Richten Sie die Wegpunkte so aus, dass die Gesamtbewegung der histotripsieartigen Quelle entlang des Pfades antegrad mit der Strömung im System ist (dh der erste Wegpunkt befindet sich am proximalsten Ende des Gerinnsels relativ zum Reservoir und der dritte Wegpunkt befindet sich in der distalen Position relativ zum Reservoir).
   4. Bevor Sie jeden Wegpunkt abschließen, feuern Sie Testimpulse von der Histotripsiequelle mit den gleichen Insonationsparametern wie Schritt 4.8 ab, reduzieren sie jedoch die Gesamtexposition auf 10 Gesamtimpulse. Stellen Sie die Position der Histotripsiequelle bei Bedarf mit den motorisierten Positionierern ein, um die Blasenaktivität im Gerinnsel einzudämmen.
   5. Speichern Sie an jedem Wegpunkt die Motorpositionen mit den vom Hersteller bereitgestellten Befehlen, ähnlich wie in Schritt 4.1.
2. Behandlung
   HINWEIS: Dieser Schritt definiert das Verfahren zur Behandlung des Gerinnsels entlang seiner Länge entsprechend dem im Vorbehandlungsschritt definierten Pfad.
   1. Führen Sie die Spritzenpumpe mit 0,65 ml/min aus und warten Sie, bis sich der Meniskus des Plasmas bewegt hat. Diese Durchflussrate ahmt einen nahezu vollständigen Verschluss des iliofemoralen^{Gefäßes 24,34 nach.}
   2. Interpolieren Sie den in Schritt 7.1.3 angelegten Pfad mit Zwischenschritten zwischen den festgelegten Wegpunkten mit einer festen Schrittgröße (z.B. 0,5 mm). Die Schrittgröße wird so gewählt, dass sie kleiner als die Hälfte der Breite des Fokusbereichs ist, gemessen entlang der Gerinnsellänge (Höhenrichtung des Bildgebungsarrays). Bewegen Sie die Histotripsiequelle mit motorisierten Positionierern an jeder Pfadposition mit den in Schritt 4.8 definierten Insonationsparametern.
   3. Überwachen/Bildblasenaktivität während der Anwendung des Histotripsieimpulses an jeder Pfadstelle mithilfe des Bildgebungsfensters (Schritt 4.7). Zentrieren Sie das Bild auf dem Histotripsie-Fokus mit den Bildabmessungen von 15 mm im Azimut und -bereich. Vor der Anwendung des Histotripsieimpulses an jeder Stelle erfassen Sie ein B-Modus-Bild, um die Visualisierung des Gerinnsels und des Modellgefäßes zu ermöglichen, indem Sie ein Skript in einer Programmierplattform erstellen. Stellen Sie sicher, dass das Skript die Kommunikation mit dem Scanner mithilfe der Befehle des Herstellers herstellt.
   4. Implementieren Sie während der Anwendung des Histotripsieimpulses die Erfassung der akustischen Emissionen im Skript in Schritt 7.2.3, um passive Kavitationsbilder post hoc³⁵zu bilden. Erfassen Sie ein passives Kavitationsbild nach jeweils 10 Behandlungsimpulsen. Wenden Sie eine flache Zeitverstärkungskompensation von 50 bei 8 inkrementellen Tiefen bis zum Ende der Bildtiefe an. Wählen Sie eine geeignete Erfassungsfenstergröße, so dass das gesamte Signal des Gerinnsels mit minimalem Energieverlust durch Fenster³⁵erfasst wird.
   5. Wenn Off-Target-Blasenwolken vorhanden sind, stellen Sie die Wandlerposition in situ mit den motorisierten Positionierern ein.
      HINWEIS: Überwachen Sie auf verpasste Trigger des Imaging-Arrays. Passen Sie die Anzahl der erfassten Bilddatensätze an, um sicherzustellen, dass die Speicherung der Daten vor dem anschließenden Auslösen abgeschlossen ist.

8. Verfahren nach dem Experiment

1. Heben Sie das Modellgefäß manuell aus dem Wassertank an, um das Parfüm über die Schwerkraft abzulassen. Achten Sie darauf, den Strömungskanal nivelliert zu halten, um zu verhindern, dass sich das Gerinnsel während des Abtropfens stromabwärts und aus dem Modellbehälter bewegt.
2. Sammeln Sie das gesamte Perfusat zur weiteren Analyse in einem kleinen Becherglas (Abbildung 4A), indem Sie Plasmalösung aus dem Strömungskanal durch die Spritzenpumpe mit einer sehr niedrigen Durchflussrate ziehen.
3. Trennen Sie das Modellgefäß, und entfernen Sie das Gerinnsel. Bei Bedarf eine kleine Menge Kochsalzlösung in das Modellgefäß injizieren, um das Gerinnsel sanft zu vertreiben.
4. Wischen Sie das Gerinnsel ähnlich wie in Schritt 1.2.3. Wiegen Sie das Gerinnsel auf der Waage, um den Gerinnselmassenverlust zu beurteilen.
5. Um den D-Dimergehalt zu analysieren, fügen Sie 100 mg Aminocapronsäure in ein Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, gefolgt von 1 ml Perfusat, und mischen Sie es gut mit einer Pipette. Führen Sie einen immun-turbidimetrischen Latex-Assay durch, um das D-Dimer in der Probe zu quantifizieren³⁶.
6. Um die Hämolyse zu beurteilen, fügen Sie 1 ml Perfusat in Zentrifugenröhrchen hinzu und spinnen Sie bei 610 x g (3.500 U / min) für 10 min. Kombinieren Sie 0,5 ml Überstand (Konzentrat) mit 0,5 ml Drabkins-Lösung und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 15 min ruhen. Übertragen Sie 200 μL auf Bohrplatten, wie in Abbildung 4B dargestellt. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption bei 540 nm abzulesen, Abbildung 4C (Drabkins-Assay³⁷).
7. Histologische Beurteilung
   1. Schneiden Sie einen Abschnitt aus der Mitte des Gerinnsels von etwa 2-3 mm Länge mit einem Skalpell.
   2. Fügen Sie den Abschnitt zu einer Kassette hinzu. Halten Sie die Ausrichtung des Abschnitts relativ zur Richtung der Histotripsie-Pulsausbreitung aufrecht.
   3. 2 ml niedriggelnde Agaroselösung, die in Schritt 3.2.5 hergestellt wurde, werden in die Kassette geben, um das Gerinnsel an Ort und Stelle zu fixieren.
   4. Fixieren Sie die Probe in 10% Formalin für 24 h. Legen Sie die Probe nach 24 h in 70% Alkohol und führen Sie eine Standard-Hemotoxylin-Eosin-Färbung³⁸durch.

9. Passive Kavitationsbildanalyse

1. Verarbeiten Sie die Signale, die während der Histotripsie-Anregung (Schritt 7.2.4) vom Bildgebungsarray erfasst wurden, mit einem Algorithmus, der auf dem robusten Capon-Beamformer³⁹ basiert, um ein Bild der akustischen Emissionen zu erstellen, die von der Blasenwolke an jedem Behandlungsort erzeugt werden.
   HINWEIS: Um quantitative Bilder zu generieren, befolgen Sie die in Haworth et al.³⁵beschriebenen Schritte. Andernfalls sollte jeder Pixelwert im Bild die relative akustische Energie der Blasenwolke (Einheiten von V²⁾an jeder entsprechenden Stelle darstellen.
2. Segmentieren Sie das in Schritt 7.2.3 angequirte B-Modus-Bild, um zwischen den Pixeln, die das Gerinnsel darstellen, und dem Modellgefäß zu unterscheiden.
3. Registrieren Sie das passive Kavitationsbild mit dem B-Modus-Bild, wie in Abbildung 5Bdargestellt. Summieren Sie die akustische Energie innerhalb des Gerinnsels über den Expositionszeitraum³⁵.

Ergebnisse

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll hebt die Details der venösen Gerinnselmodellierung, der Lysotripsie bei Gerinnselstörungen und der Ultraschallbildgebung in einem In-vitro-Setup der TVT hervor. Das gewählte Verfahren zeigt die Schritte, die zur Beurteilung der Gerinnselstörung aufgrund der kombinierten Effekte von rt-PA und histotripsy Bubble Cloud-Aktivität erforderlich sind. Das Benchtop-Setup wurde entwickelt, um die Eigenschaften einer venösen Iliofemoralvene nachzuahmen. Abbildu...

Diskussion

Das vorgeschlagene Protokoll stellt ein Modell zur Quantifizierung der Behandlungswirksamkeit von Lysotripsie dar. Während die wichtigsten Details diskutiert wurden, gibt es bestimmte kritische Aspekte, die für den Erfolg dieses Protokolls zu berücksichtigen sind. Die enzymatische Aktivität von rt-PA hat eine Arrhenius-Temperaturabhängigkeit³⁰. Die Temperatur ist auch ein Faktor für die Schallgeschwindigkeit in Wasser und Gewebe, und Temperaturschwankungen können geringfügige Veränderunge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing sheets	Precision acoustics	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes	Fisher Scientific	1367820A	14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL capacity
Drabkin's assay	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Draw syringe	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Filter bags	McMaster-Carr	5162K111	Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing	McMaster-Carr	5154K25	Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements	Won Brothers	HT 300 Titanium	Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array	Verasonics	L11-5v	128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose	Millipore Sigma	A9414
Model vessel	McMaster-Carr	5234K98	6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma frozen within 24 hours
Plate reader	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	For haemoglobin quantification
Probe cover	Civco	610-362
Programming platform	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservoir	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Syringe pump	Cole-Parmer	EW-74900-20	pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer	In-house customized		Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system	Verasonics		Vantage Research Ultrasound System
Water tank	Advanced acrylics	C133	14 x 14 x 12, 1/2"