JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج فئران جديد للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية النشط باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية (EcoHIV)، وهو أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا للخزانات الفيروسية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 في الدماغ وتقديم نظام لدراسة الاضطرابات العصبية المعرفية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية والأمراض المصاحبة لها (أي تعاطي المخدرات).

Abstract

وقد درس جيدا أن نموذج الماوس المصابة EcoHIV هو ذات فائدة كبيرة في التحقيق في المضاعفات العصبية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية. إنشاء نموذج الفئران المصابة EcoHIV لدراسات تعاطي المخدرات والاضطرابات العصبية المعرفية، سيكون مفيدا في دراسة NEUROHIV وفيروس نقص المناعة البشرية-1 المرتبطة الاضطرابات العصبية المعرفية (HAND). في هذه الدراسة، نثبت نجاح إنشاء نموذج الفئران للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية النشطة باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية (EcoHIV). أولا، تم حزم البناء العدسي ل EcoHIV في خلايا مثقفة 293 FT لمدة 48 ساعة. ثم تركزت الوسيلة الشرطية وتكتتر. بعد ذلك ، قمنا بإجراء حقن ستيريوتاك ثنائية من EcoHIV-EGFP في أنسجة دماغ الفئران F344/N. بعد أسبوع واحد من العدوى، تم الكشف عن إشارات مضان EGFP في أنسجة الدماغ المصابة، مما يشير إلى أن EcoHIV يحفز بنجاح عدوى فيروس نقص المناعة البشرية النشطة في الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء التلطخ المناعي لعلامة الخلية المجهرية ، Iba1. وأشارت النتائج إلى أن الميكروجليا هي نوع الخلية السائد الذي يأوي EcoHIV. وعلاوة على ذلك، أظهرت الفئران EcoHIV تعديلات في المعالجة الزمنية، وآلية السلوكية العصبية الكامنة المحتملة من اليد، فضلا عن الخلل المتشابك بعد ثمانية أسابيع من العدوى. وبصورة جماعية، توسع هذه الدراسة نطاق نموذج فيروس نقص المناعة البشرية-1 إلى الجرذ الذي يوفر نظاما بيولوجيا قيما لدراسة الخزانات الفيروسية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 في الدماغ وكذلك في هاند والأمراض المصاحبة لها مثل تعاطي المخدرات.

Introduction

وقد عززت النظم البيولوجية فهمنا لفيروس نقص المناعة البشرية-1 المرتبطة الاضطرابات العصبية المعرفية (HAND) وآلياتها العصبية الكامنة2. تحديد النظام البيولوجي الذي هو الأنسب لأي دراسة معينة غالبا ما يعتمد علىمسألة الفائدة 2. إن الحد من نطاق النماذج الحيوانية المضيفة يتحدى دراسات تطور مرض فيروس نقص المناعة البشرية-1. للتحقيق في فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ المتماثل الفيروسي ومسببات الأمراض, البوتاسوآخرون. 3 خلق نموذج الماوس من العدوى النشطة فيروس نقص المناعة البشرية-1, استبدال منطقة الترميز من فيروس نقص المناعة البشرية المغلف السطحي جليكوبروتين, gp120, مع gp80 MLV الإيكولوجية, مما أدى إلى تكرار الفيروسية الناجحة في الفئران4. بعد حقن الوريد الذيل في الفئران فيروس نقص المناعة البشرية (EcoHIV) ، لوحظت العديد من الخصائص التي تشبه تلك التي من الأفراد المصليين فيروس نقص المناعة البشرية -1 (على سبيل المثال ، الخلايا الليمفاوية المصابة وال الضامة ، وتستهدف الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات ، والتهاب3،5،6).

على الرغم من أن الفئران والجرذان كلاهما أعضاء في Muridae ، إلا أن الاختلافات الأساسية في الأنواع قد تؤثر على مدى ملاءمتها لأسئلة تجريبية محددة7. لذلك ، فإن توسيع نموذج العدوى EcoHIV للفئران (يستخدم عادة في دراسات تعاطي المخدرات والاضطرابات العصبية المعرفية) سيكون مفيدا في دراسة neuroHIV. على سبيل المثال ، يجعل حجمها الأكبر زرع القسطرة الوداجية لإجراءات الإدارة الذاتية للأدوية أكثر عملية8. وقد استخدمت تقنيات الإدارة الذاتية المخدرات في الفئران لتقييم الدافع في فيروس نقص المناعة البشرية-19. وعلاوة على ذلك، تم تصميم العديد من المهام العصبية المعرفية / السلوكية في البداية للفئران10. هنا، ونحن تقرير استخدام الحقن ستيريوتاكسيك من EcoHIV في الفئران لتوسيع نموذج العدوى EcoHIV وفرصة رئيسية لمعالجة الأسئلة الجديدة المتعلقة neuroHIV و HAND.

Protocol

تم مراجعة جميع بروتوكولات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في جامعة كارولينا الجنوبية (رقم الضمان الفيدرالي: D16-00028). تم إيواء ستة ذكور بالغين F344/N الجرذ في بيئة خاضعة للرقابة تحت ضوء 12/12: دورة مظلمة مع وصول libitum الإعلانية إلى الغذاء والماء. وتم رعاية جميع الحيوانات باستخدام المبادئ التوجيهية التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة في دليل رعاية واستخدام المختبر.

1. فيروس التعبئة والتغليف في 293 خلايا FT

  1. ثقافة خلايا FT 293 (5×105/ مل) في الجيلاتين المغلفة 75 سم2 قوارير مع DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS11. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية لتكون التقاء 50٪ عند العدوى.
  2. تمييع 22.5 ميكرولتر من كاشف العدوى (على سبيل المثال، ليبوفيكتامين 3000) في 750 ميكرولتر من المتوسط (على سبيل المثال، Opti-MEM) في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل ودوامة لمدة 3 ثانية.
  3. تمييع 20 ميكروغرام من الحمض النووي EcoHIV plasmid في 750 ميكرولتر من المتوسط في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل وتخلط جيدا.
  4. إضافة الحمض النووي المخفف في أنبوب من كاشف العدوى المخفف وتخلط بلطف. حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة الخليط إلى 10 مل من المتوسط DMEM prewarmed في 75 سم2 قارورة. احتضان الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية.
  6. حصاد والجمع بين 24 مل من المتوسطة المشروطة من قارورتين التي تشمل الفيروس العدسي المعبأة.
  7. أجهزة الطرد المركزي جميع 24 مل من المتوسط الشرطي في 500 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية. نقل supernatant أوضح إلى أنبوب معقم 50 مل.
  8. الجمع بين 8 مل من التركيز Lenti-x مع 24 مل من supernatant توضيح (1:3 نسبة). مزيج من قبل انعكاس لطيف. احتضان الخليط في 4 درجة مئوية لمدة يومين.
  9. خليط الطرد المركزي عند 1500 × غرام لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. إزالة بعناية فائقة.
  10. بلطف إعادة تعليق بيليه مع 100 ميكرولتر من 100 mM PBS.
  11. تيتر تركيز الفيروس مع مجموعة P24 ELISA.

2. EcoHIV-EGFP فيروس العمليات الجراحية ستيريوتاكسيك

  1. تخدير الفئران باستخدام 3٪ سيفوفلوران. انتقل إلى الخطوة 2.2 عندما الفئران لا تستجيب للمحفزات الضارة وردود الفعل غائبة.
  2. حلق الشعر من منطقة الدماغ وتعقيم الجلد مرتين مع الإيثانول 70٪ وفرك الكلورهيكسيدين القائم. تأمين الفئران في موقف عرضة في جهاز ستيريوتاكسيك.
  3. إجراء شق (5-6 سم) من خلال الجلد على طول خط الوسط فروة الرأس.
  4. وضع علامة على موقعين الحفر في 0.8 ملم الجانبية، 1.2 ملم rostral إلى bregma. حفر حفرة (قطرها 0.4 ملم) في كل موقف الجمجمة.
  5. ملء محلول EcoHIV العدسي (1.04 × 106 TU/mL) في حقنة حقن 10 ميكرولتر. تأمين المحاقن إلى جهاز ستيريوتاكسيك.
  6. تحرك لأسفل الإبرة بالقرب من سطح حفرة الحفر. قياس ونقل 2.5 ملم في العمق.
  7. غرس 1 ميكرولتر من محلول الفيروس بمعدل 0.2 ميكرولتر/دقيقة. احتفظ بالإبرة داخل منطقة الحقن لمدة 5 دقائق. تحرك الإبرة ببطء حتى تخرج من جمجمة الفئران.
  8. خياطة الجلد مع خيط الحرير 4-0.
  9. تعقيم الشق مع الإيثانول 70٪ مرة واحدة. حقن تحت الجلد بتورفينول (دوريليكس، 0.1 ملغ/ كجم وزن الجسم).
  10. نقل الجرذ إلى غرفة الإنعاش مع وسادة التدفئة حتى يستيقظ.

3. التصور من أقسام الدماغ

ملاحظة: انتظر من أسبوع إلى ثمانية أسابيع بعد التسريب الفيروسي EcoHIV.

  1. تخدير الجرذ مع 5٪ سيفوفلوران. الاستمرار في الخطوة 3.2 عندما الفئران لا تستجيب للمحفزات الضارة وردود الفعل غائبة.
  2. إصلاح الفئران في موقف supine داخل غطاء الدخان.
  3. انسي الجلد على طول خط الوسط الصدري. قطع الحجاب الحاجز وفتح تجويف الصدر.
  4. أدخل إبرة 20 جم × 25 مم في البطين الأيسر.
  5. فتح الأذين الأيمن فورا مع مقص.
  6. Perfuse 50 مل من برنامج تلفزيوني prechilled 100 mM بمعدل 5 مل / دقيقة.
  7. Perfuse 100 مل من البرد 4٪ بارافورمالديهايد بمعدل 5 مل / دقيقة.
  8. قطع رأس الجرذ، وفتح فروة الرأس وإزالة الدماغ.
  9. Postfix بين عشية وضحاها مع 4٪ بارافورمالديهايد.
  10. نقل الدماغ إلى 40 مل من السكروز 30٪ في برنامج تلفزيوني 100 mM في أنبوب 50 مل حتى يطفو الدماغ وصولا الى القاع (حوالي 3 أيام).
  11. المفاجئة تجميد الدماغ في ميثيل بوتانول لمدة 2 دقيقة في - 80 درجة مئوية.
  12. تأمين أنسجة الدماغ على منصة معدنية داخل cryostat -20 درجة مئوية.
  13. قطع 50 ميكرومتر أقسام تاجية سميكة باستخدام cryostat.
  14. نقل شرائح الدماغ على الشرائح الزجاجية مع فرشاة غرامة.
  15. أقسام جبل في 0.3 مل من المتوسطة antifade وتغطي مع 22 ملم 50 مم coverslips.
  16. الحفاظ على الشرائح الزجاجية في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى تجف.
  17. صورة الخلايا العصبية المستهدفة مع المجهر confocal باستخدام Z-كومة على أساس حدود منطقة الدماغ والخصائص المورفولوجية للخلايا العصبية.
    ملاحظة: كانت إعدادات المجهر البؤري المستخدمة هي: تكبير 60 X (A/1.4، النفط)، والفاصل الزمني لطائرة Z قدره 0.15 ميكرومتر (حجم الثقب 30 ميكرومتر؛ نصف قطر الثقب المتوقع للخلف 167 نانومتر) باستخدام طول موجي يبلغ 488 نانومتر.

النتائج

تم جمع المتوسطة المكيفة من الفيروس العدسي من EcoHIV-EGFP المصابة 293FT الخلايا. بعد ذلك ، كان مركزا وممتر ، ثم حقنه بشكل ستيريوإكسيكالي في الدماغ (المنطقة القشرية) من فئران F344 /N. وبعد سبعة أيام من الحقن، تم التضحية بالجرذان وأخذت صور من شرائح الدماغ التاجية التي تتراوح بين بريغما 5.64 ملم والبريغما -4...

Discussion

في هذا البروتوكول، أنشأنا نموذج عدوى فيروس نقص المناعة البشرية الناجم عن EcoHIV في الفئران. على وجه التحديد، وصفنا حقنة ستيريوتاك ثنائية من EcoHIV في القشرة التي تسببت بنجاح في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية النشطة في دماغ الفئران بعد 7 أيام من الحقن. Futhermore، ونحن نثبت أن العدوى EcoHIV في الفئران يم?...

Disclosures

ولا يوجد لدى أي من أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح HD043680، MH106392، DA013137، وNS100624.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
293FT cellsThermoFisher ScientificR70007
Antibiotic-Antimycotic solutionCellgro30004CI100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented CapLife Technologies354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium PyruvateLife Technologies10013CV
Cover glassVWR637-137
drill
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock TubesLife Technologies22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2Med Vet InternationalVCP422H
Hamilton syringeHamilton1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection ReagentLife TechnologiesL3000015
Iris ForcepsWorld Precision Instruments15914
Iris ScissorsWorld Precision Instruments500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA KitCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Lenti-X ConcentratorTakaraPT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum MediumLife Technologies11058021
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldehydeSigmaP6148
ProLong GoldFisher ScientificP36930
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
stereotaxic apparatusKopf InstrumentsModel 900
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154%
Vannas ScissorsWorld Precision Instruments500086

References

  1. Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
  2. Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
  3. Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
  4. Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
  5. Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
  6. Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061 (2018).
  7. Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
  8. Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998 (2010).
  9. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869 (2018).
  10. McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), 340-357 (1995).
  11. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
  12. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827 (2019).
  13. McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659 (2019).
  14. Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
  15. Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
  16. Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
  17. Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167 EcoHIV Microglia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved