JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، يتم تقديم بروتوكول لعزل وترانسفيكت القزحية الأولية والخلايا الظهارية صبغة الشبكية من الثدييات المختلفة (الفئران والجرذ والأرنب والخنازير والأبقار). هذه الطريقة مناسبة بشكل مثالي لدراسة نهج العلاج الجيني البصري في مختلف ال تشكيلات لتحليلات الجسم الحي السابق وفي دراسات الجسم الحي القابلة للنقل إلى البشر.

Abstract

الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو السبب الأكثر شيوعا للعمى لدى المرضى >60 عاما ، مما يؤثر على ~ 30 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. AMD هو مرض متعدد العوامل يتأثر بالعوامل البيئية والجينية ، مما يؤدي إلى ضعف وظيفي في شبكية العين بسبب انحطاط الخلايا الظهارية صبغة الشبكية (RPE) يليه تدهور المستقبل الضوئي. ومن شأن العلاج المثالي أن تشمل زرع خلايا RPE صحية تفرز العوامل العصبية لمنع موت الخلية RPE وانحطاط مستقبلات ضوئية. نظرا لأوجه التشابه الوظيفية والوراثية وإمكانية أخذ خزعة أقل توغلا ، تم اقتراح زرع خلايا ظهارية صبغة القزحية (IPE) كبديل ل RPE المنحطة. يمكن تحقيق إفراز العوامل العصبية الوقائية من خلال عدد قليل من الخلايا المزروعة تحت الشبكية عن طريق الجمال النائم (SB100X)transposon بوساطة transfection مع ترميز الجينات لعامل الظهارة المشتق من الصباغ (PEDF) و / أو عامل تحفيز مستعمرة الضامة الحبيبية (GM-CSF). أنشأنا العزلة والثقافة، وSB100X-بوساطة transfection من خلايا RPE و IPE من مختلف الأنواع بما في ذلك القوارض والخنازير والماشية. يتم استئصال الكرة الأرضية وإزالة القرنية والعدسة للوصول إلى القزحية والشبكية. باستخدام ملعقة مصنوعة خصيصا، تتم إزالة خلايا IPE من القزحية المعزولة. لحصاد خلايا RPE، قد تكون هناك حاجة إلى حضانة التريبسين، اعتمادا على الأنواع. ثم، باستخدام ملعقة مخصصة RPE، يتم تعليق الخلايا في المتوسط. بعد البذر ، يتم مراقبة الخلايا مرتين في الأسبوع ، وبعد الوصول إلى التقاء ، يتم تحويلها عن طريق الكهرومporation. تم تأكيد التكامل الجيني والتعبير وإفراز البروتين والوظيفة من قبل qPCR وWB و ELISA و immunofluorescence والمقايسات الوظيفية. اعتمادا على هذا النوع، يمكن عزل 30،000-5 مليون (RPE) و 10،000-1.5 مليون (IPE) الخلايا لكل عين. تظهر الخلايا المعدلة وراثيا فرط التعبير الكبير PEDF/GM-CSF مع القدرة على تقليل الإجهاد التأكسدي وتوفر نظاما مرنا لتحليلات الجسم الحي السابق وفي دراسات الجسم الحي القابلة للنقل إلى البشر لتطوير نهج العلاج الجيني البصري.

Introduction

تركز مجموعتنا على تطوير أساليب تجديدية لعلاج الانحطاط العصبي الشبكي ، أي AMD ، من خلال العلاج الجيني غير الفيروسي القائم على RPE و IPE. إن إنشاء هذه العلاجات قبل السريرية يستلزم نماذج في المختبر قابلة للنقل إلى البشر. وبالتالي، فإن الهدف من الدراسة المعروضة هنا هو تقديم بروتوكولات لعزل الخلايا الأولية RPE و IPE وثقافتها وهندستها الوراثية. والأساس المنطقي لإنشاء عزل خلايا ال PE عن أنواع متعددة هو التأكيد بقوة على سلامة وكفاءة النهج وزيادة قابليته للاستنساخ والنقل. يختلف خط الخلية البشرية المتاحة ARPE-19 عن الخلايا الأولية (على سبيل المثال، فهي أقل صبغة) وبالتالي، فهي ذات قيمة محدودة فقط للتحليلات ما قبل السريرية1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن شراء خلايا الثدييات غير البشرية بتكلفة أقل وبكميات أكبر؛ يمكن الحصول على الأنسجة المانحة الإنسان من مختلف البنوك العين، ولكن توافر محدودة ومكلفة. وأخيرا، يجب تطبيق المنتجات الطبية الجديدة للعلاج المتقدم (ATMP، أي الخلايا أو الأنسجة أو المنتجات الطبية للعلاج الجيني) في نوعين مختلفين على الأقل قبل اختبارها في المرضى، وهذه الدراسات في الجسم الحي تطلب إعداد عمليات زرع الخلايا المسببة للحساسية.

أمراض الشبكية العصبية هي السبب الرئيسي للعمى في البلدان الصناعية، والتي تشمل الأمراض الشائعة مثل AMD، فضلا عن أمراض نادرة مثل التهاب الشبكية الصباغي، الذي يؤدي موت خلايا الشبكية في نهاية المطاف إلى العمى. يمكن إبطاء خلايا RPE ، المستقبل الضوئي ، وخلايا العقدة الشبكية (RGC) في بعض الحالات ، ولكن لا توجد حاليا علاجات علاجية متاحة. توفر أجهزة الصراف الآلي إمكانية تصحيح العيوب الجينية أو دمج الجينات العلاجية أو استبدال الخلايا المنحطة ، وبالتالي تمكين تطوير علاجات تجديدية وعلاجية لأمراض مثل AMD ؛ 13 العلاجات الجينية حصلت بالفعل على موافقة التسويق بما في ذلك العلاج لعلاج RPE65 الطفرات المرتبطة انحطاط الشبكية2,3. بين كبار السن (>60 سنة)، ~ 30 مليون شخص في جميع أنحاء العالم تتأثر إما الأوعية الدموية الجديدة (nvAMD) أو الأوعية الدموية (AAMD) AMD4. يتم تحريض كلا الشكلين من قبل مشغلات المرتبطة بالعمر بما في ذلك الضرر التأكسدي، وضعف وظيفة وفقدان خلايا RPE تليها تدهور مستقبلات ضوئية، من بين أمور أخرى (مثل أليليس الخطر الوراثي، والتدخين، وارتفاع ضغط الدم)5،6. في nvAMD ، يتفاقم الإمراض بسبب عدم توازن العوامل الوعائية والمضاادة للأوعية الدموية لصالح عامل النمو البطاني الوعائي الوعائي (VEGF) الذي يحفز الأوعية الدموية الجديدة المشيمية (CNV). حتى الآن، nvAMD فقط يمكن علاجها عن طريق الحقن الشهري داخلفيتريال من مثبطات البروتين VEGF لقمع CNV. لا يوجد علاج فعال متاح حتى الآن لAMD6،7.

قيمت العديد من الدراسات العلاجات القائمة على الخلايا لتحل محل العلاج المضاد ل VEGF: أظهرت الدراسات التي أجراها Binder وآخرون ، والتي تم فيها زرع خلايا RPE ذاتية الحصاد الطازجة في المرضى الذين يعانون من nAMD8و9و10، تحسنا بصريا معتدلا ، ولكن مجموعة صغيرة فقط من المرضى وصلوا إلى حدة بصرية نهائية عالية بما يكفي لتمكين القراءة. في الآونة الأخيرة، استخدمت دراسة سريرية المرحلة الأولى التصحيح RPE المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية لعلاج AMD مع نتائج واعدة. أي فعالية واستقرار وسلامة تصحيح RPE لمدة تصل إلى 12 شهرا في 2 من المرضى العشرة الذين عولجوا11. بالإضافة إلى ذلك، نشرت عدة مجموعات دراسات تم فيها حصاد بقع الغشاء المشيمي الذاتية RPE-Bruch من شبكية العين الطرفية وزرعها في البقعة12و13و14؛ والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المستمدة من بقع RPE تم إنشاؤها لزرع15. بالنسبة ل aAMD ، تم اختبار الأجسام المضادة التي تستهدف المسار التكميلي في التجارب السريرية6و16 ودراسة المرحلة الأولى باستخدام حقنة واحدة داخل الجسم لنواقل فيروسية مرتبطة بالأدينو (AAV) ترميز الجين لعامل CD59 (AAVCAGsCD59) في المرضى الذين يعانون من ضمور جغرافي (GA) تم الانتهاءمن 17؛ بدأت دراسة المرحلة الثانية مؤخرا وتهدف إلى توظيف 132 مريضا يعانون من AAMD المتقدمة وتقييم النتيجة في 2 سنوات بعد التدخل18. وأخيرا، بدأت مجموعة دراسة فوكوس المرحلة الأولى / الثانية تجربة سريرية متعددة المراكز تقييم سلامة واستجابة الجرعة وفعالية ناقلات AAV غير المستنسخة المؤتلف ترميز عامل مكمل الإنسان19.

في المقام الأول ، فإن الهدف من العلاج AMD التجديدي هو زرع خلايا RPE الوظيفية ، والتي تضررت أو فقدت. ومع ذلك، تشترك خلايا IPE و RPE في العديد من أوجه التشابه الوظيفية والوراثية (على سبيل المثال، البلعوس واستقلاب الريتينول)، ولأن خلايا IPE يتم حصادها بشكل أكثر جدوى، فقد تم اقتراحها كبديل RPE20. على الرغم من أنه قد ثبت سابقا أن زرع الخلية IPE يؤخر انحطاط مستقبلات ضوئية في النماذج الحيوانية21،22 ويستقر الوظيفة البصرية في المرضى الذين يعانون من nvAMD المرحلة النهائية ، لم يلاحظ أي تحسن كبير في هؤلاء المرضى23. قد يكون عدم فعالية بسبب انخفاض عدد الخلايا المزروعة، و / أو عدم توازن العوامل العصبية الوقائية الشبكية. وثمة نهج بديل هو زرع الخلايا الظهارية الصباغية المصابة التي تفرط في التعبير عن العوامل العصبية لاستعادة التوازن الشبكي، والحفاظ على خلايا RPE المتبقية، وحماية المستقبلات الضوئية وRGCs من الانحطاط. وبالتالي، نقترح علاجا جديدا يتضمن زرع خلايا RPE أو IPE الوظيفية التي خضعت للهندسة الوراثية لإفراز البروتينات العصبية المضادة للأعائيات، مثل PEDF أو GM-CSF أو عوامل النمو الشبيهة بالإنسولين (IGFs). ميزة تطوير وتحليل هذا النهج في عدة أنواع بدلا من استخدام خط الخلية، نوع واحد فقط، أو الأنسجة البشرية هي: 1) زيادة استنساخ ونقل النتائج كما هو مبين في العديد من الدراسات التي تحققت في مختبرات مستقلة والأنواع المختلفة1،24،25؛ 2) خلايا الخنازير أو الأبقار هي عمليا المتاح دون التضحية من الحيوانات إضافية؛ 3) توافر خلايا الخنازير والأبقار خاصة يسمح سلسلة اختبار كبيرة لتحقيق نتائج قوية؛ 4) المعرفة لعزل وزراعة وتعديل وراثيا الخلايا من النماذج المستخدمة في الغالب تمكن في تحليلات الجسم الحي في أنواع متعددة24،25،26 ، وبالتالي يقدم نسبة محسنة من المخاطر إلى الفائدة للمرضى الذين عولجوا لأول مرة ؛ 5) مرونة البروتوكول المقدم يسمح استخدامه في مختلف النماذج والتجريبية انشاءات وجميع العلاجات القائمة على الخلايا العينية مع وبدون الهندسة الوراثية. وعلى النقيض من ذلك، فإن التقنيات البديلة كخطوط خلايا أو أنسجة بشرية ليست سوى قدرة محدودة على النقل و/أو قابلية محدودة للتخلص منها. خطوط الخلية مثل ARPE-19 مثالية للتجارب الأولية. ومع ذلك، تصبغ منخفض وانتشار عالية تختلف اختلافا كبيرا عن الخلايا الأولية1. وتوفر خلايا RPE و IPE، المعزولة عن الأنسجة المانحة البشرية، مصدرا ثمينا للتجارب المختبرية القابلة للتحويل؛ ومع ذلك، نحصل على الأنسجة البشرية من بنك العيون الأمريكي الأمريكي مما يعني أن عمر الأنسجة لا يقل عن يومين (بعد التلقيح) ويتطلب نقلا طويلا ومكلفا، ولكن الأنسجة المانحة المحلية غير متوفرة بكميات كافية لإجراء بحث منتج. يتم تأكيد ميزة استخدام الخلايا الأولية من خلال دراسات متعددة من مجموعات أخرى27،28.

لتطوير العلاج الجيني غير الفيروسي القائم على الخلية باستخدام نظام SB100X transposon لتجريب الخلايا الأولية RPE و IPE مع ترميز الجينات لPEDF و / أو GM-CSF لعلاج nvAMD وamD ، على التوالي29،30،31،32، أنشأنا لأول مرة العدوى من خلايا ARPE-191 . وبعد ذلك، تم وضع بروتوكولات العزل والإصابة في الخلايا الأولية للأبقار والبورسين التي يمكن الوصول إليها بسهولة. الآن، تم إنشاء عزل وتوريث خلايا RPE و IPE الأولية من خمسة أنواع مختلفة، من الصغيرة (كفأر) إلى الثدييات الكبيرة (كالماشية). تم تأكيد ذلك في خلايا RPE و IPE الأولية المشتقة من عيون المتبرعين البشريين30. تم التحقق من صحة الإنتاج المتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) من ATMP باستخدام الأنسجة المانحة البشرية وكذلك33. وأخيرا، تم تقييم سلامة وكفاءة النهج في الجسم الحي في ثلاثة أنواع مختلفة تم تكييف البروتوكول لها: الفأر والفأر والأرنب. في الإعداد السريري ، سيتم حصاد خزعة القزحية من المريض وسيتم عزل خلايا IPE وترجمتها في الغرفة النظيفة ، قبل أن يتم زرع الخلايا دون المستوى مرة أخرى إلى نفس المريض. وستجري العملية بأكملها خلال جلسة جراحية واحدة تستغرق حوالي 60 دقيقة. تطلب تطوير نهج العلاج وتقييم كفاءته نماذج ممتازة في المختبر وفيفو السابق لتنفيذ طرق توصيل الجينات القوية والفعالة ، لتحليل كفاءة تسليم الجينات وإنتاج البروتين العلاجي والآثار العصبية ، وإنتاج عمليات زرع الخلايا لاختبار النهج في الجسم الحي1،24،25،29،30 . ومن الجدير بالذكر أن العلاج لديه الموافقة الأخلاقية على تجربة المرحلة السريرية Ib/IIa من اللجنة الأخلاقية لأبحاث كانتون جنيف (رقم 2019-00250) ويتم حاليا جمع آخر بيانات ما قبل السريرية المطلوبة للحصول على إذن من السلطات التنظيمية السويسرية باستخدام البروتوكول المقدم. في هذا الصدد، أظهرت بيانات ما قبل السريرية في الجسم الحي انخفاضا كبيرا في CNV وسلامة ممتازة24،25،31.

هنا ، يتم وصف عزل وثقافة خلايا RPE / IPE من الأبقار والخنازير والأرنب والفأر والفأر ، واستخدام نظام الإرسال والاستقبال SB100X التكاملي جنبا إلى جنب مع الكهربوجين كوسيلة فعالة لتسليم الجينات. وعلى وجه الخصوص، تم تحويل خلايا PE الأولية إلى فرط التعبير عن PEDF و GM-CSF. جمع هذه البروتوكولات تمكن من إجراء الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي في جميع مراحل ما قبل السريرية من تطوير ATMP. وعلاوة على ذلك، فإن الإعداد لديه القدرة على التكيف مع الجينات الأخرى ذات الاهتمام والأمراض.

Protocol

وقد نفذ البروتوكولات التي شاركت فيها الحيوانات أفراد معتمدون وبعد إذن من إدارة المقاطعة الكانتونية في جنيف، سويسرا، ووفقا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في بحوث العيون والرؤية (الموافقة رقم). جنرال إلكتريك/94/17). الكبار صحية الفئران براون النرويج, C57BL/6 الفئران, والأرانب البيضاء نيوزيلندا تم القتل الرحيم بجرعة زائدة من Pentobarbital (150 ملغ/كغ) المخفف في 0.9٪ NaCl حقن داخل الصفاق والعيون كانت متعلمة مباشرة بعد التضحية. تم الحصول على عيون البورسين والأبقار من مسلخ محلي في غضون 6 ساعات من التضحية وتم نقلها إلى المختبر على الجليد.

1. قبل التحضير

  1. إعداد المتوسطة كاملة (DMEM / هام F12 تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 80 U/ مل البنسلين / 80 ميكروغرام / مل العقديبتومايسين، و 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B). سخني المتوسط، 1x PBS، و0.25٪ تريبسين (إذا لزم الأمر) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. وضع الستائر العقيمة في غطاء محرك السيارة لإعداد مكان عمل مطهر. إدخال جميع الأدوات والمواد العقيمة اللازمة داخل غطاء محرك السيارة.
    ملاحظة: فقط تجميل العينين وتنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد هي الإجراءات التي تتم خارج غطاء محرك السيارة، يجب تنفيذ بقية الخطوات داخل غطاء محرك السيارة.

2. عزل خلايا الفئران / الماوس PE

  1. استخدام مقص منحني والملقط Colibri لتعميم العينين بعد القتل الرحيم الحيوان. تنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد من العينين باستخدام مقص والملقط (غير معقمة).
    ملاحظة: حجم المقص والملقط المستخدمة لمساعدة وتنظيف العينين يعتمد على الأنواع (على سبيل المثال، للفئران والفأر الصكوك ستكون أصغر من تلك المستخدمة للخنازير والماشية) (انظر الشكل S1).
    1. جمع العينين في أنبوب 50 مل مليئة برنامج تلفزيوني غير معقم ونقل أنبوب إلى غطاء محرك السيارة تدفق صفح. تطهير العينين عن طريق الغمر لمدة 2 دقيقة في محلول اليود القائم، ثم نقلها إلى طبق بيتري مليئة برنامج تلفزيوني عقيمة.
  2. فتح المصباح
    1. بعد نقل العينين إلى طبق بيتري معقم ، أمسك واحدة قريبة بشدة من العصب البصري مع Colibri أو ملقط مدبب. لكمة حفرة بالقرب من الحد الأقصى للقزحية (بين بارس بلانكا وأورا سيراتا) مع إبرة 18 G. أدخل مقص صغير في الحفرة وقطع حول القزحية. إزالة الجزء الأمامي (القرنية والعدسة والقزحية) ووضعها في طبق بيتري. اترك المصباح مع الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE.
  3. عزل خلايا IPE
    1. إزالة العدسة ومع ملقط غرامة سحب بدقة القزحية التي تحتوي على خلايا IPE. ضع القزحية في طبق بيتري، اغسلها مع برنامج تلفزيوني معقم واتركها في PBS حتى يتم إعداد المزيد من القزحية.
    2. كرر الخطوات 2.2.1 إلى 2.3.1 لجميع العيون لتكون مستعدة في ذلك اليوم.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين لكل قزحية واحتضن لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية. إزالة التريبسين، إضافة 150 ميكرولتر من المتوسطة كاملة لكل قزحية وكشط IPE بدقة مع ماصة باستور مسطحة مصقول النار؛ استخدام ملقط ناعم لشل الأنسجة. جمع تعليق الخلية ووضعها في أنبوب 1.5 مل. استخدام 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المخفف 1:3 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور34،35.
    4. إذا لم يتم تحويلها على الفور، البذور 200،000 خلية / جيدا في لوحة 24 جيدا (100،000 خلية / سم2) في 1 مل من المتوسطة كاملة (10٪ FBS) (للبذر انظر الجدول 1). ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري تجميع عدة عيون معا للحصول على خلايا كافية للبذر.
  4. عزل خلايا RPE
    1. إزالة الفكاهة الزجاجية وشبكية العين من الجزء الخلفي مع ملقط رقيقة. تجنب إتلاف ظهارة صبغة الشبكية.
    2. قطع الجزء إلى النصف مع مشرط # 10 أن يكون العالم مفتوحة تماما وغسل مع برنامج تلفزيوني عقيمة.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين لكل عين واحتضان لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية. إزالة التربسين وإضافة 150 ميكرولتر من المتوسطة كاملة في العالم وكشط خلايا RPE بدقة مع مشرط جولة; استخدام ملقط ناعم لشل الأنسجة. جمع تعليق الخلية ووضعها في أنبوب 1.5 مل. تأخذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية; تمييع 1:4 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    4. انظر الخطوة 2.3.4.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري تجميع عدة عيون معا للحصول على خلايا كافية للبذر.

3. عزل خلايا PE أرنب

  1. إجراء التنظيف والتطهير كما هو موضح في الخطوات 2.1 إلى 2.1.1.
  2. ضع عين واحدة على ضغط شاش معقم واحمله بقوة بالقرب من العصب البصري. فتح العين مع مشرط # 11 ومقص حوالي 2 ملم تحت الحويئض. إزالة الجزء الأمامي (القرنية والعدسة والقزحية) ووضعها في طبق بيتري. اترك المصباح مع الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE.
  3. عزل خلايا IPE
    1. تنفيذ الخطوة 2.3.1. إزالة الجسم السيلاري من القزحية عن طريق قطع مع مشرط # 10.
    2. بعد إعداد 2 قزحية، واحتضان مع 1 مل من 0.25 ٪ تريبسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. خلال هذا الوقت، يمكن عزل خلايا RPE (راجع الخطوة 3.4). إزالة التريبسين وإضافة 1 مل متوسطة كاملة إلى القزحية وعزل الخلايا عن طريق الخدش بعناية مع ماصة باستور مسطحة مصقول النار. إعادة تشغيل الخلايا بعناية عن طريق الأنابيب ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 1:3 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    3. انظر الخطوة 2.3.4.
  4. عزل خلايا RPE
    1. تنفيذ الخطوة 2.4.1.
    2. وضع شاش معقم في لوحة بئر 12 ووضع لمبة على الشاش.
    3. غسل مع برنامج تلفزيوني وتنفيذ الخطوة 2.4.3.
      ملاحظة: استخدام ماصة باستور مصقول النار المنحني.
    4. الطرد المركزي الخلايا 10 دقيقة في 120 × ز.
    5. انظر الخطوة 2.3.4.

4. عزل خلايا PE الخنزير

  1. قم بالتنظيف كما هو موضح في الخطوة 2.1. غسل مع برنامج تلفزيوني وتطهير العينين عن طريق الغمر لمدة 2 دقيقة في محلول اليود القائم، شطف مع برنامج تلفزيوني. تابع الخطوة 3.2.
  2. عزل خلايا IPE
    1. تنفيذ الخطوة 3.3.1. بعد إعداد 2 قزحية، إضافة 1 مل من المتوسطة كاملة وعزل الخلايا عن طريق الخدش بعناية مع شقة النار مصقول باستور ماصة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 1:4 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    2. انظر الخطوة 2.3.4.
  3. عزل خلايا RPE
    1. تنفيذ الخطوة 2.4.1. ضع المصباح في طبق بيتري واغسله مع PBS. ملء المصباح مع 1 مل متوسطة كاملة.
    2. باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار، قم بإزالة خلايا RPE بعناية. تأكد من كشط من أسفل إلى أعلى لتجنب الانزلاق إلى أسفل من مجمع غشاء المشيمي-Bruch. جمع تعليق الخلية داخل لمبة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل لإعادة الإنفاق. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 1:8 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    3. انظر الخطوة 2.3.4.

5. عزل خلايا PE البقري

  1. قم بالتنظيف كما هو موضح في الخطوة 2.1. غسل مع برنامج تلفزيوني وتطهير العينين عن طريق الغمر لمدة 2 دقيقة في محلول اليود القائم، شطف مع برنامج تلفزيوني. تابع الخطوة 3.2.
  2. عزل خلايا IPE
    1. تنفيذ الخطوة 3.3.1. بعد إعداد اثنين من القزحية، واحتضان مع 2 مل من 0.25٪ تريبسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. خلال هذا الوقت، يمكن عزل خلايا RPE (راجع الخطوة 5.3).
    2. إزالة التريبسين وإضافة 2 مل متوسطة كاملة إلى القزحية وعزل الخلايا عن طريق الخدش بعناية مع ماصة باستور مسطحة مصقول النار. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل. الطرد المركزي الخلايا 10 دقيقة في 120 × ز. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 1:4 مع تريبان الأزرق لحساب الخلايا في غرفة نيوباور.
    3. إذا لم يتم تحويلها على الفور، البذور 320،000 الخلايا / جيدا في لوحة 6-جيدا في 3 مل من المتوسطة كاملة (10٪ FBS) (للبذر انظر الجدول 1). ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  3. عزل خلايا RPE
    1. اتبع الخطوة 2.4.1. ضع المصباح في طبق بيتري واغسله مع PBS. بعد إعداد 2 عيون ملء لمبة حوالي 3/4 مع تريبسين واحتضان لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية مع غطاء طبق بيتري على رأس لمبي.
    2. إزالة التريبسين وإضافة 1 مل متوسطة كاملة. تنفيذ الخطوة 4.3.2. الطرد المركزي الخلايا 10 دقيقة في 120 × ز.
    3. انظر الخطوة 5.2.3.

6. زراعة - تغيير متوسط

  1. ثقافة الخلايا في DMEM / هام F12، تكملها مع 10٪ FBS، 80 U/mL البنسلين / 80 ميكروغرام / مل ستريبتوميسين، و 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B، في 37 درجة مئوية و 5٪ثاني أكسيد الكربون في حاضنة رطبة. بعد 3-4 أيام ماصة صعودا وهبوطا لجمع الخلايا غير الملتصقة ووضع نصف حجم في بئر آخر. املأ ما يصل إلى 1 مل مع وسيط كامل.
    ملاحظة: يسمح هذا وجود سطح كبير بما يكفي لكافة الخلايا المعزولة إرفاق وتكبير الإخراج.
  2. بعد آخر 3-4 أيام تكرار جمع الخلية ولكن هذه المرة عن طريق تجميع الخلايا غير الملتصقة من بئرين في بئر واحد (على سبيل المثال، A1 + B1 في C1). إضافة متوسطة إلى جميع الآبار. مراقبة الخلايا وتغيير المتوسطة 2 مرات في الأسبوع (ل6 و 24-جيدا لوحات استخدام 3 و 1 مل / بئر، على التوالي). عندما تصل الخلايا إلى التقاء، قم بالتبديل إلى وسيط كامل مع 1٪ FBS أو استخدم الخلايا للتجارب (على سبيل المثال، العدوى).
    ملاحظة: خلايا RPE و IPE هي التقاء بعد 3-4، و 4-5 أسابيع بعد العزل، على التوالي. تم تأكيد نقاء ثقافة الخلية التحقق من مورفولوجيا الخلية (الخلايا المصطبغة) وعلامات محددة كما وصفها جونين وزملاؤه36.

7. الكهرومبوريشن من الخلايا PE الأولية

  1. تنفيذ الكهرومporation كما هو موضح قبل1،37.
  2. اعتمادا على عدد الخلايا المتحولة استخدام 6-, 24- أو 48-جيدا لوحات (انظر الجدول 2) لزرع الخلايا في المتوسط دون المضادات الحيوية أو مضادات المخدرات. للأسابيع التالية 2 إضافة قطرات مع المتوسطة التي تحتوي على البنسلين (80 U /mL), الستربتومايسين (80 ميكروغرام / مل), والأمفوتريسين B (2.5 ميكروغرام / مل) مرتين في الأسبوع. تبادل المتوسط تماما 2 أسابيع بعد transfection.
  3. لتحديد نمو الخلايا، وكفاءة العدوى، وإفراز البروتين، ومراقبة الخلايا أسبوعيا عن طريق المجهر وتحليل ثقافة الخلية supernatant بواسطة لطخة الغربية. قبل إنهاء الثقافة، واتخاذ 24 ح خلية الثقافة supernatant لقياس إفراز البروتين من قبل ELISA، عد الخلايا، وقياس الفلورسينس عن طريق قياس الخلايا القائمة على الصورة (في حالة الخلاياالزهرة -المصابة) بعد تعليمات المصنوعات (انظر جدول المواد)،وجمع بيليه الخلية لتحليل التعبير الجيني القائم على RT-qPCR.
    ملاحظة: لا يتم تضمين هذه الطرق في هذه الورقة لأنه ليس الغرض من شرح بالتفصيل تحليل الخلايا ولكن بدلا عزلها. كثافة بذر الخلايا هي نفسها بالنسبة لجميع الأنواع (100،000 خلية / سم2)ولكن لأن عدد الخلايا المعزولة يختلف ، تم استخدام لوحات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للفئران والجرذ والأرنب قد يكون من الضروري تجميع عيون 2-3 للحصول على خلايا كافية للبذر.
جنسعلاج التريبسينN° خلايا IPEN° خلايا RPEلوحة للبذر (100،000 خلية / سم2)
الماوس / الفئراننعم~50,000~150,00024 لوحة بئر
أرنبنعم~350,000~2,500,00024 لوحة بئر
خنزيرلا~1,000,000~3,000,00024 لوحة بئر
البقرينعم~1,700,000~5,000,0006 لوحات الآبار

الجدول 1: عدد خلايا ال PE الأولية المعزولة عن العيون من أنواع مختلفة.

اسممنطقةمتوسط الحجمتريبسينحجم المتوسطة لوقف عمل تريبسينكثافة البذر
6-لوحة جيدا9.6 سم²3.0 مل0.5 مل1.0 مل3x105
24-لوحة جيدا2.0 سم²1.0 مل0.2 مل0.8 مل5x104
48-لوحة جيدا1.1 سم²0.5 مل0.1 مل0.4 مل0.5-1x104

الجدول 2: أحجام زراعة الخلايا وكثافات البذر.

النتائج

عزل PE من أنواع الثدييات المختلفة
وباستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه، تم بنجاح عزل خلايا IPE وRPE واستزراعها من خمسة أنواع مختلفة. يعتمد عدد الخلايا التي يتم الحصول عليها من كل إجراء على نوع العين وحجمها (الجدول 1). كما هو مبين في الشكل 1، تظهر الخلايا مور...

Discussion

وجود طرق موحدة لعزل وزراعة خلايا PE أمر أساسي في تطوير نهج العلاج الجديدة للأمراض التنكسية الشبكية. مع البروتوكولات المعروضة هنا، يمكن عزل خلايا PE بنجاح من الأنواع المختلفة ومثقفة لفترات طويلة (حتى الآن، تم الحفاظ على أطول ثقافة لمدة 2 سنة1،38)؛ لوحظت نموذجية ...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

يستحق الشكر جريج سيلي وألان كونتي لمساعدتهما التقنية الممتازة. وقد دعمت المفوضية الأوروبية هذا العمل في سياق البرنامج الإطاري السابع، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم، ومؤسسة شميدر - بوريش. تلقى Z.I. التمويل من مجلس البحوث الأوروبي، ERC المتقدمة [ERC-2011-ADG 294742] وB.M.W. من منحة فولبرايت للبحوث ومنحة التميز الحكومية السويسرية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well platesCorning353043
24-well platesCorning353047
48-well platesThermoFisher Scientific150687
6-well plateGreiner7657160
BetadineMundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity AssayPromegaG9291
DMEM/Ham`s F12Sigma-AldrichD8062
Drape (sterile)Mölnlycke Health Care800530
Electroporation buffer 3P.143P Pharmaceutical
FBSBrunschwigP40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compressPROMEDICAL AG25403
NaCl (0.9%)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Needle (18G) TerumoTER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µLThermoFisher ScientificMPK1096
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000S
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Pasteur pipette (fire-polish)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
Petri dishThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Pastor et al., 2018
scarpel no. 10Swann-Morton501
scarpel no. 11Swann-Morton503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based CytometerThermoFisher ScientificT10796
Trypsin 0.25% ThermoFisher Scientific25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%Sigma-AldrichT4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

References

  1. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  2. Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
  3. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  4. Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  5. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  6. Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
  7. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  8. Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
  9. Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  10. Binder, S. . The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , 7985-7987 (2004).
  11. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
  12. Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
  13. Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
  14. Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
  17. Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  18. , . Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , (2020).
  19. Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  20. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
  21. Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
  22. Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
  23. Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
  24. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  25. Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
  26. Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , (2020).
  27. Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
  28. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  29. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  30. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
  31. Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
  32. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  33. Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  37. Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
  38. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
  39. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
  40. Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
  41. Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
  42. Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
  43. Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
  44. Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
  45. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  46. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  47. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 RPE IPE PEDF GM CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved