JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, birincil iris ve retina pigment epitel hücrelerini çeşitli memelilerden (fareler, sıçan, tavşan, domuz ve sığır) izole etmek ve transfekte etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için çeşitli kurulumlarda oküler gen tedavisi yaklaşımlarını incelemek için idealdir.

Özet

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), dünya çapında yaklaşık 30 milyon kişiyi etkileyen 60 > hastalarda körlüğün en sık nedenidir. AMD, retina pigment epitel (RPE) hücre dejenerasyonu ve ardından fotoreceptör bozulması nedeniyle retinanın fonksiyonel olarak bozulmasına yol açan çevresel ve genetik faktörlerden etkilenen çok faktörlü bir hastalıktır. İdeal bir tedavi, RPE hücre ölümünü ve fotoreceptör dejenerasyonunu önlemek için nöroprotektif faktörleri salgılayan sağlıklı RPE hücrelerinin naklini içerecektir. Fonksiyonel ve genetik benzerlikler ve daha az invaziv biyopsi olasılığı nedeniyle, dejenere RPE'nin yerine iris pigment epitel (IPE) hücrelerinin nakli önerildi. Nöroprotektif faktörlerin düşük sayıda subretinal olarak nakledilen hücre ile salgılanması, pigment epitel türevi faktör (PEDF) ve/veya granülosit makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) için kodlayan genlerle Uyuyan Güzel(SB100X)transposon aracılı transfeksiyon ile elde edilebilir. Kemirgenler, domuzlar ve sığırlar da dahil olmak üzere çeşitli türlerden RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve SB100Xaracılı transfeksiyonunu kurduk. Küreler çıkarılır ve iris ve retinaya erişmek için kornea ve lens çıkarılır. Özel yapım bir spatula kullanılarak, IPE hücreleri yalıtılmış iristen çıkarılır. RPE hücrelerini hasat etmek için, türlere bağlı olarak bir trypsin inkübasyonu gerekebilir. Daha sonra, RPE ile özelleştirilmiş spatula kullanılarak, hücreler orta olarak askıya alınır. Tohumlamadan sonra, hücreler haftada iki kez izlenir ve izdihama ulaştıktan sonra elektroporasyon ile transkripsiyon. Gen entegrasyonu, ekspresyonu, protein salgılanması ve fonksiyonu qPCR, WB, ELISA, immünofluoresans ve fonksiyonel tahliller ile doğrulandı. Türlere bağlı olarak, göz başına 30.000-5 milyon (RPE) ve 10.000-1.5 milyon (IPE) hücre izole edilebilir. Genetiği değiştirilmiş hücreler, oksidatif stresi azaltma kapasitesine sahip önemli PEDF/GM-CSF aşırı ekspresyonu gösterir ve oküler gen tedavisi yaklaşımları geliştirmek için insanlara aktarılabilir ex vivo analizleri ve in vivo çalışmalar için esnek bir sistem sunar.

Giriş

Grubumuz, nöroretinal dejenerasyon, yani AMD'yi RPE ve IPE tabanlı viral olmayan gen tedavisi ile tedavi etmek için rejeneratif yaklaşımların geliştirilmesine odaklanmaktadır. Bu tür tedavilerin klinik öncesi kurulması, insana aktarılabilir in vitro modelleri gerektirir. Bu nedenle, burada sunulan çalışmanın amacı, birincil RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu, kültürü ve genetik mühendisliği için protokoller sunmaktır. PE hücrelerinin birden fazla türden izolasyonunu belirlemenin gerekçesi, yaklaşımın güvenliğini ve verimliliğini sağlam bir şekilde onaylamak ve tekrarlanabilirliğini ve aktarılabilirliğini artırmaktır. Mevcut insan RPE hücre hattı ARPE-19 birincil hücrelerden farklıdır (örneğin, daha az pigmentlidirler) ve bu nedenle, klinik öncesi analizler için sadece sınırlıdeğerdedir 1. Ek olarak, insan olmayan memeli hücreleri daha az maliyetle ve daha büyük miktarlarda satın alınabilir; insan donör dokusu çeşitli Göz Bankalarından elde edilebilir, ancak kullanılabilirliği sınırlı ve pahalıdır. Son olarak, yeni İleri Terapi Tıbbi Ürünlerinin (ATMP, yani hücre, doku veya Gen Terapisi Tıbbi Ürünü) hastalarda test edilmeden önce en az iki farklı türde uygulanması gerekir ve bu in vivo çalışmalar allojenik hücre nakillerinin hazırlanmasını talep eder.

Retinal nörodejeneratif hastalıklar, AMD gibi yaygın hastalıkların yanı sıra retina hücre ölümünün sonunda körlüğe yol açtığı retinitis pigmentosa gibi nadir hastalıklardan oluşan endüstriyel ülkelerde körlüğün önde gelen nedenidir. RPE hücreleri, fotoreceptör ve retinal ganglion hücreleri (RGC) hasarı bazı durumlarda yavaşlatılabilir, ancak şu anda iyileştirici tedavi yoktur. ATMP'ler gen kusurlarını düzeltme, terapötik genleri entegre etme veya dejenere hücreleri değiştirme potansiyeli sunar, böylece AMD gibi hastalıklar için rejeneratif ve iyileştirici tedavilerin geliştirilmesini sağlar; RPE65 mutasyonu ile ilişkili retina dejenerasyonu 2,3tedavisi de dahil olmak üzere13gen tedavisi zaten pazarlama onayı aldı. Yaşlı yetişkinler arasında (>60 yıl), dünya çapında yaklaşık 30 milyon kişi neovasküler (nvAMD) veya avasküler (aAMD) AMD4'denetkilenir. Her iki form da oksidatif hasar, fonksiyon bozukluğu ve RPE hücrelerinin kaybı ve ardından fotoreceptör bozulması dahil olmak üzere yaşa bağlı tetikleyiciler tarafından indüklenir, diğerleri arasında (örneğin genetik risk alelleri, sigara, hipertansiyon)5,6. NvAMD'de patogenez, koroidal neovaskülarizasyona (CNV) neden olan anjiyojenik Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) lehine anjiyojenik ve anti-anjiyojenik faktörlerin dengesizliği ile ağırlaşır. Bugüne kadar, sadece nvAMD, CNV'yi bastırmak için VEGF proteininin inhibitörlerinin aylık intravitreal enjeksiyonları ile tedavi edilebilir; aAMD6,7için henüz etkili bir tedavi mevcut değildir.

Çeşitli çalışmalar anti-VEGF tedavisinin yerini almak için hücre bazlı tedavileri değerlendirdi: nAMD8,9,10ile hastalara taze hasat edilen otolog RPE hücrelerinin nakledildiği Binder ve ark. Son zamanlarda, bir faz I klinik çalışması AMD'yi umut verici sonuçlarla tedavi etmek için embriyonik kök hücre türevi bir RPE yaması kullandı; yani, tedavi edilen 10 hastanın 2'sinde 12 aya kadar RPE yamasının etkinliği, stabilitesi ve güvenliği11. Ek olarak, birkaç grup otolog RPE-Bruch'un membran-koroid yamalarının periferik retinadan toplandığını ve makula12 , 13,14'e nakledildiği çalışmalar yayınladı; ve transplantasyon için indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi RPE yamaları oluşturulmuştur15. AAMD için, kompleman yolunu hedefleyen antikorlar klinik çalışmalarda test edilmiştir6,16 ve coğrafi atrofisi (GA) olan hastalarda CD59 (AAVCAGsCD59) faktörü için geni kodlayan adeno ilişkili viral (AAV) vektörün tek bir intravitreal enjeksiyonu kullanılarak yapılan bir faz I çalışmasıtamamlanmıştır 17; faz II çalışması yakın zamanda başlamış ve ileri aAMD'li 132 hastayı işe almayı ve sonucu 2 yıllık müdahale sonrası18yaşında değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Son olarak, FocuS çalışma grubu, bir insan tamamlayıcı faktörünü kodlayan bir rekombinant çoğalmayan AAV vektörün güvenliğini, doz yanıtını ve etkinliğini değerlendiren bir faz I / II çok merkezli klinik çalışma başlattı19.

Öncelikle, rejeneratif bir AMD tedavisinin amacı, hasar görmüş veya kaybolmuş fonksiyonel RPE hücrelerinin naklidir. Bununla birlikte, IPE ve RPE hücreleri birçok fonksiyonel ve genetik benzerliği (örneğin, fagositoz ve retinol metabolizması) paylaşır ve IPE hücreleri daha uygun bir şekilde hasat edildiği için, RPEikame 20olarak önerilmiştir. IPE hücre naklinin hayvan modelleri21 , 22'defotoreceptör dejenerasyonunu geciktirdiğini ve son evre nvAMD'li hastalarda görme fonksiyonunu stabilize ettiği daha önce gösterilmiş olsa da, bu hastalarda anlamlı bir iyileşme gözlenmedi 23. Etkinlik eksikliği, nakledilen hücrelerin sayısının düşüklüğünden ve/veya nöroprotektif retina faktörlerinin dengesizliğinden kaynaklanabilir. Alternatif bir yaklaşım, retina homeostazını geri yüklemek, kalan RPE hücrelerini korumak ve fotoreceptörleri ve RGC'leri dejenerasyondan korumak için nöroprotektif faktörleri aşırı ifade eden transkrefected pigment epitel hücrelerinin nakledililmesi olacaktır. Sonuç olarak, PEDF, GM-CSF veya insülin benzeri büyüme faktörleri (IGF' ler) gibi nöroprotektif ve anti-anjiyojenik proteinleri salgılamak için genetik mühendislikten geçmiş fonksiyonel RPE veya IPE hücrelerinin naklini içeren yeni bir tedavi öneriyoruz. Bu yaklaşımın hücre hattı, sadece bir tür veya insan dokusu kullanmak yerine birkaç türde geliştirilmesinin ve analiz etmenin avantajı: 1) bağımsız laboratuvarlarda ve farklı türlerde gerçekleştirilen çok sayıda çalışmada gösterildiği gibi sonuçların tekrarlanabilirliğini ve aktarılabilirliğini artırmıştır1,24,25; 2) domuz veya sığır hücreleri, ek hayvanların kurban edilmeden fizibilite olarak tek kullanımlıktır; 3) özellikle domuz ve sığır hücrelerinin mevcudiyeti, büyük test serilerinin sağlam sonuçlar üretmesine izin verir; 4) çoğunlukla kullanılan modellerden hücreleri izole etme, kültür ve genetik olarak değiştirme bilgisi, birden fazla tür24 , 25,26'da in vivo analizlere olanak tanır ve böylece ilk tedavi edilen hastalar için gelişmiş bir risk-fayda oranı sunar; 5) sunulan protokolün esnekliği, çeşitli modellerde ve deneysel kurulumlarda ve genetik mühendisliği olan ve olmayan tüm oküler hücre bazlı tedavilerde kullanılmasına izin verir. Buna karşılık, hücre hatları veya insan dokusu olarak alternatif teknikler sadece sınırlı aktarilebilirlik ve/ veya sınırlı bertaraf edilebilirliktir. ARPE-19 gibi hücre hatları ön deneyler için idealdir; bununla birlikte, düşük pigmentasyon ve yüksek çoğalma birincil hücrelerden önemli ölçüde farklıdır1. İnsan donör dokusundan izole edilen RPE ve IPE hücreleri, transfer edilebilir in vitro deneyler için değerli bir kaynak sunar; bununla birlikte, insan dokusunu bir ABD-Amerikan Göz Bankası'ndan elde ediyoruz, yani doku en az iki günlük (enükleasyondan sonra) ve uzun ve pahalı bir taşıma gerektiriyor, ancak yerel donör dokusu üretken bir araştırma için yeterli miktarda mevcut değil. Birincil hücrelerin kullanımının avantajı, diğer gruplardan27,28.

NvAMD ve aAMD'yi tedavi etmek için PEDF ve/veya GM-CSF için kodlayan genlerle birincil RPE ve IPE hücrelerinin transfeksiyonu için SB100X transposon sistemini kullanan hücre bazlı viral olmayan gen tedavisinin geliştirilmesi için, sırasıyla29,30,31,32, ilk olarak ARPE-19 hücrelerinin transfeksiyonunu kurduk1 . Daha sonra, kolayca erişilebilen sığır ve porcine birincil hücrelerinde izolasyon ve transfeksiyon protokolleri oluşturulmuştur. Şimdi, küçük (fare olarak) büyük memelilerden (sığır olarak) beş farklı türden birincil RPE ve IPE hücrelerinin izolasyonu ve transfeksiyonu oluşturulmuştur. İnsan donör gözlerinden elde edilen primer RPE ve IPE hücrelerinde doğrulandı30. ATMP'nin İyi Üretim Uygulamaları (GMP) uyumlu üretimi, insan donör dokusu kullanılarak da doğrulandı33. Son olarak, yaklaşımın hem güvenliği hem de verimliliği, protokolün uyarlanmış olduğu üç farklı türde in vivo olarak değerlendirildi: fare, sıçan ve tavşan. Klinik kurulumda, hastadan bir iris biyopsisi yapılacak ve IPE hücreleri izole edilecek ve temiz odada trans enfekte edilecektir, hücreler alt olarak aynı hastaya geri nakledilmeden önce. Tüm süreç yaklaşık 60 dakika süren tek bir cerrahi seansta gerçekleşecektir. Tedavi yaklaşımının geliştirilmesi ve verimliliğinin değerlendirilmesi, sağlam ve verimli gen iletim yöntemlerini uygulamak, gen iletiminin verimliliğini, terapötik protein üretimini ve nöroprotektif etkileri analiz etmek ve yaklaşımı test etmek için hücre nakli üretmek için mükemmel in vitro ve ex vivomodelleri talep etti 1,24,25,29,30 . Terapinin Cenevre Kantonunun (no. 2019-00250) araştırılması için etik komisyondan klinik faz Ib / IIa denemesi için etik onay aldığını ve şu anda İsviçre düzenleyici makamları tarafından yetkilendirme için talep edilen son klinik öncesi verilerin sunulan protokol kullanılarak toplandığını belirtmek gerekir. Bu bağlamda, klinik öncesi in vivo veriler CNV ve mükemmel güvenlik 24,25,31'deönemli bir azalma olduğunu göstermiştir.

Burada sığır, domuz, tavşan, sıçan ve fareden RPE/IPE hücrelerinin izolasyonu ve kültürü ile etkili bir gen iletim yöntemi olarak elektroporasyon ile birlikte bütünleştirici SB100X transposon sisteminin kullanımı açıklanmıştır. Özellikle, birincil PE hücreleri aşırı ifade PEDF ve GM-CSF'ye transkripsiyon edildi. Bu protokollerin toplanması, IN VITRO ve in vivo çalışmaların ATMP gelişiminin tüm klinik öncesi aşamalarında gerçekleştirilmelerini sağlar. Ayrıca, kurulum diğer ilgi ve hastalık genlerine adapte olma potansiyeline sahiptir.

Protokol

Hayvanların dahil olduğu protokoller sertifikalı personel tarafından ve kantonel Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), İsviçre'nin Cenevre'deki Domaine de l'expérimentation hayvanı tarafından yetkilendirilmesinden sonra ve ARVO Oftalmik ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildiri'ye göre gerçekleştirildi (onay no. GE/94/17). Yetişkin sağlıklı Kahverengi Norveç sıçanları, C57BL / 6 fareler ve Yeni Zelanda beyaz tavşanları,% 0.9 NaCl enjekte edilen intraperitonealde seyreltilmiş aşırı dozda Pentobarbital (150 mg / kg) ile ötenaziye tabi tökezlendi ve gözler fedakarlıktan hemen sonra enucle edildi. Porsin ve sığır gözleri, kurban edildiktan sonraki 6 saat içinde yerel bir mezbahadan elde edildi ve buz üzerinde laboratuvara taşındı.

1. Hazırlık öncesi

  1. Komple ortam hazırlayın (DMEM/Ham'ın F12'si %10 fetal sığır serumu (FBS), 80 U/mL penisilin / 80 μg/mL streptomisin ve 2,5 μg/mL amfoterisin B ile desteklenmiştir). 37 °C'lik bir su banyosunda orta, 1x PBS ve %0,25 tripsin (gerekirse) ısıtın.
  2. Aseptik bir çalışma yeri hazırlamak için kaputa steril bir örtü koyun. Kaputun içinde gerekli tüm steril aletleri ve malzemeleri tanıtın.
    NOT: Sadece gözlerin enükleasyonu ve kalan kas dokusunun ve cildin temizlenmesi kaputun dışında yapılan işlemlerdir, adımların geri kalanı kaputun içinde yapılmalıdır.

2. Sıçan/fare PE hücrelerinin izolasyonu

  1. Hayvanı ötenaziden sonra gözleri enükle etmek için kavisli makas ve Colibri tokmakları kullanın. Kalan kas dokusunu ve cildi makas ve tostips (steril olmayan) kullanarak gözlerden temizleyin.
    NOT: Gözlerin enükleasyonu ve temizlenmesi için kullanılan makas ve forsepslerin boyutu türlere bağlıdır (örneğin, fare ve fare için aletler domuz ve sığır için kullanılanlardan daha küçük olacaktır) (bkz. Şekil S1).
    1. Gözleri steril olmayan PBS ile dolu 50 mL'lik bir tüpte toplayın ve tüpü laminer akış başlığına aktarın. Gözleri iyot bazlı çözeltiye 2 dakika batırarak dezenfekte edin, ardından steril PBS ile dolu bir Petri kabına aktarın.
  2. Ampulü açma
    1. Gözleri steril bir Petri kabına aktardıktan sonra, Colibri veya sivri tostu ile optik sinire sıkıca yakın tutun. 18 G iğne ile iris sınırına yakın bir delik açın (pars plana ve ora serrata arasında). Deliğe küçük makas yerleştirin ve irisin etrafını kesin. Ön segmenti (kornea, lens ve iris) çıkarın ve bir Petri kabına koyun. RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın.
  3. IPE hücrelerinin yalıtımı
    1. Lensi çıkarın ve ince toparlamalarla IPE hücrelerini içeren irisi hassas bir şekilde çekin. İrisi bir Petri kabına yerleştirin, steril PBS ile yıkayın ve daha fazla iris hazırlanana kadar PBS'de bırakın.
    2. O gün hazırlanacak tüm gözler için 2.2.1 ile 2.3.1 adımlarını yineleyin.
    3. İris başına % 0,25 trypsin 50 μL ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın. Tripsin çıkarın, iris başına 150 μL tam orta ekleyin ve IPE'yi düz bir ateş cilalı Pasteur pipetle hassas bir şekilde kazıyın; dokuyu hareketsiz hale getirmek için ince tokmaklar kullanın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe koyun. Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:3 trypan mavisi ile seyreltilmiş hücre süspansiyonunun10 μL'sini kullanın 34,35.
    4. Hemen transkripse, tohum 200.000 hücre/kuyu 24 kuyulu bir plakada (100.000 hücre/cm2) 1mL tam orta (%10 FBS) (tohumlama için bkz. Tablo 1). Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C, % 5 CO2'yekültür edin.
      NOT: Tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç gözü bir araya getirmek gerekebilir.
  4. RPE hücrelerinin yalıtımı
    1. İnce sıyrıklarla vitreus mizahı ve retinayı arka segmentten çıkarın. Retina pigment epitelinin zarar görmesinden kaçının.
    2. Kürenin tamamen açılması ve steril PBS ile yıkanması için segmenti 10 numaralı neşterle ikiye bölün.
    3. Göz başına %0,25 trypsin 50 μL ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin çıkarın ve dünya başına 150 μL tam orta ekleyin ve RPE hücrelerini yuvarlak bir neşterle hassas bir şekilde kazıyın; dokuyu hareketsiz hale getirmek için ince tokmaklar kullanın. Hücre süspansiyonu toplayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe koyun. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın; Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:4'i trypan mavisi ile seyreltin.
    4. Bkz. adım 2.3.4.
      NOT: Tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için birkaç gözü bir araya getirmek gerekebilir.

3. Tavşan PE hücrelerinin izolasyonu

  1. 2.1 ile 2.1.1 arasında olan adımlarda açıklandığı gibi temizlik ve dezenfeksiyon yapın.
  2. Bir gözünü steril gazlı bez kompresine koyun ve optik sinire sıkıca yakın tutun. Gözü neşter #11 ve makasla yaklaşık 2 mm limbus altında açın. Ön segmenti (kornea, lens ve iris) çıkarın ve bir Petri kabına koyun. RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakın.
  3. IPE hücrelerinin yalıtımı
    1. 2.3.1 adımlarını gerçekleştirin. Neşter #10 ile keserek siliary gövdeyi iristen çıkarın.
    2. 2 irisin hazırlanmasından sonra, 10 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 trypsin 1 mL ile kuluçkaya yatırın; bu süre zarfında, RPE hücreleri yalıtılabilir (bkz. adım 3.4). Tripsin çıkarın ve irise 1 mL tam orta ekleyin ve düz bir ateş cilalı Pasteur pipet ile dikkatlice çizerek hücreleri izole edin. Hücreleri pipetleme ile dikkatlice yeniden biriktirin ve hücre süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:3'i trippan mavisi ile seyreltin.
    3. Bkz. adım 2.3.4.
  4. RPE hücrelerinin yalıtımı
    1. 2.4.1 adımlarını gerçekleştirin.
    2. Steril bir gazlı bezi 12 kuyu tabağına koyun ve ampulü gazlı bezin üzerine koyun.
    3. PBS ile yıkayın ve 2.4.3 adımlarını gerçekleştirin.
      NOT: Kavisli ateş cilalı Pasteur pipet kullanın.
    4. Hücreleri 120 x g'da10 dakika santrifüj edin.
    5. Bkz. adım 2.3.4.

4. Domuz PE hücrelerinin izolasyonu

  1. 2.1. adımda açıklandığı gibi temizlik gerçekleştirin. PBS ile yıkayın ve iyot bazlı çözeltide 2 dakika batırarak gözleri dezenfekte edin, PBS ile durulayın. 3.2. adıma devam edin.
  2. IPE hücrelerinin yalıtımı
    1. Adım 3.3.1'i gerçekleştirin. 2 irisin hazırlanmasından sonra, 1 mL tam orta ekleyin ve düz bir ateş cilalı Pasteur pipet ile dikkatlice çizerek hücreleri izole edin. Hücre süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:4 trypan mavisi ile seyreltin.
    2. Bkz. adım 2.3.4.
  3. RPE hücrelerinin yalıtımı
    1. 2.4.1 adımlarını gerçekleştirin. Ampulü bir Petri kabına yerleştirin ve PBS ile yıkayın. Ampulü 1 mL komple orta ile doldurun.
    2. Kavisli ateş cilalı pasteur pipet kullanarak, RPE hücrelerini dikkatlice çıkarın. Koroid-Bruch'un zar kompleksinden aşağı kaymamak için alttan yukarıya doğru kazıyın. 1.000 μL pipet kullanarak ampul içindeki hücre süspansiyonunu toplayın ve resüspensiyon için 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:8'i trypan mavisi ile seyreltin.
    3. Bkz. adım 2.3.4.

5. Sığır PE hücrelerinin izolasyonu

  1. 2.1. adımda açıklandığı gibi temizlik gerçekleştirin. PBS ile yıkayın ve iyot bazlı çözeltide 2 dakika batırarak gözleri dezenfekte edin, PBS ile durulayın. 3.2. adıma devam edin.
  2. IPE hücrelerinin yalıtımı
    1. Adım 3.3.1'i gerçekleştirin. İki irisin hazırlanmasından sonra, 10 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 trypsin 2 mL ile kuluçkaya yatırın. Bu süre zarfında, RPE hücreleri yalıtılabilir (bkz. adım 5.3).
    2. Tripsin çıkarın ve irise 2 mL tam orta ekleyin ve düz bir ateş cilalı Pasteur pipet ile dikkatlice çizerek hücreleri izole edin. Hücre süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 120 x g'da10 dakika santrifüj edin. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 1:4 trypan mavisi ile seyreltin.
    3. Hemen transfected değilse, tohum 320.000 hücre / kuyu 3 mL tam orta (10% FBS) 6 kuyulu bir plakada (tohumlama için bkz. Tablo 1). Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 °C, % 5 CO2'yekültür edin.
  3. RPE hücrelerinin yalıtımı
    1. 2.4.1 adımlarını izleyin. Ampulü bir Petri kabına yerleştirin ve PBS ile yıkayın. 2 göz hazırlanmasından sonra ampulü yaklaşık 3/4 trypsin ile doldurun ve bulbinin üstünde petri kabının kapağı ile 37 ° C'de 25 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. Tripsin çıkarın ve 1 mL komple orta ekleyin. 4.3.2 adımlarını gerçekleştirin. Hücreleri 120 x g'da10 dakika santrifüj edin.
    3. Bkz. adım 5.2.3.

6. Yetiştirme - orta değişim

  1. DMEM/Ham'ın F12'sinde% 10 FBS, 80 U / mL penisilin / 80 μg / mL streptomisin ve 2.5 μg / mL amfoterisin B ile desteklenmiş hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de nemli bir inkübatörde kültürlendirin. 3-4 gün sonra pipet yukarı ve aşağı yapışmayan hücreleri toplamak ve hacmin yarısını başka bir kuyuya koymak için. Tam orta ile 1 mL'ye kadar doldurun.
    NOT: Bu, yalıtılmış tüm hücrelerin çıkışı takıp en üst düzeye çıkartacak kadar büyük bir yüzeye sahip olmasını sağlar.
  2. 3-4 gün sonra hücre koleksiyonunu tekrarlayın, ancak bu sefer yapışmayan hücreleri iki kuyudan bir kuyuya (örneğin, C1'deki A1 +B1) bir arada toplayarak. Tüm kuyulara orta ekleyin. Hücreleri gözlemleyin ve ortamı haftada 2 kez değiştirin (6 ve 24 kuyu plakaları için sırasıyla 3 ve 1 mL / kuyu kullanın). Hücreler birleştiğinde, %1 FBS ile komple ortama geçin veya deneyler için hücreleri kullanın (örneğin, transfeksiyon).
    NOT: RPE ve IPE hücreleri sırasıyla 3-4 ve izolasyondan 4-5 hafta sonra bir arayadır. Hücre kültürü saflığı, Johnen ve meslektaşları tarafından açıklandığı gibi hücre morfolojisi (pigmentli hücreler) ve spesifik belirteçler kontrol ederek doğrulandı36.

7. Birincil PE hücrelerinin elektroporasyon

  1. 1,37'denönce açıklandığı gibi elektroporasyon gerçekleştirin.
  2. Transfected hücre sayısına bağlı olarak, hücreleri antibiyotik veya antimycotics olmadan ortamda tohumlamak için 6, 24veya 48 kuyu plakaları kullanın (bkz. Tablo 2). Takip eden 2 hafta boyunca haftada iki kez penisilin (80 U/mL), streptomisinin (80 μg/mL) ve amfoterisilin B (2,5 μg/mL) içeren orta içeren damlalar ekleyin. Transfeksiyondan 2 hafta sonra ortamı tamamen değiştirin.
  3. Hücre büyümesini, transfeksiyon verimliliğini ve protein salgısını belirlemek için, hücreleri haftalık olarak mikroskopi ile izleyin ve batı lekesi ile hücre kültürü üstnatantını analiz edin. Kültürün sonlandırılmasından önce, ELISA ile protein salgısını ölçmek, hücreleri saymak, floresanları görüntü tabanlı sitometri ile ölçmek (Venüs-transfected hücreleri durumunda) üreticilerin talimatlarını izleyerek (bkz. Malzeme Tablosu)24 saat hücre kültürü üstnatantı alın ve RT-qPCR tabanlı gen ekspresyon analizi için hücre peletini toplayın.
    NOT: Hücrelerin analizini ayrıntılı olarak açıklamak değil, izolasyonlarını açıklamak amaç olduğundan, bu yöntemler mevcut makalede yer almamaktadır. Hücre tohumlama yoğunluğu tüm türler için aynıdır (100.000 hücre/cm2)ancak izole hücrelerin sayısı değiştiğinden farklı plakalar kullanılmıştır. Ek olarak, fareler, sıçan ve tavşan için tohumlama için yeterli hücreye sahip olmak için 2-3 göz havuzu gerekebilir.
TürTrypsin tedavisiN° IPE hücreleriN° RPE hücreleriTohumlama plakası (100.000 hücre/cm2)
Fare/sıçanEvet~50.000~150.00024 kuyulu tabaklar
TavşanEvet~350.000~2.500.00024 kuyulu tabaklar
DomuzHayır~1.000.000~3.000.00024 kuyulu tabaklar
SığırEvet~1.700.000~5.000.0006 kuyulu tabaklar

Tablo 1: Farklı türlerden gözlerden izole edilmiş birincil PE hücrelerinin sayısı.

AdAlanBirim ortamıTrypsinTrypsin'in eylemini durdurmak için hacim ortamıTohumlama yoğunluğu
6 kuyulu tabak9,6 cm²3,0 mL0,5 mL1,0 mL3x105
24 kuyulu tabak2,0 cm²1,0 mL0,2 mL0,8 mL5x104
48 kuyu plakası1,1 cm²0,5 mL0,1 mL0,4 mL0,5-1x104

Tablo 2: Hücre kültürü hacimleri ve tohumlama yoğunlukları.

Sonuçlar

Farklı memeli türlerinden PE izolasyonu
Yukarıda belirtilen protokoller kullanılarak, IPE ve RPE hücreleri beş farklı türden başarıyla izole edildi ve kültürlendi. Her işlemden elde edilen hücre sayısı gözün türüne ve büyüklüğüne bağlıdır (Tablo 1). Şekil 1'degösterildiği gibi, hücreler tipik PE hücre morfolojisi ve pigmentasyonunu gösterir (gösterilen tavşan hücreleri hariç, albino Yeni Zelanda Beyazı (NZW) tavşanl...

Tartışmalar

PE hücrelerini izole etmek ve kültüre etmek için standart yöntemlere sahip olmak, retina dejeneratif hastalıklar için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için temeldir. Burada sunulan protokoller ile PE hücreleri farklı türlerden başarıyla izole edilebilir ve uzun süre kültürlenebilir (şimdiye kadar en uzun kültür 2 yıl boyunca korundu1,38); tipik PE hücre morfolojisi, pigmentasyonu ve fonksiyonu gözlenmiştir (Şek...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Gregg Sealy ve Alain Conti'ye mükemmel teknik yardımları için bir teşekkürü hak ediyor. Bu çalışma Avrupa Komisyonu tarafından Yedinci Çerçeve Programı, İsviçre Ulusal Bilimler Vakfı ve Schmieder-Bohrisch Vakfı bağlamında desteklenmiştir. Z.I., Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] ve B.M.W.'den Fulbright Araştırma Hibesi ve İsviçre Hükümeti Mükemmellik Bursu'ndan fon aldı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well platesCorning353043
24-well platesCorning353047
48-well platesThermoFisher Scientific150687
6-well plateGreiner7657160
BetadineMundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity AssayPromegaG9291
DMEM/Ham`s F12Sigma-AldrichD8062
Drape (sterile)Mölnlycke Health Care800530
Electroporation buffer 3P.143P Pharmaceutical
FBSBrunschwigP40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compressPROMEDICAL AG25403
NaCl (0.9%)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Needle (18G) TerumoTER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µLThermoFisher ScientificMPK1096
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000S
Neubauer chamberMarienfeld-superior640010
Pasteur pipette (fire-polish)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
Petri dishThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)Pastor et al., 2018
scarpel no. 10Swann-Morton501
scarpel no. 11Swann-Morton503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based CytometerThermoFisher ScientificT10796
Trypsin 0.25% ThermoFisher Scientific25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%Sigma-AldrichT4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

Referanslar

  1. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  2. Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
  3. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  4. Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020)
  5. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  6. Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
  7. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  8. Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
  9. Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  10. Binder, S. . The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , 7985-7987 (2004).
  11. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
  12. Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
  13. Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
  14. Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
  15. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  16. Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
  17. Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  18. , . Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , (2020).
  19. Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , (2019).
  20. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
  21. Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
  22. Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
  23. Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
  24. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  25. Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
  26. Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , (2020).
  27. Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
  28. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  29. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  30. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
  31. Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
  32. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  33. Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
  34. . Marienfeld Technical information Neubauer-improved Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020)
  35. . Neubauer Haemocytometry Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020)
  36. Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  37. Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
  38. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
  39. Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
  40. Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
  41. Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
  42. Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
  43. Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
  44. Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
  45. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  46. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  47. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 168ok ler gen tedavisiretina dejenerasyonuRPE h creleriIPE h crelerih cre izolasyonuUyuyan G zel transposonviral olmayan gen tedavisiPEDFGM CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır