מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להקים מודל עכברוש חדש של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי (EcoHIV), שהוא קריטי לשיפור ההבנה שלנו של מאגרים נגיפיים HIV-1 במוח ומציע מערכת לחקור הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות ל- HIV ותחלואה נלווית (כלומר, שימוש בסמים).

Abstract

נחקר היטב כי מודל העכבר הנגוע EcoHIV הוא בעל תועלת משמעותית בחקירת סיבוכים נוירולוגיים הקשורים ל- HIV. הקמת מודל עכברוש נגוע EcoHIV למחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות, יהיה מועיל במחקר של neuroHIV ו- HIV-1 הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות (HAND). במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את היצירה המוצלחת של מודל חולדה של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי (EcoHIV). ראשית, המבנה lentiviral של EcoHIV נארז בתאי FT 293 תרבותיים במשך 48 שעות. לאחר מכן, המדיום המותנה היה מרוכז וטריטר. לאחר מכן, ביצענו זריקות סטראוטקסיות דו-צדדיות של EcoHIV-EGFP לתוך רקמת מוח עכברוש F344/N. שבוע לאחר ההדבקה, אותות פלואורסצנטיים EGFP זוהו ברקמת המוח הנגועה, המציין כי EcoHIV בהצלחה גורם לזיהום HIV פעיל בחולדות. בנוסף, בוצעה חיסון עבור סמן התא המיקרוגליאלי, Iba1. התוצאות הצביעו על כך שמיקרוגליה היו סוג התא השולט ב-EcoHIV. יתר על כן, חולדות EcoHIV הציגו שינויים בעיבוד הטמפורלי, מנגנון נוירו-התנהגותי פוטנציאלי של HAND, כמו גם תפקוד סינפטי שמונה שבועות לאחר ההדבקה. באופן קולקטיבי, המחקר הנוכחי מרחיב את מודל EcoHIV של הידבקות ב- HIV-1 לחולדה המציעה מערכת ביולוגית בעלת ערך לחקר מאגרים נגיפיים HIV-1 במוח, כמו גם HAND ותחלואה נלווית כגון שימוש בסמים.

Introduction

מערכות ביולוגיות שיפרו את ההבנה שלנו של הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות HIV-1 (HAND) ואת המנגנונים העצביים הבסיסיים שלהם². קביעת איזו מערכת ביולוגית מתאימה ביותר לכל מחקר נתון תלויה לעתים קרובות בשאלת הריבית². המגבלה של מגוון המודלים המארחים של בעלי חיים מאתגרת מחקרים על התפתחות מחלת HIV-1. כדי לחקור HIV-1 שכפול ויראלי פתוגנזה, אשלג ואח^'3 יצר מודל העכבר של זיהום פעיל HIV-1, החלפת אזור הקידוד של גליקופרוטאין מעטפת משטח HIV, gp120, עם gp80 MLV ecotropic, אשר הוביל שכפול ויראלי מוצלח בעכברים⁴. לאחר זריקות וריד הזנב בעכברים HIV כימרי (EcoHIV), מאפיינים רבים נצפו דומים לאלה של אנשים seropositive HIV-1 (למשל, לימפוציטים נגועים מקרופאגים, ממוקד לתגובות חיסוניות אנטי ויראליות, ודלקת^3,5,6).

למרות עכברים וחולדות הם שניהם חברים של Muridae, הבדלים מינים בסיסיים עשויים להשפיע על התאמתם לשאלות ניסיוניות ספציפיות⁷. לכן, ההרחבה של מודל זיהום EcoHIV לחולדות (נפוץ במחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות) יהיה יתרון במחקר של neuroHIV. לדוגמה, גודלם הגדול יותר הופך את השתלת הקטטר הצווארי להליכי ניהול עצמי של תרופות למעשית יותר⁸. טכניקות ניהול עצמי סמים בחולדות נוצלו כדי להעריך את המוטיבציה ב-^{HIV-1 9}. יתר על כן, משימות נוירוקוגניטיביות / התנהגותיות רבות תוכננו בתחילה עבור חולדות¹⁰. כאן, אנו מדווחים על ניצול של זריקות סטראוטקסיות של EcoHIV בחולדות כדי להרחיב את מודל הזיהום EcoHIV ולאפשר הזדמנות מפתח כדי לענות על שאלות חדשות הקשורות neuroHIV ו HAND.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר הבטחה פדרלית: D16-00028). שישה זכר בוגר F344 / N חולדה שוכנה בסביבה מבוקרת תחת אור 12/12: מחזור כהה עם גישה libitum המודעה למזון ומים. כל בעלי החיים טופלו באמצעות הנחיות שנקבעו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. אריזת וירוסים בתאי FT 293

1. תרבות 293 תאי FT (5×10⁵/ מ"ל) בג'לטין מצופה 75 ס"מ² בקבוקים עם DMEM בתוספת 10% FBS¹¹. לגדל תאים ב 37 °C (69 °F) להיות 50% קונדיטוריה ב transfection.
2. לדלל 22.5 μL של מגיב transfection (למשל, Lipofectamine 3000) ב 750 μL של בינוני (למשל, Opti-MEM) בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 mL ומערבולת עבור 3 s.
3. לדלל 20 מיקרוגרם של EcoHIV פלסמיד DNA ב 750 μL של מדיום בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מ"ל ומערבבים היטב.
4. מוסיפים דנ"א מדולל לצינור של מגיב טרנס-פקציה מדולל ומערבבים בעדינות. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
5. מוסיפים את התערובת ל-10 מ"ל של מדיום DMEM שנחמר מראש בבקבוק 75 ס"מ^2. דגירה תאים במשך 2 ימים ב 37 °C (69 °F).
6. קציר ולשלב 24 מ"ל של מדיום מותנה משני בקבוקונים הכוללים lentivirus ארוז.
7. צנטריפוגה כל 24 מ"ל של בינוני מותנה ב 500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להעביר את supernatant הבהיר לצינור סטרילי 50 מ"ל.
8. שלב 8 מ"ל של רכז Lenti-x עם 24 מ"ל של על-טבעי מובהק (יחס של 1:3). מערבבים על ידי היפוך עדין. תערובת דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
9. תערובת צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant.
10. בעדינות להשעות את גלולה עם 100 μL של 100 מ"מ PBS.
11. ריכוז וירוס טיטר עם ערכת אליזה p24.

2. ניתוחים סטראוטקסיים של וירוס EcoHIV-EGFP

1. הרדמה חולדות באמצעות 3% sevoflurane. המשך לשלב 2.2 כאשר החולדות אינן מגיבות לגירויים רעילים ורפלקסים נעדרים.
2. גילחו את השערות מאזור המוח ועקרו את העור פעמיים עם 70% אתנול וקרצוף על בסיס כלורקסידין. אבטח את החולדה בעמדה מועדת במנגנון הסטריאוטאקסי.
3. בצע חתך (5-6 ס"מ) דרך העור לאורך קו האמצע הקרקפת.
4. סמן שתי עמדות קידוח ב 0.8 מ"מ לרוחב, 1.2 מ"מ rostral כדי bregma. לקדוח חור (קוטר 0.4 מ"מ) בכל מיקום גולגולת.
5. מלא פתרון לנטיוירוס EcoHIV (1.04 × 10⁶ TU / mL) במזרק הזרקת 10 μL. אבטחו את המזרק למנגנון הסטריאוטאקסי.
6. הזז במורד המחט קרוב לפני השטח של חור קידוח. למדוד ולהזיז 2.5 מ"מ לעומק.
7. להחדיר 1 μL של פתרון וירוס בקצב של 0.2 μL / min. שמור את המחט בתוך אזור ההזרקה במשך 5 דקות. תזיז לאט את המחט עד שהיא מחוץ לגולגולת החולדה.
8. לתפור את העור עם חוט משי 4-0.
9. לעקר את החתך עם 70% אתנול פעם אחת. תת עורית להזריק butorphenol (דורולקס, 0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף).
10. מעבירים את החולדה לתא התאוששות עם כרית חימום עד שהיא מתעוררת.

3. הדמיה של חלקי מוח

הערה: המתן שבוע עד שמונה שבועות לאחר עירוי ויראלי EcoHIV.

1. הרדמה החולדה עם 5% sevoflurane. המשך לשלב 3.2 כאשר החולדות אינן מגיבות לגירויים רעילים ורפלקסים נעדרים.
2. תקן את החולדה בתנוחת על-חוש בתוך מכסה המנוע של אדים.
3. להסית את העור לאורך קו האמצע של בית החזה. חותכים את הסרעפת ופותחים את חלל בית החזה.
4. הכנס מחט 20 G × 25 מ"מ לתוך החדר השמאלי.
5. מיד לפתוח את האטריום הנכון עם מספריים.
6. לעיין 50 מ"ל של PBS מראש 100 מ"מ בקצב של 5 מ"ל / דקה.
7. לחלחל 100 מ"ל של קר 4% paraformaldehyde בקצב של 5 מ"ל / דקה.
8. לערוף את ראש החולדה, לפתוח את הקרקפת ולהסיר את המוח.
9. פוסטפיקס לילה עם 4% פארפורמלדהיד.
10. להעביר את המוח 40 מ"ל של 30% סוכרוז ב 100 מ"מ PBS בצינור 50 מ"ל עד המוח צף למטה (כ 3 ימים).
11. הצמד להקפיא את המוח במתילבוטנול במשך 2 דקות ב - 80 מעלות צלזיוס.
12. לאבטח את רקמת המוח על פלטפורמת מתכת בתוך -20 מעלות צלזיוס cryostat.
13. חותכים 50 מיקרומטר עבה חלקי coronal באמצעות cryostat.
14. מעבירים את פרוסות המוח לשקופיות זכוכית בעזרת מברשת עדינה.
15. הר קטעים ב 0.3 מ"ל של בינוני נגד פשתן לכסות עם 22 מ"מ 50 מ"מ coverlips.
16. שמור את מגלשות הזכוכית בחושך בטמפרטורת החדר עד לייבוש.
17. תמונה נוירונים ממוקדים עם מיקרוסקופ confocal באמצעות מחסנית Z מבוסס על גבולות אזור המוח ומאפיינים מורפולוגיים של נוירונים.
    הערה: הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקל בהן נעשה שימוש היו: הגדלה של 60 X (A/1.4, שמן), ומרווח מישור Z של 0.15 מיקרומטר (גודל חור סיכה 30 מיקרומטר; רדיוס חור סיכה מוקרן לאחור 167 ננומטר) באמצעות אורך גל של 488 ננומטר.

תוצאות

המדיום מותנה נאסף מ lentivirus של EcoHIV-EGFP נגוע 293FT תאים. לאחר מכן, הוא היה מרוכז ו titered, אז מוזרק באופן סטריאוטקסי לתוך המוח (אזור קליפת המוח) של חולדות F344/N. שבעה ימים לאחר ההזרקה, חולדות הוקרבו ותמונות נלקחו מפרוסות מוח קורונל החל bregma 5.64 מ"מ כדי bregma -4.68 מ"מ. באיור 1A, ישנם אותות EcoHIV-EGFP מ?...

Discussion

בפרוטוקול זה, הקמנו מודל זיהום איידס הנגרמת על ידי EcoHIV בחולדות. באופן ספציפי, תיארנו הזרקה סטראוטקסית דו-צדדית של EcoHIV לתוך קליפת המוח אשר בהצלחה גרמה לזיהום HIV פעיל במוח החולדה 7 ימים לאחר הזרקה. פית'מור, אנו מראים כי זיהום EcoHIV בחולדות יכול להיות מערכת ביולוגית טובה ללמוד היבטים מרכזיים של HAN...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	ThermoFisher Scientific	R70007
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap	Life Technologies	354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Life Technologies	10013CV
Cover glass	VWR	637-137
drill
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Life Technologies	22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2	Med Vet International	VCP422H
Hamilton syringe	Hamilton	1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technologies	L3000015
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit	Cell Biolabs, inc.	VPK-107-5
Lenti-X Concentrator	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 900
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086