Un modello di ratto di infezione cerebrale EcoHIV

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un nuovo modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV), che è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello e offrire un sistema per studiare i disturbi neurocognitivi associati all'HIV e le comorbilità associate (cioè l'abuso di droghe).

Abstract

È stato ben studiato che il modello di topo infetto EcoHIV è di notevole utilità nello studio delle complicanze neurologiche associate all'HIV. L'istituzione del modello di ratto infetto EcoHIV per studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi sarebbe utile nello studio dei disturbi neurocognitivi associati al neuroHIV e all'HIV-1 (HAND). Nel presente studio, dimostriamo la creazione di successo di un modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV). In primo luogo, il costrutto lentivirale di EcoHIV è stato confezionato in celle colturate da 293 FT per 48 ore. Quindi, il mezzo condizionale è stato concentrato e piastrellato. Successivamente, abbiamo eseguito iniezioni stereotassiche bilaterali dell'EcoHIV-EGFP nel tessuto cerebrale del ratto F344/ N. Una settimana dopo l'infezione, sono stati rilevati segnali di fluorescenza EGFP nel tessuto cerebrale infetto, indicando che EcoHIV induce con successo un'infezione attiva da HIV nei ratti. Inoltre, è stata eseguita l'immunostaining per il marcatore cellulare microgliale, Iba1. I risultati indicavano che le microglia erano il tipo di cellula predominante che ospitava EcoHIV. Inoltre, i ratti EcoHIV hanno mostrato alterazioni nell'elaborazione temporale, un potenziale meccanismo neurocomportamentale sottostante della MANO e disfunzione sinaptica otto settimane dopo l'infezione. Collettivamente, il presente studio estende il modello EcoHIV dell'infezione da HIV-1 al ratto offrendo un prezioso sistema biologico per studiare i serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello, nonché la MANO e le comorbilità associate come l'abuso di droghe.

Introduzione

I sistemi biologici hanno migliorato la nostra comprensione dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV-1 (HAND) e dei loro meccanismi neurali sottostanti². La determinazione del sistema biologico più appropriato per un dato studio dipende spesso dalla questione dell'interesse². La limitazione della gamma di modelli animali ospiti sfida gli studi sullo sviluppo della malattia dell'HIV-1. Per indagare la replicazione virale e la patogenesi dell'HIV-1, Potash et^al. Dopo iniezioni di vene della coda nei topi dell'HIV chimerico (EcoHIV), sono state osservate molte caratteristiche simili a quelle degli individui sieropositivi HIV-1 (ad esempio linfociti infetti e macrofagi, mirati per risposte immunitarie antivirali e^{infiammazione 3,5,6}).

Sebbene topi e ratti siano entrambi membri dei Muridae, le differenze fondamentali delle specie possono influenzare la loro idoneità per specifiche domande sperimentali⁷. Pertanto, l'estensione del modello di infezione EcoHIV ai ratti (comunemente usato negli studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi) sarebbe vantaggiosa nello studio del neuroHIV. Ad esempio, le loro dimensioni maggiori rendono più pratico l'impianto giugulare del catetere per le procedure di auto-somministrazione^{dei farmaci 8}. Le tecniche di auto-somministrazione dei farmaci nei ratti sono state utilizzate per valutare la motivazione nell'HIV-1⁹. Inoltre, molti compiti neurocognitivi / comportamentali sono stati inizialmente progettati per i ratti¹⁰. Qui, segnalamo l'utilizzo di iniezioni stereotassiche di EcoHIV nei ratti per estendere il modello di infezione EcoHIV e offrire un'opportunità chiave per affrontare nuove domande relative al neuroHIV e alla MANO.

Protocollo

Tutti i protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Sud (numero di garanzia federale: D16-00028). Sei ratti adulti F344/N maschi sono stati alloggiati in un ambiente controllato sotto una luce 12/12: ciclo scuro con accesso ad libitum a cibo e acqua. Tutti gli animali sono stati curati utilizzando le linee guida stabilite dagli Istituti Nazionali di Sanità nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Confezionamento di virus in 293 cellule FT

1. Coltura delle 293 celle FT (5×10⁵/mL) in gelatina rivestita 75 cm² fiasche con DMEM più 10% FBS¹¹. Far crescere le cellule a 37 °C per essere confluenti al 50% alla trasfezione.
2. Diluire 22,5 μL di reagente di trasfezione (ad esempio Lipofectamina 3000) in 750 μL di mezzo (ad esempio Opti-MEM) in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml e vortice per 3 s.
3. Diluire 20 μg di DNA plasmide EcoHIV in 750 μL di mezzo in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml e mescolare bene.
4. Aggiungere il DNA diluito nel tubo del reagente di trasfezione diluito e mescolare delicatamente. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
5. Aggiungere la miscela a 10 ml di mezzo DMEM prebellico in pallone da 75 cm^2. Incubare le cellule per 2 giorni a 37 °C.
6. Raccogliere e combinare 24 mL di mezzo condizionale dai due contenitori che includono il lentivirus confezionato.
7. Centrifuga tutti i 24 mL di mezzo condizionale a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il supernatante chiarificato in un tubo sterile da 50 ml.
8. Unire 8 mL di concentratore Lenti-x con 24 mL di supernatante chiarificato (rapporto 1:3). Mescolare con un'inversione delicata. Incubare la miscela a 4 °C per due giorni.
9. Miscela di centrifuga a 1.500 x g per 45 minuti a 4 °C. Rimuovere con cura il supernatante.
10. Sospendere delicatamente il pellet con 100 μL di PBS da 100 mM.
11. Concentrazione di virus titer con un kit ELISA p24.

2. Interventi stereotassici del virus EcoHIV-EGFP

1. Anestetizzare i ratti usando il 3% di sevoflurane. Procedere al passaggio 2.2 quando i ratti non rispondono a stimoli e riflessi noxious sono assenti.
2. Radere i peli dalla regione cerebrale e sterilizzare la pelle due volte con il 70% di etanolo e uno scrub a base di clorexidina. Fissare il ratto in una posizione soggetta all'apparato stereotassico.
3. Fare un'incisione (5-6 cm) attraverso la pelle lungo la linea mediana del cuoio capelluto.
4. Contrassegnare due posizioni di foratura a 0,8 mm lateralmente, 1,2 mm da rostrale a bregma. Praticare un foro (diametro 0,4 mm) in ogni posizione del cranio.
5. Riempire la soluzione di lentivirus EcoHIV titered (1,04 × 10⁶ TU/mL) in una siringa per iniezione da 10 μL. Fissare la siringa all'apparato stereotassico.
6. Spostare verso il basso l'ago vicino alla superficie del foro di perforazione. Misurare e spostare 2,5 mm di profondità.
7. Infondere 1 μL di soluzione virale ad una velocità di 0,2 μL/min. Tenere l'ago all'interno dell'area di iniezione per 5 minuti. Spostare lentamente l'ago verso l'alto fino a quando non è al di fuori del cranio del topo.
8. Sutura la pelle con un filo di seta 4-0.
9. Sterilizzare l'incisione con il 70% di etanolo una volta. Iniettare per via sottocutanea butorfenolo (Dorolex, 0,1 mg/kg di peso corporeo).
10. Trasferire il topo in una camera di recupero con una pastiglia riscaldante fino a quando non si sveglia.

3. Visualizzazione delle sezioni cerebrali

NOTA: Attendere da una a otto settimane dopo l'infusione virale ecoHIV.

1. Anestetizzare il topo con il 5% di sevoflurane. Continuare al passaggio 3.2 quando i ratti non rispondono a stimoli e riflessi noxious sono assenti.
2. Fissare il topo in posizione supina all'interno di una cappa aspirante.
3. Incidere la pelle lungo la linea mediana toracica. Tagliare il diaframma e aprire la cavità toracica.
4. Inserire un ago da 20 G × da 25 mm nel ventricolo sinistro.
5. Aprire immediatamente l'atrio destro con le forbici.
6. Perfondere 50 mL di PBS prechilled da 100 mM ad una velocità di 5 mL/min.
7. Perfondere 100 mL di paraformaldeide fredda al 4% ad una velocità di 5 mL/min.
8. Decapitare il topo, aprire il cuoio capelluto e rimuovere il cervello.
9. Postfisso durante la notte con paraformaldeide al 4%.
10. Trasferire il cervello a 40 ml di saccarosio al 30% in PBS da 100 mM in tubo da 50 ml fino a quando il cervello galleggia verso il basso (circa 3 giorni).
11. Snap congelare il cervello nel metilbutanolo per 2 minuti a - 80 °C.
12. Fissare il tessuto cerebrale su una piattaforma metallica all'interno di un criostato a -20 °C.
13. Tagliare sezioni coronali spesse 50 μm usando il criostato.
14. Trasferire le fette cerebrali su vetrini con un pennello fine.
15. Sezioni di montaggio in 0,3 mL di mezzo antifadio e coperchio con copripasci da 22 mm e 50 mm.
16. Tenere gli scivoli di vetro al buio a temperatura ambiente fino ad asciugare.
17. Immagini i neuroni mirati con un microscopio confocale usando z-stack basato sui confini della regione cerebrale e sulle caratteristiche morfologiche dei neuroni.
    NOTA: Le impostazioni del microscopio confocale utilizzate erano: ingrandimento di 60 X (A/1.4, olio) e un intervallo piano Z di 0,15 μm (dimensione del foro stenopeico 30 μm; raggio del foro stenopeico retroprodato di 167 nm) utilizzando una lunghezza d'onda di 488 nm.

Risultati

Il mezzo condizionato è stato raccolto dal lentivirus delle cellule 293FT infettate da EcoHIV-EGFP. Successivamente, è stato concentrato e titerato, quindi iniettato stereotassicamente nel cervello (regione corticale) dei ratti F344 / N. Sette giorni dopo l'iniezione, i ratti sono stati sacrificati e le immagini sono state prese da fette cerebrali coronali che vanno dal bregma 5,64 mm al bregma -4,68 mm. Nella figura 1A, ci sono significativi segnali EcoHIV-EGFP in tutto il cervello, speci...

Discussione

In questo protocollo, abbiamo stabilito un modello di infezione da HIV indotto da EcoHIV nei ratti. In particolare, abbiamo descritto un'iniezione stereotassica bilaterale di EcoHIV nella corteccia che ha indotto con successo l'infezione attiva da HIV nel cervello del ratto 7 giorni dopo l'iniezione. Inoltre, dimostriamo che l'infezione da EcoHIV nei ratti potrebbe essere un buon sistema biologico per studiare gli aspetti chiave della MANO. Otto settimane dopo l'infezione da EcoHIV, i ratti hanno mostrato significativi d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	ThermoFisher Scientific	R70007
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap	Life Technologies	354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Life Technologies	10013CV
Cover glass	VWR	637-137
drill
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Life Technologies	22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2	Med Vet International	VCP422H
Hamilton syringe	Hamilton	1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technologies	L3000015
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit	Cell Biolabs, inc.	VPK-107-5
Lenti-X Concentrator	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Life Technologies	11058021
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Sevoflurane	Merritt Veterinary Supply	347075
stereotaxic apparatus	Kopf Instruments	Model 900
SuperFrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-154%
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086