에코HIV 뇌 감염의 쥐 모델

요약

여기에서, 우리는 키메라 HIV (EcoHIV)를 사용하여 활성 HIV 감염의 새로운 쥐 모형을 설치하는 프로토콜을 제시합니다, 두뇌에 있는 HIV-1 바이러스 성 저수지의 우리의 이해를 강화하고 HIV 관련 신경 인지 장애 및 관련 comorbidities를 공부하는 시스템을 제공하는 것을 위해 중요합니다 (즉, 약물 남용).

초록

EcoHIV 감염 마우스 모델은 HIV 관련 신경 학적 합병증을 조사하는 데 중요한 유틸리티라는 것을 잘 연구되었습니다. 약물 남용 및 신경 인지 장애의 연구에 대 한 EcoHIV 감염 된 쥐 모델의 설립, neuroHIV와 HIV-1 관련 된 신경 인지 장애의 연구에 도움이 될 것 이다 (HAND). 본 연구에서는, 우리는 키메라 HIV (EcoHIV)를 사용하여 활성 HIV 감염의 쥐 모델의 성공적인 생성을 보여줍니다. 첫째, 에코HIV의 렌티바이러스 구조는 48시간 동안 배양된 293FT 세포로 포장되었다. 이어서, 조건부 배지는 농축되고 흐트러졌다. 다음으로, 우리는 F344/N 쥐 뇌 조직에 EcoHIV-EGFP의 양측 스테레오택시 주사를 수행했습니다. 감염 후 1주일 후, EGFP 형광 신호가 감염된 뇌 조직에서 검출되어 EcoHIV가 쥐에서 활성 HIV 감염을 성공적으로 유발한다는 것을 나타냅니다. 또한, 마이크로글리아세포 마커인 Iba1에 대한 면역염색이 수행되었다. 결과는 microglia가 EcoHIV를 품고 있는 우세한 세포 모형이었다는 것을 표시했습니다. 더욱이, EcoHIV 쥐는 감염 후 8 주 동안 HAND의 잠재적 기본 신경 행동 메커니즘뿐만 아니라 시간 적 처리에 변화를 나타냈다. 종합적으로, 본 연구는 뇌의 HIV-1 바이러스 저장소뿐만 아니라 HAND 및 약물 남용과 같은 관련 comorbidities를 연구하는 귀중한 생물학적 시스템을 제공하는 쥐에 HIV-1 감염의 EcoHIV 모델을 확장합니다.

서문

생물학적 시스템은 HIV-1 관련 신경인지 장애(HAND)와 그 근본적인 신경 메커니즘^2에대한 우리의 이해를 향상시켰습니다. 어떤 생물학적 시스템이 어떤 연구에 가장 적합한지 결정하는 것은 종종 관심^2의문제에 달려 있습니다. 숙주 동물 모델의 범위의 제한은 HIV-1 질병 발달의 연구에 도전합니다. HIV-1 바이러스 복제 및 병인을 조사하기 위해, Potash 외^3은 활성 HIV-1 감염의 마우스 모델을 생성하여 HIV 표면 봉투 당단백질, gp120의 코딩 영역을 에코트로픽 MLV gp80으로 대체하여 마우스^4에서성공적인 바이러스 복제를 이끌어 냈다. 키메라 HIV(EcoHIV) 마우스에서 꼬리 정맥 주사 후, HIV-1 혈청 양성 개인(예를 들어, 감염된 림프구 및 대식세포, 항바이러스 면역 반응, 염증^3,5,6)과유사한 많은 특성이 관찰되었다.

마우스와 쥐는 모두 무리대의 구성원이지만, 근본적인 종 차이는 특정 실험 질문에 대한 적합성에 영향을 미칠 수 있습니다^7. 따라서, 쥐에 에코 HIV 감염 모델의 확장 (일반적으로 약물 남용 및 신경 인지 장애의 연구에 사용) neuroHIV의 연구에서 유리 할 것 이다. 예를 들어, 그들의 큰 크기는 약물 자가 투여 절차에 대한 경정맥 카테터 이식을 보다 실용적으로^8. 쥐의 약물 자가 투여 기술은 HIV-1^9의동기 부여를 평가하기 위해 활용되었습니다. 또한, 많은 신경 인지/행동 작업은 처음에 쥐를 위해 설계 되었다^10. 여기에서, 우리는 EcoHIV 감염 모형을 확장하고 neuroHIV 및 HAND와 관련있는 새로운 질문을 해결하기 위하여 중요한 기회를 마련하기 위하여 쥐에 있는 EcoHIV의 입체 주사의 활용을 보고합니다.

프로토콜

모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다 (연방 보증 번호 : D16-00028). 6 명의 성인 남성 F344 /N 쥐는 12/12 빛 아래 통제 된 환경에 수용 되었습니다: 음식과 물에 광고 리비툼 액세스 와 어두운 주기. 모든 동물은 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에서 건강의 국립 연구소에 의해 설립 된 지침을 사용하여 돌보았습니다.

1. 293 FT 셀의 바이러스 포장

1. DMEM을 가진 75cm² 플라스크를 코팅한 젤라틴293 FT 셀(5×10 5/mL)을 배양하고 10% FBS^11을갖는다. 37°C에서 세포를 50% 수축시 로 성장시다.
2. 1.5mL 마이크로 원심분리기 관및 3s의 소용돌이에서 중간(예: Opti-MEM)의 750 μL에서 22.5 μL의 형질 전환 시약(예: 리포펙타민 3000)을 희석시희석한다.
3. 에코HIV 플라스미드 DNA 의 20 μg를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 750 μL의 배지를 희석하고 잘 섞는다.
4. 희석된 DNA를 희석된 트랜스페션 시약의 튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
5. 혼합물을 75cm² 플라스크에 미리 데워진 DMEM 배지의 10mL에 첨가한다. 37°C에서 2일 동안 세포를 배양한다.
6. 포장 된 렌즈 바이러스를 포함하는 두 플라스크에서 조건부 배지24 mL을 수확하고 결합하십시오.
7. 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 500 x g에서 조건부 배지 의 24mL 을 모두 분리합니다. 멸균 50 mL 튜브에 명확한 상체를 전송합니다.
8. 렌티-x 농축기 8mL과 24mL의 명확한 상류체(1:3 비율)를 결합합니다. 부드러운 반전으로 섞으세요. 2 일 동안 4 °C에서 혼합물을 배양하십시오.
9. 원심분리기 혼합물은 4°C에서 45분간 1,500 x g에서 혼합물을 혼합합니다. 상체를 조심스럽게 제거합니다.
10. 100mM PBS의 100 μL로 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단합니다.
11. p24 ELISA 키트를 가진 티터 바이러스 농도.

2. 에코 HIV-EGFP 바이러스 스테레오탁스 수술

1. 3% 세보플루란을 사용하여 쥐를 마취합니다. 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없을 때 2.2 단계로 진행하십시오.
2. 뇌 부위의 머리카락을 면도하고 70%에탄올과 클로르헨시딘 기반 스크럽으로 피부를 두 번 살균합니다. 스테레오탁스 장치에서 쥐를 수적으로 고정한다.
3. 두피 미드라인을 따라 피부를 통해 절개(5-6cm)를 만듭니다.
4. 2개의 드릴링 위치를 0.8mm 측면, 1.2mm 로스트럴에서 브레그마까지 표시하십시오. 각 두개골 위치에 구멍(직경 0.4mm)을 드릴링합니다.
5. 10 μL 주사 주사기에 titered EcoHIV 렌즈티바이러스 용액 (1.04 × 10⁶ TU / mL)을 채웁니다. 주사기를 스테레오탁스 장치에 고정시하십시오.
6. 드릴링 구멍의 표면에 가까운 바늘아래로 이동합니다. 깊이 2.5mm를 측정하고 이동합니다.
7. 0.2 μL/min의 속도로 바이러스 용액 1 μL을 주입합니다. 주사 부위 내부에 바늘을 5 분 동안 보관하십시오. 쥐 두개골 바깥에 들 때까지 바늘을 천천히 위로 움직입니다.
8. 4-0 실크 실로 피부를 봉합합니다.
9. 한 번 70 %에탄올로 절개를 살균. 피하 부토르페놀 (도롤렉스, 0.1 mg/kg 체중)을 피하하십시오.
10. 쥐가 깨어날 때까지 가열 패드가있는 복구 챔버로 전송합니다.

3. 뇌 섹션의 시각화

참고: EcoHIV 바이러스 주입 후 1~8주 동안 기다립니다.

1. 쥐를 5% 세보플루아네로 마취한다. 쥐가 유해 자극에 반응하지 않고 반사 신경이 없을 때 3.2 단계를 계속합니다.
2. 연기 후드 내부의 척추 위치에 쥐를 고정합니다.
3. 흉부 미드 라인을 따라 피부를 절개합니다. 다이어프램을 자르고 흉부 구멍을 엽니다.
4. 20 G × 25mm 바늘을 왼쪽 심실에 삽입합니다.
5. 가위로 오른쪽 아트리움을 즉시 엽니다.
6. 5mL/분 의 속도로 사전 냉각 된 100 mM PBS의 50 mL을 perfuse.
7. 5 mL /분의 속도로 감기 4 % 파라 포름 알데히드의 100 mL을 Perfuse.
8. 쥐를 참수, 두피를 열고 뇌를 제거.
9. 포식알데히드 4%로 하룻밤 사이에 포스트픽스.
10. 뇌가 바닥까지 떠날 때까지 50mL 튜브에서 100mM PBS에서 30% 자당30%의 40mL로 뇌를 옮기십시오(약 3일).
11. 스냅에서 2 분 동안 메틸 부타놀에서 뇌를 동결 - 80 °C.
12. -20°C 극저온 내부의 금속 플랫폼에서 뇌 조직을 확보하십시오.
13. 저온을 사용하여 50 μm 두께의 관상 섹션을 잘라냅니다.
14. 미세 브러시로 뇌 슬라이스를 유리 슬라이드에 옮기십시오.
15. 0.3mL의 안티페이드 배지에 단면을 장착하고 22mm 50mm 커버립으로 커버합니다.
16. 유리 슬라이드를 실온에서 건조할 때까지 어둡게 유지합니다.
17. 뇌 영역 경계와 뉴런의 형태학적 특성을 기반으로 Z 스택을 사용하여 공초점 현미경으로 표적 뉴런을 이미지합니다.
    참고: 사용된 공초점 현미경 설정은 488 nm의 파장을 사용하여 60 X (A/1.4, 오일)와 0.15 μm (핀홀 크기 30 μm, 백 투영 핀홀 반경 167 nm)의 Z 평면 간격이었습니다.

결과

조건부 배지는 293FT 세포에 감염된 EcoHIV-EGFP의 렌티바이러스로부터 수집되었다. 다음으로, 그것은 집중 하 고 titered, 다음 스테레오로 뇌에 주입 (피 질 영역) F344/N 쥐의. 7일 후 주사 후, 쥐를 희생하고 브레그마 -4.68 mm에 이르는 관상 동맥 뇌 슬라이스에서 촬영되었다. 도 1A에서,특히 피질과 해마 규명 자이루스에서 뇌 전체에 걸쳐 중요한 EcoHIV-EGFP 신호가 있습니다. 더욱이, ?...

토론

이 프로토콜에서, 우리는 쥐에 있는 EcoHIV 유도한 HIV 감염 모형을 설치했습니다. 구체적으로, 우리는 성공적으로 쥐 뇌에서 활성 HIV 감염을 유도 피질에 에코 HIV의 양측 스테레오테스테레오테시 주입을 설명 7 주사 후 일. Futhermore, 우리는 쥐에 있는 EcoHIV 감염이 HAND의 중요한 양상을 공부하는 좋은 생물학 시스템이 될 수 있었다는 것을 보여줍니다. 8 주 후- EcoHIV 감염, 쥐는 중요한 신경 인지 장애를...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	ThermoFisher Scientific	R70007
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap	Life Technologies	354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Life Technologies	10013CV
Cover glass	VWR	637-137
drill
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Life Technologies	22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2	Med Vet International	VCP422H
Hamilton syringe	Hamilton	1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technologies	L3000015
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit	Cell Biolabs, inc.	VPK-107-5
Lenti-X Concentrator	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 900
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086