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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per isolare e trasfezionare le cellule epiteliali primarie dell'iride e del pigmento retinico da vari mammiferi (topi, ratti, conigli, suini e bovini). Il metodo è ideale per studiare approcci di terapia genica oculare in vari set-up per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo.

Abstract

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è la causa più frequente di cecità nei pazienti >60 anni, che colpisce circa 30 milioni di persone in tutto il mondo. L'AMD è una malattia multifattoriale influenzata da fattori ambientali e genetici, che portano a compromissione funzionale della retina a causa della degenerazione cellulare epiteliale pigmentata retinica (RPE) seguita dalla degradazione dei fotorecettori. Un trattamento ideale includerebbe il trapianto di cellule RPE sane che secernono fattori neuroprotettivi per prevenire la morte delle cellule RPE e la degenerazione dei fotorecettori. A causa delle somiglianze funzionali e genetiche e della possibilità di una biopsia meno invasiva, il trapianto di cellule epiteliali pigmentate dell'iride (IPE) è stato proposto come sostituto dell'RPE degenerato. La secrezione di fattori neuroprotettivi da parte di un basso numero di cellule trapiantate subretinamente può essere ottenuta mediante trasfezione mediata da trasposoni(SB100X)con geni che codificano per il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) e / o il fattore stimolante le colonie di macrofagi dei granulociti (GM-CSF). Abbiamo stabilito l'isolamento, la coltura e la trasfezione mediata da SB100Xdi cellule RPE e IPE di varie specie tra cui roditori, maiali e bovini. I globi vengono espiantati e la cornea e la lente vengono rimosse per accedere all'iride e alla retina. Utilizzando una spatola su misura, le celle IPE vengono rimosse dall'iride isolata. Per raccogliere le cellule RPE, può essere necessaria un'incubazione di tripsina, a seconda della specie. Quindi, utilizzando la spatola personalizzata RPE, le celle vengono sospese nel mezzo. Dopo la semina, le cellule vengono monitorate due volte a settimana e, dopo aver raggiunto la confluenza, trasfettate dall'elettroporazione. L'integrazione genica, l'espressione, la secrezione proteica e la funzione sono state confermate da qPCR, WB, ELISA, immunofluorescenza e saggi funzionali. A seconda della specie, 30.000-5 milioni (RPE) e 10.000-1,5 milioni (IPE) di cellule possono essere isolate per occhio. Le cellule geneticamente modificate mostrano una significativa sovraespressione di PEDF/GM-CSF con la capacità di ridurre lo stress ossidativo e offrono un sistema flessibile per analisi ex vivo e studi in vivo trasferibili all'uomo per sviluppare approcci di terapia genica oculare.

Introduzione

Il nostro gruppo si sta concentrando sullo sviluppo di approcci rigenerativi per il trattamento della degenerazione neuroretinica, cioè AMD, mediante terapia genica non virale basata su RPE e IPE. L'istituzione pre-clinica di tali terapie richiede modelli in vitro trasferibili agli esseri umani. Pertanto, l'obiettivo dello studio qui presentato è quello di fornire protocolli per l'isolamento, la coltura e l'ingegneria genetica delle cellule PRIMARIE RPE e IPE. Il razionale per stabilire l'isolamento delle cellule PE da più specie è quello di confermare in modo robusto la sicurezza e l'efficienza dell'approccio e aumentarne la riproducibilità e la trasferibilità. La linea cellulare RPE umana disponibile ARPE-19 differisce dalle cellule primarie (ad esempio, sono meno pigmentate) ed è, quindi, solo di valore limitato per le analisi pre-cliniche1. Inoltre, le cellule di mammifero non umane possono essere acquistate a costi inferiori e in quantità maggiori; il tessuto del donatore umano può essere ottenuto da varie banche oculari, ma la disponibilità è limitata e costosa. Infine, i nuovi medicinali per terapie avanzate (ATMP, cioè cellule, tessuti o medicinali per terapia genica) devono essere applicati in almeno due specie diverse prima di essere testati nei pazienti e questi studi in vivo richiedono la preparazione di trapianti di cellule allogeniche.

Le malattie neurodegenerative della retina sono la principale causa di cecità nei paesi industrializzati, comprendendo malattie comuni come l'AMD, così come malattie rare come la retinite pigmentosa, in cui la morte delle cellule retiniche alla fine porta alla cecità. Il danno alle cellule RPE, ai fotorecettori e alle cellule gangliari retiniche (RGC) può in alcuni casi essere rallentato, ma attualmente non sono disponibili terapie curative. Gli ATMP offrono il potenziale per correggere i difetti genetici, integrare geni terapeutici o sostituire le cellule degenerate, consentendo così lo sviluppo di terapie rigenerative e curative per malattie come l'AMD; 13 terapie geniche hanno già ottenuto l'approvazione alla commercializzazione, inclusa una terapia per il trattamento della degenerazione retinica associata alla mutazione RPE652,3. Tra gli anziani (>60 anni), ~ 30 milioni di persone in tutto il mondo sono affette da AMD4neovascolare (nvAMD) o avascolare (aAMD). Entrambe le forme sono indotte da fattori scatenanti associati all'età tra cui danno ossidativo, compromissione della funzione e perdita di cellule RPE seguita da degradazione dei fotorecettori, tra gli altri (ad esempio alleli di rischio genetico, fumo, ipertensione)5,6. In nvAMD, la patogenesi è aggravata da uno squilibrio di fattori angiogenici e anti-angiogenici a favore del fattore di crescita endoteliale vascolare angiogenico (VEGF) che induce la neovascolarizzazione coroidale (CNV). Ad oggi, solo nvAMD è curabile con iniezioni intravitreali mensili di inibitori della proteina VEGF per sopprimere il CNV; nessun trattamento efficace è ancora disponibile per aAMD6,7.

Diversi studi hanno valutato terapie cellulari per sostituire la terapia anti-VEGF: gli studi condotti da Binder et al., in cui cellule RPE autologhe appena raccolte sono state trapiantate in pazienti con nAMD8,9,10,hanno mostrato un moderato miglioramento visivo, ma solo un piccolo gruppo di pazienti ha raggiunto un'acuità visiva finale abbastanza alta da consentire la lettura. Recentemente, uno studio clinico di fase I ha utilizzato un cerotto RPE derivato da cellule staminali embrionali per trattare l'AMD con risultati promettenti; vale a dire, efficacia, stabilità e sicurezza del cerotto RPE per un massimo di 12 mesi in 2 dei 10 pazienti trattati11. Inoltre, diversi gruppi hanno pubblicato studi in cui i cerotti autologhi RPE-Bruch membrana-coroide sono stati prelevati dalla retina periferica e trapiantati nella macula12,13,14; e per il trapianto sono stati generati cerotti RPE derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)15. Per l'aAMD, gli anticorpi mirati alla via del complemento sono stati testati in studi clinici6,16 e uno studio di fase I utilizzando una singola iniezione intravitreale di un vettore virale adeno-associato (AAV) che codifica il gene per il fattore CD59 (AAVCAGsCD59) in pazienti con atrofia geografica (GA) è stato completato17; lo studio di fase II è stato recentemente avviato e mira a reclutare 132 pazienti con aAMD avanzata e a valutare l'esito a 2 anni dopo l'intervento18. Infine, il gruppo di studio FocuS ha avviato uno studio clinico multicentrico di fase I/II che valuta la sicurezza, la risposta alla dose e l'efficacia di un vettore AAV ricombinante non replicante che codifica un fattore del complemento umano19.

In primo luogo, l'obiettivo di una terapia rigenerativa AMD è il trapianto di cellule RPE funzionali, che sono state danneggiate o perse. Tuttavia, le cellule IPE e RPE condividono molte somiglianze funzionali e genetiche (ad esempio, fagocitosi e metabolismo del retinolo) e, poiché le cellule IPE sono raccolte in modo più fattibile, sono state proposte come sostituto RPE20. Anche se è stato precedentemente dimostrato che il trapianto di cellule IPE ritarda la degenerazione dei fotorecettori nei modelli animali21,22 e stabilizza la funzione visiva nei pazienti con nvAMD allo stadio finale, non è stato osservato alcun miglioramento significativo in questipazienti 23. La mancanza di efficacia può essere dovuta al basso numero di cellule trapiantate e/o allo squilibrio dei fattori retinici neuroprotettivi. Un approccio alternativo sarebbe quello di trapiantare cellule epiteliali pigmentate trasfettate che sovraesprimono fattori neuroprotettivi per ripristinare l'omeostasi retinica, mantenere le cellule RPE rimanenti e proteggere i fotorecettori e gli RGC dalla degenerazione. Di conseguenza, proponiamo una nuova terapia che comprende il trapianto di cellule funzionali RPE o IPE che sono state sottoposte a ingegneria genetica per secernere proteine neuroprotettive e anti-angiogeniche, come PEDF, GM-CSF o fattori di crescita insulino-simili (IGF). Il vantaggio di sviluppare e analizzare questo approccio in diverse specie invece di utilizzare una linea cellulare, una sola specie, o tessuto umano è: 1) aumentata riproducibilità e trasferibilità dei risultati come dimostrato da numerosi studi realizzati in laboratori indipendenti e diverse specie1,24,25; 2) le cellule suine o bovine sono fattibilmente usa e getta senza il sacrificio di altri animali; 3) la disponibilità soprattutto di cellule suine e bovine consente a grandi serie di test di produrre risultati robusti; 4) la conoscenza di isolare, colturare e modificare geneticamente le cellule dai modelli maggiormente utilizzati consente analisi in vivo in più specie24,25,26 e offre quindi un migliore rapporto rischio-beneficio per i primi pazienti trattati; 5) la flessibilità del protocollo presentato ne consente l'utilizzo in vari modelli e set up sperimentali e per tutte le terapie cellulari oculari con e senza ingegneria genetica. Al contrario, tecniche alternative come le linee cellulari o il tessuto umano sono solo di limitata trasferibilità e/ o disponibilità limitata. Le linee cellulari come l'ARPE-19 sono ideali per esperimenti preliminari; tuttavia, la bassa pigmentazione e l'alta proliferazione differiscono significativamente dalle cellule primarie1. Le cellule RPE e IPE, isolate dal tessuto umano del donatore, offrono una preziosa fonte per esperimenti in vitro trasferibili; tuttavia, otteniamo tessuto umano da una Banca degli occhi statunitense-americana, il che significa che il tessuto ha almeno due giorni (dopo l'enucleazione) e richiede un trasporto lungo e costoso, ma il tessuto del donatore locale non è disponibile in quantità sufficienti per una ricerca produttiva. Il vantaggio dell'uso di cellule primarie è confermato da molteplici studi di altri gruppi27,28.

Per lo sviluppo di una terapia genica non virale a base cellulare utilizzando il sistema di trasposoni SB100X per trasfettare cellule primarie RPE e IPE con i geni che codificano per PEDF e/o GM-CSF per trattare nvAMD e aAMD, rispettivamente29,30,31,32,abbiamo prima stabilito la trasfezione delle cellule ARPE-191 . Successivamente, i protocolli di isolamento e trasfezione sono stati stabiliti in cellule primarie bovine e sucine facilmente accessibili. Ora, è stato stabilito l'isolamento e la trasfezione di cellule primarie RPE e IPE da cinque diverse specie, da piccoli (come topi) a grandi mammiferi (come bovini). È stato confermato in cellule primarie RPE e IPE derivate da occhi di donatori umani30. La produzione conforme alle buone pratiche di fabbricazione (GMP) dell'ATMP è stata convalidata utilizzando anche tessuto di donatore umano33. Infine, sia la sicurezza che l'efficienza dell'approccio sono state valutate in vivo in tre diverse specie per le quali il protocollo è stato adattato: topo, ratto e coniglio. Nel set-up clinico, una biopsia dell'iride sarà prelevata dal paziente e le cellule IPE saranno isolate e trasfettate nella camera bianca, prima che le cellule vengano trapiantate subretinamente nello stesso paziente. L'intero processo si svolgerà durante una singola sessione chirurgica della durata di circa 60 minuti. Lo sviluppo dell'approccio terapeutico e la valutazione della sua efficienza hanno richiesto eccellenti modelli in vitro ed ex vivo per implementare metodi di consegna genica robusti ed efficienti, per analizzare l'efficienza della consegna genica, la produzione terapeutica di proteine e gli effetti neuroprotettivi e per produrre trapianti di cellule per testare l'approccio in vivo1,24,25,29,30 . Vale la pena ricordare che la terapia ha l'approvazione etica per uno studio clinico di fase Ib/IIa da parte della commissione etica per la ricerca del Cantone di Ginevra (n. 2019-00250) e attualmente gli ultimi dati pre-clinici richiesti per l'autorizzazione dalle autorità di regolamentazione svizzere sono raccolti utilizzando il protocollo presentato. A questo proposito, i dati pre-clinici in vivo hanno dimostrato una significativa riduzione del CNV e un'ottima sicurezza24,25,31.

Qui viene descritto l'isolamento e la coltura di cellule RPE / IPE da bovini, suini, conigli, ratti e topi e l'uso del sistema di trasposone integrativo SB100X combinato con l'elettroporazione come metodo efficiente di consegna genica. In particolare, le cellule PE primarie sono state trasfettate per sovraesprimere PEDF e GM-CSF. La raccolta di questi protocolli consente di eseguire gli studi in vitro e in vivo in tutte le fasi pre-cliniche dello sviluppo di ATMP. Inoltre, il set-up ha il potenziale per essere adattato ad altri geni di interesse e malattie.

Protocollo

I protocolli in cui gli animali sono stati coinvolti sono stati eseguiti da personale certificato e previa autorizzazione del Dipartimento cantonale della sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale di Ginevra, Svizzera, e secondo la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva (approvazione n. GE/94/17). Ratti adulti sani brown norway, topi C57BL/6 e conigli bianchi neozelandesi sono stati eutanasizzati da un sovradosaggio di Pentobarbital (150 mg/kg) diluito in NaCl iniettato allo 0,9% intraperitoneale e gli occhi sono stati enucleati immediatamente dopo il sacrificio. Occhi suini e bovini sono stati ottenuti da un macello locale entro 6 ore dal sacrificio e sono stati trasportati in laboratorio su ghiaccio.

1. Prima della preparazione

  1. Preparare un mezzo completo (DMEM / F12 di Ham integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS), 80 U / mL di penicillina / 80 μg / mL di streptomicina e 2,5 μg / mL di amfotericina B). Riscaldare il mezzo, 1x PBS e 0,25% di tripsina (se necessario) a bagnomaria a 37 °C.
  2. Metti un drappo sterile nel cappuccio per preparare un posto di lavoro asettico. Introdurre tutti gli strumenti e i materiali sterili necessari all'interno della cappa.
    NOTA: Solo l'enucleazione degli occhi e la pulizia del tessuto muscolare e della pelle rimanenti sono le procedure eseguite all'esterno del cappuccio, il resto dei passaggi deve essere eseguito all'interno del cappuccio.

2. Isolamento delle cellule PE di ratto/topo

  1. Usa forbici curve e pinza Colibri per enucleare gli occhi dopo l'eutanasia dell'animale. Pulire il tessuto muscolare rimanente e la pelle dagli occhi usando forbici e pinza (non sterili).
    NOTA: La dimensione delle forbici e delle pinza utilizzate per l'enucleazione e la pulizia degli occhi dipende dalla specie (ad esempio, per ratti e topi gli strumenti saranno più piccoli di quelli utilizzati per suini e bovini) (vedi Figura S1).
    1. Raccogliere gli occhi in un tubo da 50 ml riempito con PBS non sterile e trasferire il tubo nella cappa a flusso laminare. Disinfettare gli occhi immergendoli per 2 minuti in una soluzione a base di iodio, quindi trasferirli in una capsula di Petri riempita con PBS sterile.
  2. Apertura della lampadina
    1. Dopo aver trasferito gli occhi su una capsula di Petri sterile, tenerne uno saldamente vicino al nervo ottico con Colibri o pinna appuntita. Perforare un foro vicino al limite dell'iride (tra pars plana e ora serrata) con un ago da 18 G. Inserire piccole forbici nel foro e tagliare intorno all'iride. Rimuovere il segmento anteriore (cornea, lente e iride) e metterlo in una capsula di Petri. Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate.
  3. Isolamento delle cellule IPE
    1. Rimuovere la lente e con una pince fine estrarre delicatamente l'iride contenente le cellule IPE. Mettere l'iride in una capsula di Petri, lavare con PBS sterile e lasciarlo in PBS fino a quando non viene preparata più iride.
    2. Ripeti i passaggi da 2.2.1 a 2.3.1 affinché tutti gli occhi siano preparati quel giorno.
    3. Aggiungere 50 μL di tripsina allo 0,25% per iride e incubare per 10 minuti a 37 °C. Rimuovere la tripsina, aggiungere 150 μL di mezzo completo per iride e raschiare delicatamente l'IPE con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco; utilizzare pinze sottili per immobilizzare il tessuto. Raccogliere la sospensione cellulare e inserire un tubo da 1,5 ml. Utilizzare 10 μL della sospensione cellulare diluita 1:3 con tripano blu per contare le cellule nella camera neubauer34,35.
    4. Se non trasfettato immediatamente, seminare 200.000 cellule/pozzetti in una piastra a 24 pozzetti (100.000 cellule/cm2)in 1 mL di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedi Tabella 1). Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: Potrebbe essere necessario raggruppare più occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.
  4. Isolamento delle celle RPE
    1. Rimuovere l'umore vitreo e la retina dal segmento posteriore con una pinna sottile. Evitare di danneggiare l'epitelio pigmentato retinico.
    2. Taglia il segmento a metà con un bisturi #10 per avere il globo completamente aperto e lavalo con PBS sterile.
    3. Aggiungere 50 μL di tripsina allo 0,25% per occhio e incubare per 10 minuti a 37 °C. Rimuovere la tripsina e aggiungere 150 μL di mezzo completo per globo e raschiare delicatamente le cellule RPE con un bisturi rotondo; utilizzare pinze sottili per immobilizzare il tessuto. Raccogliere la sospensione cellulare e metterla in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare; diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
    4. Vedere il passaggio 2.3.4.
      NOTA: Potrebbe essere necessario raggruppare più occhi insieme per avere abbastanza cellule per la semina.

3. Isolamento delle cellule di PE di coniglio

  1. Eseguire la pulizia e la disinfezione come descritto nei passaggi da 2.1 a 2.1.1.
  2. Metti un occhio su un impacco di garza sterile e tienilo saldamente vicino al nervo ottico. Aprire l'occhio con il bisturi #11 e le forbici a circa 2 mm sotto il limbus. Rimuovere il segmento anteriore (cornea, lente e iride) e metterlo in una capsula di Petri. Lasciare il bulbo con il vitreo fino a quando le cellule RPE non sono isolate.
  3. Isolamento delle cellule IPE
    1. Eseguire il passaggio 2.3.1. Rimuovere il corpo ciliare dall'iride tagliando con un bisturi #10.
    2. Dopo la preparazione di 2 iris, incubare con 1 mL di tripsina allo 0,25 % a 37 °C per 10 minuti; durante questo periodo, le celle RPE possono essere isolate (vedere il passaggio 3.4). Rimuovere la tripsina e aggiungere 1 mL di mezzo completo all'iride e isolare le cellule grattando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata al fuoco. Risuscimere accuratamente le cellule mediante pipettaggio e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:3 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
    3. Vedere il passaggio 2.3.4.
  4. Isolamento delle celle RPE
    1. Eseguire il passaggio 2.4.1.
    2. Metti una garza sterile in un piatto da 12 pozzetti e metti il bulbo sopra la garza.
    3. Lavare con PBS ed eseguire il passaggio 2.4.3.
      NOTA: utilizzare una pipetta Pasteur curva lucidata a fuoco.
    4. Centrifugare le celle 10 min a 120 x g.
    5. Vedere il passaggio 2.3.4.

4. Isolamento delle cellule PE suine

  1. Eseguire la pulizia come descritto nel passaggio 2.1. Lavare con PBS e disinfettare gli occhi immergendo per 2 minuti in soluzione a base di iodio, risciacquare con PBS. Continuare con il passaggio 3.2.
  2. Isolamento delle cellule IPE
    1. Eseguire il passaggio 3.3.1. Dopo la preparazione di 2 iris, aggiungere 1 mL di mezzo completo e isolare le celle grattando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata al fuoco. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
    2. Vedere il passaggio 2.3.4.
  3. Isolamento delle celle RPE
    1. Eseguire il passaggio 2.4.1. Posizionare la lampadina in una capsula di Petri e lavare con PBS. Riempire la lampadina con 1 mL di mezzo completo.
    2. Utilizzando una pipetta Pasteur curva lucidata al fuoco, rimuovere con cura le celle RPE. Assicurati di raschiare dal basso verso l'alto per evitare di scivolare verso il basso del complesso di membrana coroide-Bruch. Raccogliere la sospensione cellulare all'interno del bulbo utilizzando una pipetta da 1.000 μL e trasferirla in un tubo da 1,5 mL per la ricaspensione. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:8 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
    3. Vedere il passaggio 2.3.4.

5. Isolamento delle cellule di EP bovina

  1. Eseguire la pulizia come descritto nel passaggio 2.1. Lavare con PBS e disinfettare gli occhi immergendo per 2 minuti in soluzione a base di iodio, risciacquare con PBS. Continuare con il passaggio 3.2.
  2. Isolamento delle cellule IPE
    1. Eseguire il passaggio 3.3.1. Dopo la preparazione di due iris, incubare con 2 ml di tripsina allo 0,25% a 37 °C per 10 min. Durante questo periodo, le celle RPE possono essere isolate (vedere il passaggio 5.3).
    2. Rimuovere la tripsina e aggiungere 2 mL di mezzo completo all'iride e isolare le cellule graffiando accuratamente con una pipetta Pasteur piatta lucidata a fuoco. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Centrifugare le celle 10 min a 120 x g. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e diluire 1:4 con tripano blu per contare le cellule nella camera di Neubauer.
    3. Se non trasfettato immediatamente, seminare 320.000 cellule/pozzetti in una piastra a 6 pozzetti in 3 ml di terreno completo (10% FBS) (per la semina vedere Tabella 1). Posizionare la piastra in un'incubatrice e coltivata a 37 °C, 5% CO2.
  3. Isolamento delle celle RPE
    1. Seguire il passaggio 2.4.1. Posizionare la lampadina in una capsula di Petri e lavare con PBS. Dopo la preparazione di 2 occhi riempire il bulbo circa 3/4 con tripsina e incubare per 25 minuti a 37 °C con il coperchio della capsula di Petri sopra i bulbi.
    2. Rimuovere la tripsina e aggiungere 1 mL di mezzo completo. Eseguire il passaggio 4.3.2. Centrifugare le celle 10 min a 120 x g.
    3. Vedere il passaggio 5.2.3.

6. Coltivazione - cambio medio

  1. Coltura le cellule in DMEM /Ham's F12, integrato con 10% FBS, 80 U / mL penicillina / 80 μg / mL streptomicina e 2,5 μg / mL amfotericina B, a 37 ° C e 5% CO2 in un incubatore umidificato. Dopo 3-4 giorni pipettare su e giù per raccogliere le cellule non aderenti e mettere metà del volume in un altro pozzo. Riempire fino a 1 ml con mezzo completo.
    NOTA: in questo modo è possibile avere una superficie sufficientemente grande da consentire a tutte le celle isolate di collegarsi e massimizzare l'output.
  2. Dopo altri 3-4 giorni ripetere la raccolta cellulare, ma questa volta mettendo insieme le cellule non aderenti da due pozzeli in un unico pozzo (ad esempio, A1 + B1 in C1). Aggiungi medio a tutti i pozzi. Osservare le cellule e cambiare il mezzo 2 volte a settimana (per le piastre a 6 e 24 pozzi utilizzare rispettivamente 3 e 1 ml / pozzo). Quando le cellule raggiungono la confluenza, passare al mezzo completo con l'1% di FBS o utilizzare le cellule per esperimenti (ad esempio, trasfezione).
    NOTA: le cellule RPE e IPE sono confluenti rispettivamente dopo 3-4 e 4-5 settimane dopo l'isolamento. La purezza della coltura cellulare è stata corroborata controllando la morfologia cellulare (cellule pigmentate) e marcatori specifici come descritto da Johnen e colleghi36.

7. Elettroporazione di celle primarie in PE

  1. Eseguire l'elettroporazione come descritto prima1,37.
  2. A seconda del numero di cellule trasfettate utilizzare piastre a 6, 24 o 48 polizze (vedi Tabella 2)per seminare le cellule in mezzo senza antibiotici o antimicotici. Per le successive 2 settimane aggiungere gocce con penicillina media contenente (80 U / mL), streptomicina (80 μg / mL) e amfotericina B (2,5 μg / mL) due volte a settimana. Sostituire completamente il mezzo 2 settimane dopo la trasfezione.
  3. Per determinare la crescita cellulare, l'efficienza della trasfezione e la secrezione proteica, monitorare le cellule settimanalmente al microscopio e analizzare il surnatante di coltura cellulare mediante western blot. Prima della fine della coltura, prendere un surnatante di coltura cellulare di 24 ore per quantificare la secrezione proteica tramite ELISA, contare le cellule, misurare la fluorescenza mediante citometria basata su immagini (nel caso di cellule trasfettate da Venere)seguendo le istruzioni dei produttori (vedere Tabella dei materiali)e raccogliere il pellet cellulare per l'analisi dell'espressione genica basata su RT-qPCR.
    NOTA: Questi metodi non sono inclusi nel presente documento poiché non è lo scopo di spiegare in dettaglio l'analisi delle cellule, ma piuttosto il loro isolamento. La densità di semina cellulare è la stessa per tutte le specie (100.000 cellule/cm2)ma poiché il numero di cellule isolate varia, sono state utilizzate piastre diverse. Inoltre, per topi, ratti e conigli potrebbe essere necessario mettere in comune 2-3 occhi per avere abbastanza cellule per la semina.
SpecieTrattamento con tripsinaN° celle IPEN° celle RPEPiastra per semina (100.000 celle/cm2)
Topo/rattoSì~50.000~150.000Piastre a 24 pozzi
ConiglioSì~350.000~2.500.000Piastre a 24 pozzi
MaialeNo~1.000.000~3.000.000Piastre a 24 pozzi
BovinoSì~1.700.000~5.000.000Piastre a 6 pozzi

Tabella 1: Numero di cellule PE primarie isolate da occhi di specie diverse.

NomeAreaVolume medioTripsinaVolume medio per fermare l'azione della tripsinaDensità di semina
Piastra a 6 pozzi9,6 cm²3,0 ml0,5 ml1,0 ml3x105
Piastra a 24 pozzi2,0 cm²1,0 ml0,2 ml0,8 ml5x104
Piastra a 48 pozzi1,1 cm²0,5 ml0,1 ml0,4 ml0,5-1x104

Tabella 2: Volumi di coltura cellulare e densità di semina.

Risultati

Isolamento dell'EP da diverse specie di mammiferi
Utilizzando i protocolli di cui sopra, le cellule IPE e RPE sono state isolate e coltivate con successo da cinque specie diverse. Il numero di cellule ottenute da ciascuna procedura dipende dalla specie e dalle dimensioni dell'occhio (Tabella 1). Come mostrato nella Figura 1,le cellule mostrano la morfologia e la pigmentazione tipiche delle cellule PE (ad eccezione delle cellule di coniglio mostrate, deriv...

Discussione

Avere metodi standardizzati per isolare e colturare le cellule PE è fondamentale nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici per le malattie degenerative della retina. Con i protocolli qui presentati, le cellule PE possono essere isolate con successo da diverse specie e coltivate per lunghi periodi (fino ad ora, la coltura più lunga è stata mantenuta per 2 anni1,38); è stata osservata la morfologia, la pigmentazione e la funzione tipiche delle cellule PE (

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Un ringraziamento merita Gregg Sealy e Alain Conti per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione europea nell'ambito del Settimo programma quadro, della Fondazione nazionale svizzera per le scienze e della Fondazione Schmieder-Bohrisch. Z.I. ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] e B.M.W. da una borsa di ricerca Fulbright e da una borsa di studio di eccellenza del governo svizzero.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well platesCorning353043
24-well platesCorning353047
48-well platesThermoFisher Scientific150687
6-well plateGreiner7657160
BetadineMundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity AssayPromegaG9291
DMEM/Ham`s F12Sigma-AldrichD8062
Drape (sterile)Mölnlycke Health Care800530
Electroporation buffer 3P.143P Pharmaceutical
FBSBrunschwigP40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compressPROMEDICAL AG25403
NaCl (0.9%)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Needle (18G) TerumoTER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µLThermoFisher ScientificMPK1096
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000S
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Pasteur pipette (fire-polish)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
Petri dishThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Pastor et al., 2018
scarpel no. 10Swann-Morton501
scarpel no. 11Swann-Morton503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based CytometerThermoFisher ScientificT10796
Trypsin 0.25% ThermoFisher Scientific25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%Sigma-AldrichT4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

Riferimenti

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