Крысиная модель инфекции мозга EcoHIV

Резюме

Здесь мы представляем протокол для создания новой крысиной модели активной ВИЧ-инфекции с использованием химерного ВИЧ (EcoHIV), которая имеет решающее значение для улучшения нашего понимания вирусных резервуаров ВИЧ-1 в мозге и предлагает систему для изучения ВИЧ-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств и связанных с ними сопутствующих заболеваний (то есть злоупотребления наркотиками).

Аннотация

Было хорошо изучено, что модель мыши, инфицированная EcoHIV, имеет значительную полезность при исследовании неврологических осложнений, связанных с ВИЧ. Создание модели ecoHIV инфицированных крыс для изучения злоупотребления наркотиками и нейрокогнитивных расстройств было бы полезным при изучении нейроHIV и ВИЧ-1-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств (HAND). В настоящем исследовании мы демонстрируем успешное создание крысиной модели активной ВИЧ-инфекции с использованием химерного ВИЧ (EcoHIV). Во-первых, лентивирусная конструкция EcoHIV была упакована в культивирование 293 FT-клеток в течение 48 часов. Затем условная среда была сконцентрирована и титрована. Затем мы выполнили двусторонние стереотаксические инъекции EcoHIV-EGFP в ткань мозга крысы F344/N. Через неделю после заражения в инфицированной ткани мозга были обнаружены флуоресцентные сигналы EGFP, что указывает на то, что EcoHIV успешно индуцирует активную ВИЧ-инфекцию у крыс. Кроме того, было проведено иммуноокрашивание маркера микроглиальных клеток Iba1. Результаты показали, что микроглия была преобладающим типом клеток, скрывающих EcoHIV. Кроме того, крысы EcoHIV демонстрировали изменения во временной обработке, потенциальном нейроповеденческих механизмах HAND, а также синаптическую дисфункцию через восемь недель после заражения. В совокупности настоящее исследование распространяет модель EcoHIV инфекции ВИЧ-1 на крыс, предлагающих ценную биологическую систему для изучения вирусных резервуаров ВИЧ-1 в мозге, а также HAND и связанных с ней сопутствующих заболеваний, таких как злоупотребление наркотиками.

Введение

Биологические системы улучшили наше понимание нейрокогнитивных расстройств, связанных с ВИЧ-1 (HAND), и лежащих в их основе нейронных механизмов^2. Определение того, какая биологическая система наиболее подходит для любого данного исследования, часто зависит от интересующего вопроса^2. Ограничение диапазона моделей животных-хозяев ставит под вопросы исследования развития болезни ВИЧ-1. Для исследования репликации и патогенеза вируса ВИЧ-1 Potash et al.³ создали мышиную модель активной инфекции ВИЧ-1, заменив кодировку области гликопротеина поверхностной оболочки ВИЧ, gp120, экотропным MLV gp80, что привело к успешной репликации вируса у мышей^4. После инъекций в хвостовую вену у химерных мышей с ВИЧ (EcoHIV) наблюдалось много характеристик, напоминающих характеристики серопозитивных людей ВИЧ-1 (например, инфицированные лимфоциты и макрофаги, нацеленные на противовирусные иммунные реакции, и воспаление^3,5,6).

Хотя мыши и крысы являются членами Muridae, фундаментальные видовые различия могут влиять на их пригодность для конкретных экспериментальных вопросов^7. Таким образом, распространение модели инфекции EcoHIV на крыс (обычно используемой в исследованиях злоупотребления наркотиками и нейрокогнитивных расстройств) было бы выгодным при изучении neuroHIV. Например, их больший размер делает имплантацию яремного катетера для процедур самостоятельного введения лекарств более практичной^8. Методы самостоятельного введения лекарств у крыс были использованы для оценки мотивации при ВИЧ-1^9. Кроме того, многие нейрокогнитивные / поведенческие задачи были первоначально разработаны для крыс^10. Здесь мы сообщаем об использовании стереотаксических инъекций EcoHIV у крыс для расширения модели инфекции EcoHIV и предоставления ключевой возможности для решения новых вопросов, связанных с neuroHIV и HAND.

протокол

Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Каролины (федеральный номер гарантии: D16-00028). Шесть взрослых самцов крыс F344/N были размещены в контролируемой среде при свете 12/12: темный цикл с доступом ad libitum к пище и воде. Обо всех животных заботились в целях использования руководящих принципов, установленных Национальными институтами здравоохранения в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию.

1. Упаковка вируса в 293 FT клетки

1. Культивируем 293 FT клетки (5×10⁵/мл) в желатиновые покрытые 75^см2 колбы с DMEM плюс 10% FBS¹¹. Выращивайте клетки при 37 °C, чтобы они были 50% конфюентными при трансфекции.
2. Разбавляют 22,5 мкл трансфекционного реагента (например, Lipofectamine 3000) в 750 мкл среды (например, Opti-MEM) в микроцентрифужной трубке 1,5 мл и вихре в течение 3 с.
3. Развести 20 мкг плазмидной ДНК EcoHIV в 750 мкл среды в микроцентрифужной трубке 1,5 мл и хорошо перемешать.
4. Добавьте разбавленный ДНК в пробирку разбавленного трансфекционного реагента и аккуратно перемешайте. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
5. Добавьте смесь в 10 мл предварительной смременной среды DMEM в колбу 75^см2. Инкубировать клетки в течение 2 дней при 37 °C.
6. Собирают и убирают 24 мл условной среды из двух колбы, в состав которого входит упакованный лентивирус.
7. Центрифуга все 24 мл условной среды при 500 х г в течение 10 минут при 4 °C. Переложите осветленное супернатант в стерильную трубку 50 мл.
8. Смешайте 8 мл концентратора Lenti-x с 24 мл осветленного супернатанта (соотношение 1:3). Перемешать путем мягкой инверсии. Инкубировать смесь при 4 °С в течение двух дней.
9. Центрифужная смесь при 1 500 х г в течение 45 минут при 4 °C. Осторожно удалите супернатант.
10. Осторожно повторно суспендируйте гранулы со 100 мкл 100 мМ PBS.
11. Концентрация вируса титра с набором p24 ELISA.

2. Стереотаксические операции на вирусе EcoHIV-EGFP

1. Обезболивать крыс, используя 3% севофлурана. Переходите к шагу 2.2, когда крысы не реагируют на ядные раздражители и рефлексы отсутствуют.
2. Сбрите волоски из области мозга и стерилизуйте кожу дважды с 70% этанолом и скрабом на основе хлоргексидина. Закрепите крысу в положении лежа в стереотаксическом аппарате.
3. Сделайте разрез (5-6 см) через кожу вдоль средней линии волосистой части головы.
4. Отметьте два положения сверления на 0,8 мм боковой, 1,2 мм ростральной до брегмы. Просверлите отверстие (диаметр 0,4 мм) в каждом положении черепа.
5. Заполните титрованный раствор лентивируса EcoHIV (1,04 × 10⁶ TU/мл) в шприц для инъекций 10 мкл. Закрепите шприц к стереотаксическому аппарату.
6. Сдвиньтесь вниз по игле вплотную к поверхности сверления отверстия. Измеряйте и перемещайте 2,5 мм в глубину.
7. Наполнить 1 мкл раствора вируса со скоростью 0,2 мкл/мин. Держите иглу внутри области инъекции в течение 5 мин. Медленно перемещайте иглу вверх, пока она не появится за пределами черепа крысы.
8. Зашиваем кожу шелковой нитью 4-0.
9. Стерилизуйте разрез 70% этанолом однократно. Подкожно вводят буторфенол (Доролекс, 0,1 мг/кг массы тела).
10. Перенесите крысу в камеру восстановления с грелкой, пока она не проснется.

3. Визуализация участков мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите от одной до восьми недель после вирусной инфузии EcoHIV.

1. Обезболивают крыс 5% севофлураном. Продолжайте двигаться к шагу 3.2, когда крысы не реагируют на пазубные раздражители и рефлексы отсутствуют.
2. Зафиксируйте крысу в положении лежа на спине внутри вытяжного капюшона.
3. Разрезать кожу вдоль грудной средней линии. Разрезать диафрагму и открыть грудную полость.
4. Вставьте 20 г × 25 мм иглы в левый желудочек.
5. Сразу же открыть ножницами правое предсердие.
6. Перфьюсировать 50 мл предварительно охлажденного 100 мМ PBS со скоростью 5 мл/мин.
7. Перфьюировать 100 мл холодного 4% параформальдегида со скоростью 5 мл/мин.
8. Обезглавить крысу, открыть кожу головы и удалить мозг.
9. Постфикс на ночь с 4% параформальдегидом.
10. Переведите мозг на 40 мл 30% сахарозы в 100 мМ PBS в трубке 50 мл до тех пор, пока мозг не всплывет на дно (около 3 дней).
11. Заморозьте мозг в метилбутаноле в течение 2 мин при - 80 °C.
12. Закрепите ткани мозга на металлической платформе внутри криостата -20 °C.
13. Вырежьте корональные срезы толщиной 50 мкм с помощью криостата.
14. Переложите кусочки мозга на стеклянные слайды тонкой кистью.
15. Монтаж секций в 0,3 мл противотеклоплавого средства и покрытие с 22 мм 50 мм обтекательными прорезями.
16. Держите стеклянные горки в темноте при комнатной температуре до высыхания.
17. Визуализируйте целевые нейроны с помощью конфокального микроскопа с помощью Z-стека на основе границ областей мозга и морфологических характеристик нейронов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались настройки конфокального микроскопа: увеличение 60 X (A/1,4, масло) и интервал Z-плоскости 0,15 мкм (размер точечного отверстия 30 мкм; обратно проецируемый радиус точечного отверстия 167 нм) с использованием длины волны 488 нм.

Результаты

Кондиционированная среда была собрана из лентивируса инфицированных EcoHIV-EGFP 293FT клеток. Затем его концентрировали и титровывали, а затем стереотаксически вводили в мозг (кортикальная область) крыс F344/N. Через семь дней после инъекции крыс приносили в жертву и делали изображения с корона?...

Обсуждение

В этом протоколе мы установили модель ВИЧ-инфекции, индуцированную EcoHIV, у крыс. В частности, мы описали двустороннюю стереотаксическую инъекцию EcoHIV в кору, которая успешно индуцировала активную ВИЧ-инфекцию в мозге крыс через 7 дней после инъекции. Кроме того, мы демонстрируем, что инфек...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	ThermoFisher Scientific	R70007
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap	Life Technologies	354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Life Technologies	10013CV
Cover glass	VWR	637-137
drill
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Life Technologies	22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2	Med Vet International	VCP422H
Hamilton syringe	Hamilton	1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technologies	L3000015
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit	Cell Biolabs, inc.	VPK-107-5
Lenti-X Concentrator	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 900
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086