EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli

Özet

Burada, beyindeki HIV-1 viral rezervuarlarını anlamamızı geliştirmek ve HIV ile ilişkili nöroknaktif bozuklukları ve ilişkili komorbiditeleri (yani uyuşturucu bağımlılığı) incelemek için bir sistem sunmak için kritik öneme sahip olan kimerik HIV (EcoHIV) kullanarak aktif HIV enfeksiyonunun yeni bir sıçan modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

EcoHIV enfekte fare modelinin HIV ile ilişkili nörolojik komplikasyonların araştırılmasında önemli bir yararı olduğu iyi incelenmiştir. İlaç kötüye kullanımı ve nöroknasitif bozukluklar çalışmaları için EcoHIV enfekte sıçan modelinin kurulması, nöroHIV ve HIV-1 ilişkili nörokinetif bozuklukların (EL) çalışmasında faydalı olacaktır. Bu çalışmada, kimerik HIV (EcoHIV) kullanılarak aktif HIV enfeksiyonunun sıçan modelinin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu göstermektedir. İlk olarak, EcoHIV'in lentiviral yapısı 48 saat boyunca kültürlü 293 FT hücrelerde paketlendi. Daha sonra, koşullu ortam yoğunlaştı ve titretildi. Daha sonra, EcoHIV-EGFP'nin F344/N sıçan beyin dokusuna bilateral stereotaksik enjeksiyonlarını gerçekleştirdik. Enfeksiyondan bir hafta sonra, enfekte beyin dokusunda EGFP floresan sinyalleri tespit edildi ve bu da EcoHIV'in sıçanlarda aktif bir HIV enfeksiyonunu başarıyla teşvik ettiğini gösterdi. Ayrıca Iba1 mikroglial hücre belirteci için immünostaining yapıldı. Sonuçlar, mikroglianın EcoHIV'i barındıran baskın hücre tipi olduğunu gösterdi. Ayrıca, EcoHIV sıçanları, HAND'in potansiyel bir nörobehavioral mekanizması olan zamansal işlemde ve enfeksiyondan sekiz hafta sonra sinaptik disfonksiyonda değişiklikler gösterdi. Toplu olarak, bu çalışma HIV-1 enfeksiyonunun EcoHIV modelini, beyindeki HIV-1 viral rezervuarlarını ve EL'i ve uyuşturucu kullanımı gibi ilişkili komorbiditeleri incelemek için değerli bir biyolojik sistem sunan sıçana genişletmektedir.

Giriş

Biyolojik sistemler HIV-1 ilişkili nöroklasitif bozukluklar (EL) ve bunların altında kalan sinirsel mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirmiştir². Herhangi bir çalışma için hangi biyolojik sistemin en uygun olduğunu belirlemek genellikle ilgi sorusuna bağlıdır². Konak hayvan modellerinin çeşitliliğinin sınırlandırılması HIV-1 hastalığı gelişimi çalışmalarına meydan okuyor. HIV-1 viral replikasyonu ve patogenezini araştırmak için Potash ve ark.^3, HIV yüzey zarfı glikoprotein kodlama bölgesi gp120'yi farelerde başarılı viral replikasyona yol açan ekotropik MLV gp80 ile değiştirerek aktif^HIV-1enfeksiyonunun bir fare modelini oluşturdu 4 . Kimerik HIV (EcoHIV) farelerinde kuyruk damarı enjeksiyonlarından sonra, HIV-1 seropositive bireylerinkine benzeyen birçok özellik gözlenmiştir (örneğin, antiviral immün yanıtlar için hedeflenen enfekte lenfositler ve makrofajlar ve iltihap^3,5,6).

Fareler ve sıçanlar Muridae'nin her ikisi de üyesi olmasına rağmen, temel tür farklılıkları belirli deneysel sorulara uygunluklarını etkileyebilir⁷. Bu nedenle, EcoHIV enfeksiyon modelinin sıçanlara uzatılması (yaygın olarak ilaç kötüye kullanımı ve nöroknatif bozukluk çalışmalarında kullanılır) nöroHIV çalışmasında avantajlı olacaktır. Örneğin, daha büyük boyutları, ilaç kendi kendine uygulama prosedürleri için juguler kateter implantasyonunu daha pratik hale getirir⁸. HIV-19'da motivasyonun değerlendirilmesi için sıçanlarda ilaçkendi kendine uygulama teknikleri kullanılmıştır. Ayrıca, birçok nöroknatif / davranışsal görev başlangıçta sıçanlar için tasarlanmıştır¹⁰. Burada, EcoHIV enfeksiyon modelini genişletmek ve neuroHIV ve HAND ile ilgili yeni soruları ele almak için önemli bir fırsat sağlamak için sıçanlarda EcoHIV'in stereotaksik enjeksiyonlarının kullanımını rapor ediyoruz.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (federal güvence numarası: D16-00028). Altı yetişkin erkek F344/N sıçanı, 12/12 ışık altında kontrollü bir ortamda barındırıldı: yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan karanlık döngü. Tüm hayvanlara, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'nde Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından oluşturulan yönergeler kullanılarak bakıldı.

1. 293 FT hücrelerde virüs paketleme

1. Kültür 293 FT hücreleri (5×10⁵/mL) jelatin kaplı 75 cm² şişeler ile DMEM artı% 10 FBS¹¹. 37 °C'de hücreleri transfeksiyonda %50 birikecek şekilde büyütün.
2. 22,5 μL transfeksiyon reaktifini (örneğin Lipofectamine 3000) 750 μL orta (örneğin, Opti-MEM) 1,5 mL mikro santrifüj tüpünde ve girdapta 3 sn seyreltin.
3. 20 μg EcoHIV plazmid DNA'yı 1,5 mL mikro santrifüj tüpünde 750 μL orta derecede seyreltin ve iyice karıştırın.
4. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin tüpüne seyreltilmiş DNA ekleyin ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.
5. Karışımı 75 cm² şişede 10 mL önceden ısıtilmiş DMEM ortamına ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 2 gün kuluçkaya yatır.
6. Paketlenmiş lentivirüs içeren iki şişeden 24 mL koşullu ortamı hasat edin ve birleştirin.
7. 24 mL'lik koşullu ortamın tamamını 500 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Netleştirilmiş süpernatantı steril 50 mL tüpe aktarın.
8. 8 mL Lenti-x konsantratörü 24 mL netleştirilmiş süpernatant (1:3 oran) ile birleştirin. Nazik bir ters çevirme ile karıştırın. Karışımı iki gün boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatır.
9. 4 °C'de 45 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj karışımı. Üst saltanayı dikkatlice çıkarın.
10. Peleti 100 μL 100 mM PBS ile hafifçe yeniden askıya alın.
11. P24 ELISA kiti ile titer virüs konsantrasyonu.

2. EcoHIV-EGFP virüs stereotaksik ameliyatları

1. % 3 sevoflurane kullanarak sıçanları uyuşturmak. Sıçanlar zararlı uyaranlara yanıt vermediğinde ve refleksler olmadığında 2.2 adımına geçin.
2. Beyin bölgesindeki kılları tıraş edin ve cildi% 70 etanol ve klorheksidin bazlı bir ovma ile iki kez sterilize edin. Sıçanı stereotaksik aparatta eğilimli bir pozisyonda sabitleyin.
3. Kafa derisi orta çizgisi boyunca ciltten bir kesi (5-6 cm) yapın.
4. 0,8 mm yanal, 1,2 mm rostral ve bregma olmak üzere iki delme pozisyonunu işaretleyin. Her kafatası pozisyonunda bir delik (çap 0,4 mm) delin.
5. Titrek EcoHIV lentivirüs çözeltisini (1,04 ×^{10 6} TU/mL) 10 μL enjeksiyon şırındında doldurun. Şırınnayı stereotaksik aparatlara sabitleyin.
6. İğneyi delme deliğinin yüzeyine yakın bir yere taşıyın. 2,5 mm derinlikte ölçün ve hareket ettinin.
7. 1 μL virüs çözeltisinin 0,2 μL/dak hızında demleyin. İğneyi enjeksiyon bölgesinin içinde 5 dakika tutun. İğneyi fare kafatasının dışına gelene kadar yavaşça yukarı hareket ettirin.
8. Cildi 4-0 ipek iplikle dikin.
9. Kesiği bir kez% 70 etanol ile sterilize edin. Deri altı enjekte butorfenol (Dorolex, 0.1 mg/kg vücut ağırlığı).
10. Sıçanı uyanana kadar bir ısıtma yastığı ile bir kurtarma odasına aktarın.

3. Beyin bölümlerinin görselleştirilmesi

NOT: EcoHIV viral infüzyondan sonra bir ila sekiz hafta bekleyin.

1. Sıçanı% 5 sevoflurane ile uyuşturun. Sıçanlar zararlı uyaranlara duyarlı olmadığında ve refleksler olmadığında 3.2 adımına devam edin.
2. Sıçanı duman kaputunun içinde bir supine pozisyonunda sabitle.
3. Cildi torasik orta hat boyunca inzivaya çeker. Diyaframı kesin ve torasik boşluğu açın.
4. Sol ventrikül içine 20 G × 25 mm iğne yerleştirin.
5. Hemen sağ atriyumu makasla açın.
6. 5 mL/dk hızında 50 mL ön yokuşlu 100 mM PBS'ye nüfuz edin.
7. 5 mL/ dk hızında 100 mL soğuk% 4 paraformaldehit perfuse.
8. Farenin kafasını kopar, kafa derisini aç ve beyni çıkar.
9. %4 paraformaldehit ile bir gecede postfix.
10. Beyin dibe (yaklaşık 3 gün) inene kadar beyni 50 mL tüpte 100 mM PBS'de% 30 sakkarozun 40 mL'sine aktarın.
11. Snap, beyni metilbutanolde 2 dakika - 80 ° C'de dondurun.
12. Beyin dokusunu -20 °C kriyostat içindeki metal bir platformda sabitleyin.
13. Kriyostat kullanarak 50 μm kalınlığında koronal bölümleri kesin.
14. Beyin dilimlerini ince bir fırça ile cam slaytlara aktarın.
15. Bölümleri 0,3 mL antifad orta ve kapak 22 mm 50 mm kapaklı monte edin.
16. Cam kaydıraları kuruyana kadar oda sıcaklığında karanlıkta tutun.
17. Hedeflenen nöronları, beyin bölgesi sınırlarına ve nöronların morfolojik özelliklerine göre Z yığını kullanarak konfokal mikroskopla görüntüleyin.
    NOT: Kullanılan konfokal mikroskop ayarları: 60 X (A/1.4, yağ) büyütme ve 488 nm dalga boyu kullanılarak 0.15 μm Z düzlemi aralığı (iğne deliği boyutu 30 μm; geri yansıtılmış iğne deliği yarıçapı 167 nm).

Sonuçlar

Şartlandırılmış ortam, EcoHIV-EGFP enfekte 293FT hücrelerinin lentivirüslerinden toplanmıştır. Daha sonra konsantre edildi ve titretildi, daha sonra stereotaksik olarak F344/N sıçanlarının beynine (kortikal bölge) enjekte edildi. Enjeksiyondan yedi gün sonra sıçanlar kurban edildi ve bregma 5.64 mm'den bregma -4.68 mm'ye kadar değişen koronal beyin dilimlerinden görüntüler alındı. Şekil 1A'da, beyinde, özellikle korteks ve hipokampal dentat girusunda önemli EcoHIV...

Tartışmalar

Bu protokolde sıçanlarda EcoHIV kaynaklı HIV enfeksiyon modeli oluşturduk. Özellikle, enjeksiyondan 7 gün sonra sıçan beyninde aktif HIV enfeksiyonunu başarıyla indükleyen kortekse bilateral stereotaksik ecohiv enjeksiyonu tanımladık. Ayrıca, sıçanlarda EcoHIV enfeksiyonunun HAND'in temel yönlerini incelemek için iyi bir biyolojik sistem olabileceğini gösteriyoruz. Sekiz hafta sonra- EcoHIV enfeksiyonu, sıçanlar NAc MSN'lerinde zamansal işleme ve sinaptik disfonksiyondaki değişiklikleri içeren ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	ThermoFisher Scientific	R70007
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap	Life Technologies	354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Life Technologies	10013CV
Cover glass	VWR	637-137
drill
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Life Technologies	22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2	Med Vet International	VCP422H
Hamilton syringe	Hamilton	1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technologies	L3000015
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit	Cell Biolabs, inc.	VPK-107-5
Lenti-X Concentrator	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 900
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086