生态HIV脑感染的老鼠模型

摘要

在这里，我们提出了一个协议，建立一个新的大鼠模式，使用有幻想的艾滋病毒（EcoHIV），这是关键，以提高我们对HIV-1病毒库在大脑中的理解，并提供一个系统，以研究艾滋病毒相关的神经认知障碍和相关的合并症（即药物滥用）。

摘要

据充分研究，EcoHIV感染小鼠模型在研究艾滋病毒相关神经并发症方面具有重大效用。建立EcoHIV感染大鼠模型，用于研究药物滥用和神经认知障碍，将有利于神经HIV和HIV-1相关神经认知障碍（HAND）的研究。在本研究中，我们演示了使用有幻想的艾滋病毒（EcoHIV）成功创建了活性艾滋病毒感染的老鼠模型。首先，EcoHIV 的扁桃体结构在培养的 293 FT 单元中包装了 48 小时。然后，有条件的介质被集中和滴答作响。接下来，我们将EcoHIV-EGFP的双边立体毒性注射到F344/N大鼠脑组织中。感染一周后，在受感染的脑组织中检测到EGFP荧光信号，表明EcoHIV成功地诱发大鼠的艾滋病毒感染。此外，还对微胶质细胞标记物Ibba1进行了免疫染色。结果表明，微胶质是窝藏EcoHIV的主要细胞类型。此外，EcoHIV大鼠在时间处理方面表现出改变，这是HAND潜在的神经行为机制，感染后8周出现突触功能障碍。本研究将EcoHIV艾滋病毒-1感染模型共同扩展至大鼠，为研究大脑中的HIV-1病毒库以及手部和药物滥用等相关合并症提供了宝贵的生物系统。

引言

生物系统增强了我们对HIV-1相关神经认知障碍（HAND）及其基础神经机制²的理解。确定哪个生物系统最适合任何特定的研究，往往取决于利益问题^2。宿主动物模型范围的限制对艾滋病毒-1疾病发展的研究提出了挑战。为了研究HIV-1病毒的复制和发病机理，Potash等人³日创建了活性HIV-1感染的小鼠模型，用生态MLV gp80取代了HIV表面包络糖蛋白gp120的编码区域，从而成功地^在4号小鼠身上进行了病毒复制。在有幻想的HIV（EcoHIV）小鼠注射尾静脉后，观察到许多特征与HIV-1血清阳性个体（如受感染的淋巴细胞和巨噬细胞，针对抗病毒免疫反应，以及炎症^3，5，6）相似。

虽然老鼠和老鼠都是Muridae的成员，但基本物种的差异可能会影响它们适合特定的实验问题^7。因此，将EcoHIV感染模型推广到大鼠（通常用于药物滥用和神经认知障碍的研究）将有利于神经HIV的研究。例如，其较大的尺寸使朱拉导管植入药物自我管理程序更实用^8。大鼠的药物自我管理技术被用来评估艾滋病毒-1⁹的动机。此外，许多神经认知/行为任务最初是为¹⁰号大鼠设计的。在这里，我们报告利用大鼠EcoHIV的立体毒性注射来扩展EcoHIV感染模式，并提供了一个关键的机会来解决与神经HIV和HAND相关的新问题。

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研究方案

所有动物协议均由南卡罗来纳大学动物护理和使用委员会审查和批准（联邦保证号:D16-00028）。六只成年雄性F344/N大鼠被配对安置在12/12光下的受控环境中:暗循环，可获得食物和水。所有动物都受到照料，使用国家卫生研究院在《实验室动物护理和使用指南》中制定的准则。

1. 293 个 FT 细胞中的病毒包装

1. 培养293 FT细胞（5×10^5/mL）在明胶涂层75厘米² 烧瓶与DMEM加10%FBS^11。在37°C下生长细胞，在转染时达到50%的汇流。
2. 在 1.5 mL 微离心管和涡流 3s 中稀释 750 μL 介质（例如 Opti-MEM）中的 22.5 μL 转染试剂（例如，脂质胺 3000）。
3. 在 1.5 mL 微离心管中将 20μg 的 EcoHIV 质粒DNA稀释到 750 μL 的介质中，并很好地混合在一起。
4. 将稀释后的DNA加入稀释的输血试剂管中，轻轻混合。在室温下孵育15分钟。
5. 将混合物加入 10 mL 预热 DMEM 介质，75 厘米² 瓶。在37°C下孵化细胞2天。
6. 从包括包装扁豆病毒在内的两个烧瓶中收获并组合 24 mL 的有条件介质。
7. 离心机所有24 mL的有条件介质在500 x g 10分钟在4°C。 将澄清的超自然人转移到无菌的 50 mL 管中。
8. 将 8 mL 的 Lenti-x 浓缩器与 24 mL 的澄清超音量（1:3 比例）混合。通过温柔的反转混合。在4°C下孵化混合物两天。
9. 离心机混合物在1，500 x g 45分钟在4°C。 小心地去除超自然。
10. 用 100 μL 的 100 mM PBS 轻轻重新悬浮颗粒。
11. 带p24 ELISA套件的滴定病毒浓度。

2. 生态HIV-EGFP病毒立体毒性手术

1. 使用3%的塞沃氟兰麻醉大鼠。当大鼠对有毒刺激没有反应且没有反射时，继续进入第 2.2 步。
2. 剃掉大脑区域的头发，用70%的乙醇和氯西丁砂对皮肤进行两次消毒。将大鼠固定在立体声装置的易发位置。
3. 沿着头皮中线穿过皮肤切口（5-6 厘米）。
4. 标记两个钻井位置，横向 0.8 毫米，1.2 毫米旋转到布雷格马。在每个头骨位置钻一个孔（直径0.4毫米）。
5. 在 10 μL 注射注射注射器中填充滴定 EcoHIV 扁豆病毒溶液 （1.04 × 10⁶ TU/mL）。将注射器固定在立体声毒装置上。
6. 向下移动靠近钻孔表面的针头。测量并移动 2.5 毫米深度。
7. 以 0.2 μL/min 的速度注入 1 μL 病毒溶液。将针头放在注射区域内5分钟。慢慢地把针头移上去，直到它从老鼠头骨外面。
8. 用 4 -0 丝线缝合皮肤。
9. 用70%乙醇消毒切口一次。皮下注射丁酚（多罗莱克斯，0.1毫克/千克体重）。
10. 将老鼠转移到带加热垫的恢复室，直到它醒来。

3. 大脑部分的可视化

注:在 EcoHIV 病毒输液后等待一到八周。

1. 用5%的雌氟氨酰氨基麻醉大鼠。当大鼠对有毒刺激没有反应且没有反射时，继续踩 3.2。
2. 将老鼠固定在烟罩内的超平位置。
3. 沿着胸腔中线将皮肤倾斜。切开隔膜，打开胸腔。
4. 在左心室插入20G×25毫米针头。
5. 立即用剪刀打开右中庭。
6. 以 5 mL/min 的速度灌注 50 mL 的预制 100 mM PBS。
7. 以5mL/min的速度，将100mL的冷4%副甲醛灌注。
8. 斩首大鼠，打开头皮，取出大脑。
9. 后缀过夜与4%的副甲醛。
10. 在50mL管中的100mM PBS中将大脑转移到40mL的30%蔗糖，直到大脑漂浮到底部（大约3天）。
11. 捕捉冻结大脑在甲基丁醇2分钟在-80°C。
12. 将脑组织固定在 -20 °C 冷冻站台内的金属平台上。
13. 使用冷冻统计器切割 50μm 厚的日冕部分。
14. 用细刷将脑片转移到玻璃滑梯上。
15. 0.3 mL 防法介质的安装部分，并覆盖 22 毫米 50 毫米覆盖点。
16. 在室温下将玻璃滑梯保持在黑暗中直到干燥。
17. 根据大脑区域边界和神经元的形态特征，使用 Z 堆栈使用共焦显微镜对目标神经元进行成像。
    注:使用的共焦显微镜设置为:放大60 X（A/1.4，油），Z平面间隔为0.15微米（针孔大小30微米;背投针孔半径167 nm），波长为488 nm。

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结果

条件介质是从感染了293FT细胞的EcoHIV-EGFP的扁豆病毒中收集的。接下来，它被浓缩和滴答作响，然后立体地注入F344/N大鼠的大脑（皮质区域）。注射后七天，老鼠被牺牲，图像从冠状脑切片从胸围5.64毫米到布雷格玛-4.68毫米不等。在 图1A中，整个大脑都有显著的EcoHIV-EGFP信号，特别是在皮层和海马凹痕陀螺中。此外，与Iba1和EcoHIV-EGFP探头的双重标记提供了有力的证据，证明微?...

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讨论

在本议定书中，我们建立了大鼠感染EcoHIV的艾滋病毒模式。具体来说，我们描述了EcoHIV的双边立体毒性注射到皮层，在注射后7天成功地诱导了大鼠大脑中的活性HIV感染。此外，我们证明，大鼠的EcoHIV感染可能是研究HAND关键方面的一个很好的生物系统。在EcoHIV感染后八周，大鼠表现出严重的神经认知障碍，其中包括在NAc的MSN中时间处理和突触功能障碍的改变。鉴于动物模型对神经HIV和

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	ThermoFisher Scientific	R70007
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap	Life Technologies	354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Life Technologies	10013CV
Cover glass	VWR	637-137
drill
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Life Technologies	22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2	Med Vet International	VCP422H
Hamilton syringe	Hamilton	1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technologies	L3000015
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit	Cell Biolabs, inc.	VPK-107-5
Lenti-X Concentrator	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 900
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086