JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן מוצג פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי אפיתל ראשוניים של איריס ושל פיגמנט רשתית מיונקים שונים (עכברים, חולדות, ארנב, חזיר וחזירים). השיטה מתאימה באופן אידיאלי לחקר גישות ריפוי גנטי עיניות במגוון סטים עבור ניתוחי ex vivo ובמחקרי vivo הניתנים להעברה לבני אדם.

Abstract

ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) הוא הגורם השכיח ביותר לעיוורון בחולים >60 שנה, המשפיע על כ -30 מיליון אנשים ברחבי העולם. AMD היא מחלה רב-גורמית המושפעת מגורמים סביבתיים וגנטיים, המובילים לפגיעה תפקודית ברשתית עקב ניוון תאי הפיגמנט ברשתית (RPE) ואחריו השפלת קולטני הפוטו. טיפול אידיאלי יכלול השתלה של תאי RPE בריאים מפרישים גורמים neuroprotective כדי למנוע מוות תאי RPE ניוון photoreceptor. בשל הדמיון התפקודי והגנטי והאפשרות לביופסיה פחות פולשנית, הוצעה השתלת תאי אפיתל פיגמנט איריס (IPE) כתחליף ל- RPE המנוון. הפרשת גורמים neuroprotective על ידי מספר נמוך של תאים מושתלים subretinally ניתן להשיג על ידי היפהפייה הנרדמת (SB100X) transposon בתיווך תעתיק עם גנים קידוד עבור גורם הפיגמנט נגזר אפיתל (PEDF) ו / או גרנולוציט מקרופאג'-מושבה גורם מגרה (GM-CSF). הקמנו את הבידוד, התרבות, ו- SB100Xבתיווך של תאי RPE ו- IPE ממינים שונים כולל מכרסמים, חזירים ובקר. גלובס מוסר והקרנית והעדשה מוסרות כדי לגשת לאיריס ולריתתית. באמצעות מרית בהזמנה אישית, תאי IPE מוסרים מה הקשתית המבודדת. כדי לקצור תאי RPE, דגירה טריפסין עשוי להידרש, בהתאם למין. לאחר מכן, באמצעות מרית מותאמת אישית של RPE, תאים מושעים במצב בינוני. לאחר זריעה, תאים מנוטרים פעמיים בשבוע, ולאחר שהגיעו למפגש, מועברים על ידי אלקטרופורציה. שילוב גנים, ביטוי, הפרשת חלבונים ותפקוד אושרו על ידי qPCR, WB, ELISA, אימונופלואורסצנטיות וביקורת תפקודית. בהתאם למין, 30,000-5 מיליון (RPE) ו-10,000-1.5 מיליון (IPE) תאים יכולים להיות מבודדים לכל עין. תאים מהונדסים גנטית מראים ביטוי יתר משמעותי של PEDF/GM-CSF עם היכולת להפחית עקה חמצונית ומציעים מערכת גמישה עבור ניתוחי ex vivo ובמחקרי vivo הניתנים להעברה לבני אדם כדי לפתח גישות לטיפול בגנים עיניים.

Introduction

הקבוצה שלנו מתמקדת בפיתוח גישות רגנרטיביות לטיפול בניוון עצבי, כלומר AMD, על ידי RPE- ו- IPE מבוסס טיפול גנטי לא ויראלי. הממסד הקדם-קליני של טיפולים כאלה מחייב מודלים במבחנה הניתנים להעברה לבני אדם. לכן, מטרת המחקר המוצג כאן היא לספק פרוטוקולים לבידוד, לתרבות ולהנדסה גנטית של תאי RPE ו- IPE ראשוניים. הרציונל לבסס את הבידוד של תאי PE ממינים מרובים הוא לאשר בחוזקה את הבטיחות והיעילות של הגישה ולהגדיל את יכולת הרבייה וההעברה שלה. קו תא RPE האנושי הזמין ARPE-19 שונה מתאים ראשוניים (למשל, הם פחות פיגמנטים) ולכן, הוא רק בעלערךמוגבל עבור ניתוחים פרה קליניים 1 . בנוסף, ניתן לרכוש תאים לא אנושיים של יונקים בעלות נמוכה יותר ובכמויות גדולות יותר; רקמת תורם אנושי ניתן להשיג בנקי עיניים שונים, אבל הזמינות מוגבלת ויקרה. לבסוף, מוצרים רפואיים חדשים לטיפול מתקדם (ATMP, כלומר, תא, רקמה, או מוצר רפואי טיפול גנטי) צריך להיות מיושם לפחות שני מינים שונים לפני שנבדקו בחולים אלה במחקרים vivo לבקש את הכנת השתלות תאים אלוגניים.

מחלות ניווניות ברשתית הן הגורם המוביל לעיוורון במדינות מתועשות, הכוללות מחלות נפוצות כמו AMD, כמו גם מחלות נדירות כמו רטיניטיס פיגמנטוזה, שבהן המוות של תאי הרשתית מוביל בסופו של דבר לעיוורון. תאי RPE, קולטן אור ותאי גנגליון רשתית (RGC) נזק יכול במקרים מסוימים להיות מואט, אבל אין כרגע אין ריפוי זמין. ATMPs מציעים פוטנציאל לתקן פגמים גנטיים, לשלב גנים טיפוליים או להחליף תאים מנוונים, ובכך לאפשר התפתחות של טיפולים רגנרטיביים ומרפאים למחלות כגון AMD; 13 טיפולים גנטיים כבר קיבלו אישור שיווק כולל טיפול לטיפול בניוון רשתית הקשור למוטציה RPE652,3. בקרב מבוגרים (>60 שנה), ~ 30 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים או ניאווסקולרי (nvAMD) או כלי דם (aAMD) AMD4. שתי הצורות נגרמות על ידי גורמים הקשורים לגיל כולל נזק חמצוני, פגיעה בתפקוד ואובדן של תאי RPE ואחריו השפלת photoreceptor, בין היתר (למשל אללים סיכון גנטי, עישון, יתר לחץ דם)5,6. ב- nvAMD, פתוגנזה מחמירה על ידי חוסר איזון של גורמים אנגיוגניים ואנטי אנגיוגניים לטובת גורם הגדילה האנדותל וסקולרי אנגיוגניים (VEGF) שגורם לניאווסקולריזציה choroidal (CNV). עד כה, רק nvAMD ניתן לטיפול על ידי זריקות תוך-ויטראליות חודשיות של מעכבי חלבון VEGF כדי לדכא את CNV; אין עדיין טיפול יעיל זמין עבור AAMD6,7.

מספר מחקרים העריכו טיפולים מבוססי תאים כדי להחליף את הטיפול נגד VEGF: מחקרים שנעשו על ידי בינדר ואח ', שבו תאי RPE אוטולוגיים שנקטפו זה עתה הושתלו בחולים עם nAMD8,9,10, הראו שיפור חזותי מתון, אבל רק קבוצה קטנה של חולים הגיעו חדות ראייה סופית גבוהה מספיק כדי לאפשר קריאה. לאחרונה, מחקר קליני שלב I השתמש תיקון RPE שמקורו בתא גזע עוברי לטיפול AMD עם תוצאות מבטיחות; כלומר, יעילות, יציבות ובטיחות של תיקון RPE עד 12 חודשים ב 2 מתוך 10 חולים שטופלו11. בנוסף, מספר קבוצות פרסמו מחקרים שבהם מדבקות הממברנה-כורואיד של RPE-Bruch האוטולוגיות נקצרו מהרשתית ההיקפית והושתלו למקולה12,13,14; ותחבושות RPE שמקורן בתאי גזע פלוריפוטנטיות (iPSC) נוצרו להשתלה15. עבור AAMD, נוגדנים המתמקדים במסלול המשלים נבדקו בניסויים קליניים6,16 ושלב מחקר אני באמצעות הזרקה תוך-ויטמינית אחת של וקטור ויראלי הקשור לאדנו (AAV) קידוד הגן לגורם CD59 (AAVCAGsCD59) בחולים עם ניוון גיאוגרפי (GA) הושלם17; מחקר שלב II החל לאחרונה ומטרתו לגייס 132 חולים עם AAMD מתקדם ולהעריך את התוצאה בגיל שנתיים לאחר התערבות18. לבסוף, קבוצת המחקר FocuS החלה ניסוי קליני רב מרכזי שלב I /II הערכת הבטיחות, תגובת המינון והיעילות של רקומביננטי לא שכפול וקטור AAV קידוד גורם משלים אנושי19.

בעיקר, המטרה של טיפול AMD רגנרטיבי היא השתלת תאי RPE פונקציונליים, אשר נפגעו או אבדו. עם זאת, תאי IPE ו- RPE חולקים קווי דמיון תפקודיים וגנטיים רבים (למשל, פאגוציטוזיס ומטבוליזם רטינול), ומכיוון שתאי IPE נקצרים באופן ריאלי יותר, הם הוצעו כתחליף RPE20. למרות שהוכח בעבר כי השתלת תאי IPE מעכבת ניוון פוטורצפטור במודלים של בעלי חיים21,22 ומייצבת את התפקוד החזותי בחולים עם nvAMD סופני, לא נצפה שיפור משמעותי בחולים אלה23. חוסר היעילות עשוי להיות בשל המספר הנמוך של תאים מושתלים, ו /או חוסר איזון של גורמי רשתית neuroprotective. גישה חלופית תהיה להשתיל תאי אפיתל פיגמנט transfected כי overexpress גורמים neuroprotective כדי לשחזר הומאוסטזיס רשתית, לשמור על תאי RPE הנותרים, ולהגן על קולטני אור ו RGCs מפני ניוון. כתוצאה מכך, אנו מציעים טיפול חדש הכולל השתלה של תאי RPE או IPE פונקציונליים שעברו הנדסה גנטית להפריש חלבונים neuroprotective ואנטי אנגיוגניים, כגון PEDF, GM-CSF או גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGFs). היתרון של פיתוח וניתוח גישה זו במספר מינים במקום להשתמש בקו תאים, רק מין אחד, או רקמה אנושית הוא: 1) רבייה מוגברת ויכולת העברה של התוצאות כפי שמוצג על ידי מחקרים רבים שהתממשו במעבדות עצמאיות ובמינים שונים1,24,25; 2) תאי חזיר או בקר הם חד פעמיים באופן ריאלי ללא הקרבה של בעלי חיים נוספים; 3) הזמינות של תאי חזיר וטור במיוחד מאפשרת לסדרות בדיקה גדולות לייצר תוצאות חזקות; 4) הידע לבודד, לתרבות ולשנות גנטית תאים מהמודלים הנפוצים בעיקר מאפשר ניתוחי vivo במינים מרובים24,25,26 ובכך מציע יחס סיכון-תועלת משופר עבור החולים שטופלו לראשונה; 5) גמישות הפרוטוקול המוצג מאפשרת את השימוש בו במודלים שונים ובסטים ניסיוניים ולכל טיפולים מבוססי תאים עיניים עם ובלי הנדסה גנטית. לעומת זאת, טכניקות חלופיות כמו קווי תאים או רקמה אנושית הן רק של יכולת העברה מוגבלת ו /או חד פעמי מוגבל. קווי תאים כגון ARPE-19 הם אידיאליים לניסויים ראשוניים; עם זאת, פיגמנטציה נמוכה והתפשטות גבוהה שונים באופן משמעותי מהתאים העיקריים1. תאי RPE ו- IPE, המבודדים מרקמת התורם האנושי מציעים מקור יקר לניסויי מביה מובנים; עם זאת, אנו מקבלים רקמה אנושית מבנק עיניים אמריקאי-אמריקאי כלומר הרקמה בת יומיים לפחות (לאחר ההשתתפות) ודורשת הובלה ארוכה ויקרה, אך רקמת התורם המקומית אינה זמינה בכמויות מספיקות למחקר פרודוקטיבי. היתרון של השימוש בתאים ראשוניים מאושר על ידי מחקרים מרובים מקבוצות אחרות27,28.

לפיתוח של טיפול גנטי לא ויראלי מבוסס תא באמצעות מערכת טרנספוסון SB100X עבור transfecting תאי RPE ו- IPE ראשוניים עם קידוד הגנים עבור PEDF ו / או GM-CSF לטיפול nvAMD ו- aAMD, בהתאמה29,30,31,32, הקמנו לראשונה את transfection של ARPE-19 תאים1 . לאחר מכן, פרוטוקולי הבידוד וההדבקה הוקמו בתאי בקר וחזירים ראשיים נגישים. כעת, הבידוד וההדבקה של תאי RPE ו- IPE ראשוניים מחמישה מינים שונים הוקמו, מקטן (כעכבר) ליונקים גדולים (כבקר). זה אושר בתאי RPE ו- IPE ראשוניים שמקורם בעיני תורם אנושי30. ייצור תואם ייצור טוב (GMP) של ATMP אומת באמצעות רקמת תורם אנושי, כמו גם33. לבסוף, הן הבטיחות והן היעילות של הגישה הוערכו ב- vivo בשלושה מינים שונים שעבורם הותאם הפרוטוקול: עכבר, חולדה וארנב. במערך הקליני, ביופסיה קשתית תיקצר מהחולה ותאי IPE יהיו מבודדים ומודבקים בחדר הנקי, לפני שהתאים יושתלו בעדינות בחזרה לאותו חולה. התהליך כולו יתקיים במהלך מפגש כירורגי יחיד הנמשך כ-60 דקות. פיתוח גישת הטיפול והערכת יעילותה ביקשו מודלים מצוינים במבחנה ובאקס ויוו ליישום שיטות אספקתגניםחזקות ויעילות, לניתוח יעילות אספקת הגנים, ייצור חלבונים טיפוליים ואפקטים נוירו-הגנתיים, ולייצר השתלות תאים כדי לבחון את הגישה ב- vivo1,24,25,29,30 . ראוי להזכיר כי לטיפול יש את האישור האתי לניסוי שלב קליני Ib/ IIa מהוועדה האתית לחקר קנטון ז'נבה (מס '2019-00250) וכיום הנתונים הטרום קליניים האחרונים המבוקשים לאישור על ידי רשויות הרגולציה השוויצרית נאספים באמצעות הפרוטוקול המוצג. בהקשר זה, נתונים פרה קליניים ב- vivo הראו ירידה משמעותית CNV ובטיחות מעולה24,25,31.

כאן, הבידוד והתרבות של תאי RPE / IPE מפקעת בקר, חזיר, ארנב, חולדה ועכבר, והשימוש במערכת טרנספוסון SB100X אינטגרטיבית בשילוב עם אלקטרופורציה כשיטת אספקת גנים יעילה מתואר. במיוחד, תאי PE ראשוניים הועברו לדיכוי יתר של PEDF ו- GM-CSF. האוסף של פרוטוקולים אלה מאפשר את המחקרים במבחנה ובמחקרי ויוו להתבצע בכל השלבים הטרום קליניים של פיתוח ATMP. יתר על כן, ההקמה יש פוטנציאל להיות מותאם לגנים אחרים של עניין ומחלות.

Protocol

הפרוטוקולים שבהם היו מעורבים בעלי חיים בוצעו על ידי אנשי צוות מוסמכים ולאחר אישור על ידי Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale של ז'נבה, שוויץ, ועל פי הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר אופטלמי וחזון (אישור לא. GE/94/17). חולדות חום נורווגיה בריא למבוגרים, עכברי C57BL/6, וארנבות לבנים ניו זילנד הומתו על ידי מנת יתר של Pentobarbital (150 מ"ג/ קילוגרם) מדולל ב 0.9% NaCl מוזרק intraperitoneal והעיניים היו enucleated מיד לאחר ההקרבה. עיני חזיר ובור הושגו מבית מטבחיים מקומי תוך 6 שעות מהקרבה והועברו למעבדה על הקרח.

1. לפני ההכנה

  1. הכן מדיום מלא (DMEM /Ham's F12 בתוספת סרום בקר עוברי 10%(FBS), פניצילין 80 U/mL / 80 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 2.5 מיקרוגרם / mL amphotericin B). מחממים את המדיום, 1x PBS, ו 0.25% טריפסין (במידת הצורך) באמבט מים 37 °C (37 °C).
  2. שים וילון סטרילי לתוך מכסה המנוע כדי להכין מקום עבודה אספטי. הציגו את כל המכשירים והחומרים הסטריליים הדרושים בתוך מכסה המנוע.
    הערה: רק את enucleation של העיניים וניקוי של רקמת השריר הנותרים ואת העור הם ההליכים המבוצעים מחוץ למכסה המנוע, את שאר השלבים חייב להתבצע בתוך מכסה המנוע.

2. בידוד של תאי PE עכבר /עכבר

  1. השתמש במספריים מעוקלים ומלקחיים קוליבריים כדי להכשיר את העיניים לאחר המתת חסד של החיה. נקו את רקמת השריר והעור הנותרים מהעיניים באמצעות מספריים ומלקחיים (לא סטריליים).
    הערה: גודל המספריים והמלקחיים המשמשים להסתמכות ולניקוי העיניים תלוי במינים (למשל, עבור חולדה ועכבר המכשירים יהיו קטנים יותר מאלה המשמשים לחזירים ובקר) (ראו איור S1).
    1. לאסוף את העיניים בצינור 50 מ"ל מלא PBS לא סטרילי ולהעביר את הצינור למכסה המנוע זרימה למינאר. לחטא את העיניים על ידי שקוע במשך 2 דקות בתמיסה על בסיס יוד, ולאחר מכן להעביר אותם צלחת פטרי מלא PBS סטרילי.
  2. פתיחת הנורה
    1. לאחר העברת העיניים לצלחת פטרי סטרילית, להחזיק אחד קרוב מאוד לעצב הראייה עם קוליברי או מלקחיים מחודדים. ניקוב חור ליד הגבול של הקשתית (בין pars plana ו ora serrata) עם מחט 18 G. הכנס מספריים קטנים לחור וחתוך סביב הקשתית. מוציאים את החלק החלק החלק התחתון (קרנית, עדשה ואיריס) ומניחים אותו בצלחת פטרי. השאירו את הנורה עם הזכות עד שתאי RPE מבודדים.
  3. בידוד של תאי IPE
    1. הסר את העדשה ועם מלקחיים עדינים בעדינות לשלוף הקשתית המכילה את תאי IPE. מניחים את הקשתית בצלחת פטרי, לשטוף עם PBS סטרילי ולהשאיר אותו PBS עד קשתית יותר מוכנים.
    2. חזור על שלבים 2.2.1 עד 2.3.1 כדי שכל העיניים יהיו מוכנות באותו יום.
    3. הוסף 50 μL של 0.25% טריפסין לכל קשתית ודגרה במשך 10 דקות ב 37 °C (50 °F). הסר טריפסין, להוסיף 150 μL של מדיום מלא לכל קשתית ולגרד את IPE בעדינות עם פיפטה פסטר מלוטש אש שטוח; השתמש במלקחיים עדינים כדי לשתק את הרקמה. לאסוף את ההשעיה התא ולשים בצינור 1.5 מ"ל. השתמש 10 μL של השעיית התא מדולל 1:3 עם כחול טריפן לספור את התאים בתא Neubauer34,35.
    4. אם לא מועברים מיד, זרעו 200,000 תאים/באר בלוח של 24 בארות (100,000 תאים/ס"מ2)ב-1 מ"ל של מדיום מלא (10% FBS) (לזריעה ראו טבלה 1). מניחים את הצלחת באינקובטור ותרבות זה ב 37 °C (5°F), 5% CO2.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לאגד מספר עיניים יחד כדי שיהיו מספיק תאים לזרוע.
  4. בידוד של תאי RPE
    1. הסר הומור ורשתית הזגג מהקטע האחורי עם מלקחיים דקים. הימנע מפגיעה באפיתל הפיגמנט ברשתית.
    2. חותכים את הקטע לשניים עם אזמל #10 כדי שהגלובוס יהיה פתוח לחלוטין ולשטוף עם PBS סטרילי.
    3. הוסף 50 μL של 0.25% טריפסין לכל עין ודגרה במשך 10 דקות ב 37 °C (50 °F). הסר טריפסין ולהוסיף 150 μL של מדיום מלא לכל כדור ולגרד את תאי RPE בעדינות עם אזמל עגול; השתמש במלקחיים עדינים כדי לשתק את הרקמה. לאסוף את השעיית התא ולשים אותו בצינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL של השעיית התא; לדלל 1:4 עם כחול טריפן לספור את התאים בתא Neubauer.
    4. ראה שלב 2.3.4.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לאגד מספר עיניים יחד כדי שיהיו מספיק תאים לזרוע.

3. בידוד של תאי PE ארנב

  1. בצע ניקוי וחיטוי כמתואר בשלבים 2.1 עד 2.1.1.
  2. שים עין אחת על דחיסת גזה סטרילית והחזק אותה בחוזקה קרוב לעצב הראייה. פתח את העין עם האזמל #11 ומספריים על 2 מ"מ מתחת ללימבוס. מוציאים את החלק החלק החלק התחתון (קרנית, עדשה ואיריס) ומניחים אותו בצלחת פטרי. השאירו את הנורה עם הזכות עד שתאי RPE מבודדים.
  3. בידוד של תאי IPE
    1. בצע את שלב 2.3.1. הסר את הגוף ciliary מן הקשתית על ידי חיתוך עם אזמל #10.
    2. לאחר הכנת 2 קשתית, דגירה עם 1 מ"ל של 0.25 % טריפסין ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות; במהלך תקופה זו, ניתן לבודד את תאי RPE (ראה שלב 3.4). הסר את טריפסין ולהוסיף 1 mL מדיום מלא לקשית ולבודד את התאים על ידי גירוד בזהירות עם פיפטה פסטר מלוטש אש שטוחה. resuspend התאים בזהירות על ידי pipetting ולהעביר את השעיית התא לתוך צינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL של השעיית התא לדלל 1:3 עם כחול טריפן לספור את התאים בתא Neubauer.
    3. ראה שלב 2.3.4.
  4. בידוד של תאי RPE
    1. בצע את שלב 2.4.1.
    2. שים גזה סטרילית לתוך צלחת 12 טוב ולשים את הנורה על הגזה.
    3. לשטוף עם PBS ולבצע שלב 2.4.3.
      הערה: השתמש בצינור פסטר מעוקל מלוטש.
    4. צנטריפוגות התאים 10 דקות ב 120 x g.
    5. ראה שלב 2.3.4.

4. בידוד של תאי PE חזיר

  1. בצע ניקוי כמתואר בשלב 2.1. יש לשטוף עם PBS ולחטא את העיניים על ידי טביעה למשך 2 דקות בתמיסה על בסיס יוד, לשטוף עם PBS. המשך בשלב 3.2.
  2. בידוד של תאי IPE
    1. בצע את שלב 3.3.1. לאחר הכנת 2 קשתית, להוסיף 1 מ"ל של מדיום מלא ולבודד את התאים על ידי גירוד בזהירות עם פיפטה פסטר מלוטש אש שטוחה. העבר את ההשעיה התאית לתוך צינור 1.5 מ"ל. קח 10 μL של השעיית התא לדלל 1:4 עם כחול טריפן לספור את התאים בתא Neubauer.
    2. ראה שלב 2.3.4.
  3. בידוד של תאי RPE
    1. בצע את שלב 2.4.1. מניחים את הנורה בצלחת פטרי ושטיפים עם PBS. מלא את הנורה עם 1 מ"ל בינוני מלא.
    2. באמצעות פיפטת פסטר מלוטשת מלוטשת, הסר בזהירות תאי RPE. הקפידו לגרד מלמטה למעלה כדי להימנע מהחלקה למטה של קומפלקס הממברנה של הכורואיד-ברוך. לאסוף את ההשעיה התא בתוך הנורה באמצעות 1,000 μL pipette ולהעביר לתוך צינור 1.5 מ"ל עבור resuspension. קח 10 μL של השעיית התא לדלל 1:8 עם כחול טריפן לספור את התאים בתא Neubauer.
    3. ראה שלב 2.3.4.

5. בידוד של תאי PE שור

  1. בצע ניקוי כמתואר בשלב 2.1. יש לשטוף עם PBS ולחטא את העיניים על ידי טביעה למשך 2 דקות בתמיסה על בסיס יוד, לשטוף עם PBS. המשך בשלב 3.2.
  2. בידוד של תאי IPE
    1. בצע את שלב 3.3.1. לאחר הכנת שתי קשתית, דגירה עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות. במהלך תקופה זו, ניתן לבודד את תאי RPE (ראה שלב 5.3).
    2. הסר את טריפסין ולהוסיף 2 מ"ל מדיום מלא לקשית ולבודד את התאים על ידי גירוד בזהירות עם פיפטה פסטר מלוטש אש שטוחה. העבר את ההשעיה התאית לתוך צינור 15 מ"ל. צנטריפוגות התאים 10 דקות ב 120 x g. קח 10 μL של השעיית התא לדלל 1:4 עם כחול טריפן לספור את התאים בתא Neubauer.
    3. אם לא מועבר מיד, זרע 320,000 תאים / גם בצלחת 6-well ב 3 מ"ל של מדיום מלא (10% FBS) (עבור זריעה ראה טבלה 1). מניחים את הצלחת באינקובטור ותרבות זה ב 37 °C (5°F), 5% CO2.
  3. בידוד של תאי RPE
    1. בצע את שלב 2.4.1. מניחים את הנורה בצלחת פטרי ושטיפים עם PBS. לאחר הכנת 2 עיניים למלא את הנורה על 3/4 עם טריפסין ודגרה במשך 25 דקות ב 37 °C (50 °F) עם המכסה של צלחת פטרי על גבי bulbi.
    2. הסר את טריפסין ולהוסיף 1 מ"ל בינוני מלא. בצע את שלב 4.3.2. צנטריפוגות התאים 10 דקות ב 120 x g.
    3. ראה שלב 5.2.3.

6. טיפוח - שינוי בינוני

  1. תרבית התאים ב- F12 של DMEM / Ham, בתוספת 10% FBS, פניצילין 80 U / mL / 80 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 2.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B, ב 37 ° C ו 5% CO2 בחממה לחה. לאחר 3-4 ימים pipette למעלה ולמטה כדי לאסוף תאים שאינם דבקים ולשים מחצית הנפח בבאר אחרת. מלא עד 1 מ"ל עם מדיום מלא.
    הערה: הדבר מאפשר משטח גדול מספיק עבור כל התאים המבודדים כדי לחבר ולמקסם את הפלט.
  2. לאחר 3-4 ימים נוספים לחזור על אוסף התאים אבל הפעם על ידי איגום התאים שאינם דבקים משתי בארות לתוך באר אחת (למשל, A1 + B1 ב C1). מוסיפים בינוני לכל בארות. שים לב לתאים ולשנות את המדיום 2 פעמים בשבוע (עבור 6 ו 24-טוב לוחות להשתמש 3 ו 1 מ"ל / טוב, בהתאמה). כאשר תאים מגיעים למפגש, עבור למדיום מלא עם 1% FBS או השתמש בתאים לניסויים (לדוגמה, טרנספקטציה).
    הערה: תאי RPE ו- IPE הם מפגש לאחר 3-4, ו 4-5 שבועות לאחר הבידוד, בהתאמה. טוהר תרבית התא אומת בבדיקת מורפולוגיית התא (תאים פיגמנטיים) וסמנים ספציפיים כפי שתואר על ידי ג'ונן ועמיתיו36.

7. אלקטרופורציה של תאי PE ראשוניים

  1. בצע אלקטרופורציה כמתואר לפני1,37.
  2. בהתאם למספר התאים שהודבקו השתמש 6-, 24- או 48-באר צלחות (ראה טבלה 2) כדי לזרוע את התאים בינוני ללא אנטיביוטיקה או תרופות אנטי ממיקוטיקה. במשך השבועיים הבאים להוסיף טיפות עם פניצילין המכיל בינוני (80 U /mL), סטרפטומיצין (80 מיקרוגרם / מ"ל), ואמפוטריצין B (2.5 מיקרוגרם / מ"ל) פעמיים בשבוע. החליפו את המדיום לחלוטין שבועיים לאחר ההדבקה.
  3. כדי לקבוע את צמיחת התאים, יעילות ההדבקה והפרשת החלבון, נטר את התאים מדי שבוע באמצעות מיקרוסקופיה ונתח את תרבית התאים supernatant על ידי כתם מערבי. לפני סיום התרבות, יש ליטול תרבית תאים של 24 שעות כדי לכמת הפרשת חלבונים על-ידי ELISA, לספור את התאים, למדוד פלואורסצנטיות לפי ציטומטריה מבוססת תמונה (במקרה של תאים שהודבקו בוונוס)בעקבות הוראות היצרנים (ראו טבלה של חומרים),ולאסוף את גלולה התא לניתוח ביטוי גנים מבוסס RT-qPCR.
    הערה: שיטות אלה אינן כלולות בעיתון הנוכחי שכן אין זה במטרה להסביר בפירוט את ניתוח התאים אלא את בידודם. צפיפות זריעת התאים זהה לכל המינים (100,000 תאים/ס"מ2)אך מכיוון שמספר התאים המבודדים משתנה, נעשה שימוש בלוחות שונים. בנוסף, עבור עכברים, חולדה, ארנב זה עשוי להיות נחוץ לאגד 2-3 עיניים יש מספיק תאים לזרוע.
מיניםטיפול טריפסיןתאי IPE של N°תאי RPE של N°צלחת לזריעה (100,000 תאים/ס"מ2)
עכבר/חולדהכן~50,000~ 150,00024 צלחות באר
ארנבכן~ 350,000~ 2,500,00024 צלחות באר
חזירלא~ 1,000,000~ 3,000,00024 צלחות באר
שורכן~ 1,700,000~5,000,0006 - צלחות בארות

טבלה 1: מספר תאי PE ראשוניים מבודדים מעיניים ממינים שונים.

שםאזוראמצעי אחסוןטריפסיןאמצעי אחסון להפסקת פעולת טריפסיןצפיפות זריעה
צלחת 6-באר9.6 ס"מ רבוע3.0 מ"ל0.5 מ"ל1.0 מ"ל3x105
צלחת 24-באר2.0 ס"מ רבוע1.0 מ"ל0.2 מ"ל0.8 מ"ל5x104
צלחת 48-באר1.1 ס"מ רבוע0.5 מ"ל0.1 מ"ל0.4 מ"ל0.5-1x104

טבלה 2: נפחי תרביות תאים וצפיפות זריעה.

תוצאות

בידוד PE ממיני יונקים שונים
באמצעות הפרוטוקולים הנ"ל, תאי IPE ו- RPE בודדו בהצלחה ותרביתו מחמישה מינים שונים. מספר התאים המתקבלים מכל הליך תלוי במין ובגודל העין(טבלה 1). כפי שמוצג באיור 1, תאים מראים מורפולוגיה טיפוסית של תאי PE ופיגמנטציה (למעט תאי ארנב המוצגי?...

Discussion

לאחר שיטות סטנדרטיות כדי לבודד ותרבות תאי PE הוא היסוד בפיתוח גישות טיפול חדשות עבור מחלות ניווניות רשתית. עם הפרוטוקולים המוצגים כאן, תאי PE יכולים להיות מבודדים בהצלחה ממינים שונים ותרבית במשך תקופות ארוכות (עד כה, התרבות הארוכה ביותר נשמרה במשך שנתיים1,38); ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

תודה מגיעה לגרג סילי ואלן קונטי על הסיוע הטכני המצוין שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי הנציבות האירופית בהקשר של תוכנית המסגרת השביעית, הקרן הלאומית השוויצרית למדעים וקרן שמידר-בוהריש. Z.I. קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] ו- B.M.W. ממענק מחקר פולברייט ומלגת מצוינות ממשלתית שוויצרית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well platesCorning353043
24-well platesCorning353047
48-well platesThermoFisher Scientific150687
6-well plateGreiner7657160
BetadineMundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity AssayPromegaG9291
DMEM/Ham`s F12Sigma-AldrichD8062
Drape (sterile)Mölnlycke Health Care800530
Electroporation buffer 3P.143P Pharmaceutical
FBSBrunschwigP40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compressPROMEDICAL AG25403
NaCl (0.9%)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Needle (18G) TerumoTER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µLThermoFisher ScientificMPK1096
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000S
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Pasteur pipette (fire-polish)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
Petri dishThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Pastor et al., 2018
scarpel no. 10Swann-Morton501
scarpel no. 11Swann-Morton503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based CytometerThermoFisher ScientificT10796
Trypsin 0.25% ThermoFisher Scientific25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%Sigma-AldrichT4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

References

  1. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  2. Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
  3. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  4. Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  5. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  6. Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
  7. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  8. Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
  9. Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  10. Binder, S. . The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , 7985-7987 (2004).
  11. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
  12. Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
  13. Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
  14. Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
  17. Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  18. , . Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , (2020).
  19. Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  20. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
  21. Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
  22. Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
  23. Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
  24. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  25. Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
  26. Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , (2020).
  27. Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
  28. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  29. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  30. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
  31. Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
  32. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  33. Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  37. Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
  38. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
  39. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
  40. Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
  41. Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
  42. Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
  43. Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
  44. Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
  45. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  46. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  47. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168RPEIPEPEDFGM CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved