Un modèle de rat d’infection cérébrale EcoHIV

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à établir un nouveau modèle d’infection active par le VIH chez les rats à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV), qui est essentiel pour améliorer notre compréhension des réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau et offrir un système pour étudier les troubles neurocognitifs associés au VIH et les comorbidités associées (c.-à-d. l’abus de drogues).

Résumé

Il a été bien étudié que le modèle murin infecté par EcoHIV est d’une grande utilité dans l’étude des complications neurologiques associées au VIH. L’établissement du modèle de rat infecté par le VIH ecoHIV pour les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs serait bénéfique dans l’étude des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 et au VIH-1 . Dans la présente étude, nous démontrons la création réussie d’un modèle de rat d’infection active par le VIH à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV). Tout d’abord, la construction lentivirale d’EcoHIV a été emballée dans des cellules cultivées de 293 FT pendant 48 heures. Ensuite, le milieu conditionnel a été concentré et titré. Ensuite, nous avons effectué des injections stéréotaxiques bilatérales de l’EcoHIV-EGFP dans le tissu cérébral du rat F344/N. Une semaine après l’infection, des signaux de fluorescence EGFP ont été détectés dans le tissu cérébral infecté, indiquant que EcoHIV induit avec succès une infection active par le VIH chez les rats. En outre, immunostaining pour le marqueur microglial de cellules, Iba1, a été exécuté. Les résultats ont indiqué que la microglie était le type prédominant de cellules hébergeant EcoHIV. En outre, les rats d’EcoHIV ont montré des changements du traitement temporel, un mécanisme neurobehavioral fondamental potentiel de main aussi bien que le dysfonctionnement synaptique huit semaines après infection. Collectivement, la présente étude étend le modèle EcoHIV de l’infection par le VIH-1 au rat offrant un système biologique précieux pour étudier les réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau ainsi que la MAIN et les comorbidités associées telles que l’abus de drogues.

Introduction

Les systèmes biologiques ont amélioré notre compréhension des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 (HAND) et de leurs mécanismes neuronaux sous-jacents². La détermination du système biologique le plus approprié pour une étude donnée dépend souvent de la question d’intérêt². La limitation de la gamme de modèles animaux hôtes remet en question les études sur le développement de la maladie du VIH-1. Pour étudier la réplication virale et la pathogenèse du VIH-1, Potash et coll.³ ont créé un modèle murin d’infection active par le VIH-1, remplaçant la région codante de la glycoprotéine de l’enveloppe de surface du VIH, gp120, par la MLV gp80 écotrope, ce qui a conduit à une réplication virale réussie chez la souris^4. Après des injections dans les veines de la queue chez des souris chimériques séropositives (EcoHIV), de nombreuses caractéristiques ressemblant à celles des personnes séropositives du VIH-1 (p. ex. lymphocytes et macrophages infectés, ciblés pour les réponses immunitaires antivirales, et inflammation^3,5,6).

Bien que les souris et les rats soient tous deux membres des Muridés, les différences fondamentales entre les espèces peuvent influencer leur aptitude à répondre à des questions expérimentales spécifiques⁷. Par conséquent, l’extension du modèle d’infection EcoHIV aux rats (couramment utilisé dans les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs) serait avantageuse dans l’étude du neuroHIV. Par exemple, leur plus grande taille rend l’implantation de cathéter jugulaire pour les procédures d’auto-administration de médicaments plus pratique⁸. Des techniques d’auto-administration de médicaments chez le rat ont été utilisées pour évaluer la motivation dans le VIH-1^9. En outre, de nombreuses tâches neurocognitives / comportementales ont été initialement conçues pour les rats¹⁰. Ici, nous rapportons l’utilisation des injections stereotaxic d’EcoHIV chez les rats pour prolonger le modèle d’infection d’EcoHIV et offrir une occasion clé d’adresser de nouvelles questions liées à neuroHIV et à HAND.

Protocole

Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de la Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028). Six rats F344/N mâles adultes ont été logés dans un environnement contrôlé sous un cycle 12/12 clair: sombre avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été pris en charge en utilisant les lignes directrices établies par les National Institutes of Health dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Emballage du virus dans 293 cellules FT

1. Culture des 293 cellules FT (5×10^5/mL)dans des flacons enrobés de gélatine de 75 cm² avec du DMEM plus 10% FBS^11. Cultiver les cellules à 37 °C pour être 50 % confluentes à la transfection.
2. Diluer 22,5 μL de réactif de transfection (p. ex. lipofectamine 3000) dans 750 μL de milieu (p. ex. Opti-MEM) dans un tube de micro-centrifugeuse et un vortex de 1,5 mL pendant 3 s.
3. Diluer 20 μg d’ADN plasmidique EcoHIV dans 750 μL de milieu dans un tube micro-centrifugeuse de 1,5 mL et bien mélanger.
4. Ajouter l’ADN dilué dans le tube du réactif de transfection dilué et mélanger doucement. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
5. Ajouter le mélange à 10 mL de milieu DMEM prémulé dans une fiole de 75 cm^2. Incuber les cellules pendant 2 jours à 37 °C.
6. Récolter et combiner 24 mL de milieu conditionnel à partir des deux fioles qui comprennent le lentivirus emballé.
7. Centrifuger tout 24 mL de milieu conditionnel à 500 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Transférer le surnageant clarifié dans un tube stérile de 50 mL.
8. Combiner 8 mL de concentrateur Lenti-x avec 24 mL de surnageant clarifié (rapport 1:3). Mélanger par inversion douce. Incuber le mélange à 4 °C pendant deux jours.
9. Mélange centrifuge à 1 500 x g pendant 45 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant.
10. Suspendre doucement la pastille avec 100 μL de PBS de 100 mM.
11. Concentration de virus de titre avec un kit ELISA p24.

2. Chirurgies stéréotaxiques du virus EcoHIV-EGFP

1. Anesthésier les rats à l’aide de 3% de sévoflurane. Passez à l’étape 2.2 lorsque les rats ne réagissent pas aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.
2. Rasez les poils de la région du cerveau et stérilisez la peau deux fois avec de l’éthanol à 70% et un gommage à base de chlorhexidine. Fixez le rat en position couchée dans l’appareil stéréotaxique.
3. Faites une incision (5-6 cm) à travers la peau le long de la ligne médiane du cuir chevelu.
4. Marquer deux positions de forage à 0,8 mm latérale, 1,2 mm rostral à bregma. Percez un trou (diamètre 0,4 mm) dans chaque position du crâne.
5. Remplissez la solution de lentivirus EcoHIV titré (1,04 × 10⁶ TU/mL) dans une seringue d’injection de 10 μL. Fixez la seringue à l’appareil stéréotaxique.
6. Descendez l’aiguille près de la surface du trou de forage. Mesurer et déplacer 2,5 mm de profondeur.
7. Infuser 1 μL de solution virale à raison de 0,2 μL/min. Gardez l’aiguille à l’intérieur de la zone d’injection pendant 5 min. Déplacez lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit à l’extérieur du crâne du rat.
8. Suturer la peau avec un fil de soie 4-0.
9. Stérilisez l’incision avec de l’éthanol à 70% une fois. Injecter par voie sous-cutanée du butorphénol (Dorolex, 0,1 mg/kg de poids corporel).
10. Transférer le rat dans une chambre de récupération avec un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il se réveille.

3. Visualisation des sections du cerveau

REMARQUE: Attendez une à huit semaines après la perfusion virale EcoHIV.

1. Anesthésier le rat avec 5% de sévoflurane. Passez à l’étape 3.2 lorsque les rats ne réagissent pas aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.
2. Fixez le rat en décubitus dorsal à l’intérieur d’une hotte.
3. Inciser la peau le long de la ligne médiane thoracique. Coupez le diaphragme et ouvrez la cavité thoracique.
4. Insérez une aiguille de 20 G × de 25 mm dans le ventricule gauche.
5. Ouvrez immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux.
6. Perfuser 50 mL de PBS prechilled de 100 mM à raison de 5 mL/min.
7. Perfuser 100 mL de paraformaldéhyde froid à 4 % à raison de 5 mL/min.
8. Décapiter le rat, ouvrir le cuir chevelu et enlever le cerveau.
9. Postfix pendant la nuit avec 4% de paraformaldéhyde.
10. Transférer le cerveau à 40 mL de saccharose à 30% dans du PBS de 100 mM dans un tube de 50 mL jusqu’à ce que le cerveau flotte vers le bas (environ 3 jours).
11. Snap congeler le cerveau dans le méthylbutanol pendant 2 min à - 80 °C.
12. Fixez le tissu cérébral sur une plate-forme métallique à l’intérieur d’un cryostat à -20 °C.
13. Couper des sections coronales de 50 μm d’épaisseur à l’aide du cryostat.
14. Transférer les tranches de cerveau sur des lames de verre avec une brosse fine.
15. Monter des sections dans 0,3 mL de milieu d’étouffement et couvrir avec des lamures de 22 mm 50 mm.
16. Gardez les lames de verre dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit sec.
17. Imagez les neurones ciblés avec un microscope confocal à l’aide de Z-stack basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones.
    NOTA : Les réglages du microscope confocal utilisés étaient les suivants : grossissement de 60 X (A/1,4, huile) et intervalle du plan Z de 0,15 μm (taille du trou d’épingle de 30 μm; rayon de trou d’épingle rétro-projeté de 167 nm) en utilisant une longueur d’onde de 488 nm.

Résultats

Le milieu conditionné a été recueilli à partir du lentivirus des cellules 293FT infectées par EcoHIV-EGFP. Ensuite, il a été concentré et titré, puis injecté stéréotaxiquement dans le cerveau (région corticale) des rats F344/N. Sept jours après l’injection, des rats ont été sacrifiés et des images ont été prises des tranches coronales de cerveau s’étendant du bregma 5.64 millimètres au bregma -4.68 millimètres. Sur la figure 1A,il existe des signaux EcoHIV-EGFP sign...

Discussion

Dans ce protocole, nous avons établi un modèle d’infection par le VIH induite par EcoHIV chez les rats. Plus précisément, nous avons décrit une injection stéréotaxique bilatérale d’EcoHIV dans le cortex qui a réussi à instituer l’infection active par le VIH dans le cerveau de rat 7 jours après l’injection. De plus, nous démontrons que l’infection à EcoHIV chez le rat pourrait être un bon système biologique pour étudier les aspects clés de la MAIN. Huit semaines après l’infection par le Virus...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	ThermoFisher Scientific	R70007
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap	Life Technologies	354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Life Technologies	10013CV
Cover glass	VWR	637-137
drill
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Life Technologies	22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2	Med Vet International	VCP422H
Hamilton syringe	Hamilton	1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technologies	L3000015
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit	Cell Biolabs, inc.	VPK-107-5
Lenti-X Concentrator	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 900
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086