非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

要約

ここでは、種々の哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ)から一次虹彩および網膜色素上皮細胞を単離およびトランスフェクトするプロトコルが提示される。この方法は、ヒトに移管可能なエクスビボ分析およびインビボ研究のための様々なセットアップにおける眼遺伝子治療アプローチを研究するのに理想的である。

要約

加齢黄斑変性症(AMD)は、患者>60年の失明の最も頻繁な原因であり、世界中で約3000万人に影響を及ぼします。AMDは環境や遺伝的要因の影響を受ける多因子性疾患であり、網膜色素上皮(RPE)細胞の変性に続いて感光体分解による網膜の機能障害を引き起こします。理想的な治療法には、RPE細胞死および感光体変性を防ぐために神経保護因子を分泌する健康なRPE細胞の移植が含まれる。機能的および遺伝的類似性と、より侵襲性の低い生検の可能性のために、虹彩色素上皮(IPE)細胞の移植が退化したRPEの代用として提案された。低い数の網膜移植細胞による神経保護因子の分泌は、睡眠美容(SB100X)、色素上皮由来因子(PEDF)および/または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をコードする遺伝子を用いたトランスポゾン媒介性トランスフェクションによって達成することができる。げっ歯類、豚、牛など様々な種のRPE細胞とIPE細胞の分離、培養、SB100X媒介トランスフェクションを確立しました。地球儀は植え付けされ、角膜とレンズは虹彩と眼炎にアクセスするために除去される。カスタムメイドのヘラを使用して、IPE細胞は単離された虹彩から除去される。RPE細胞を収穫するには、種に応じてトリプシンインキュベーションが必要になることがあります。次いで、RPEカスタマイズされたヘラを使用して、細胞を培地に懸濁させる。播種後、細胞を週2回監視し、合流に達した後、エレクトロポレーションによってトランスフェクトする。遺伝子の一体化、発現、タンパク質分泌、および機能は、qPCR、WB、ELISA、免疫蛍光、および機能アッセイにより確認された。種に応じて、30,000-5百万(RPE)および10,000-150万(IPE)細胞を1眼で単離することができます。遺伝子組み換え細胞は、酸化ストレスを軽減する能力を持つ重要なPEDF/GM-CSF過剰発現を示し、遺伝子治療アプローチを開発するためにヒトに移入可能なex vivo分析および生体内研究のための柔軟なシステムを提供する。

概要

我々のグループは、RPEおよびIPEベースの非ウイルス遺伝子治療による神経レチン系変性、すなわちAMDを治療するための再生アプローチの開発に焦点を当てている。このような治療法の前臨床確立は、ヒトに移管可能な 体外モデルで 必要とされる。したがって、ここで示す研究の目的は、一次RPEおよびIPE細胞の分離、培養、および遺伝子工学のためのプロトコルを提供することです。複数の種からPE細胞を単離する根拠は、アプローチの安全性と効率を強固に確認し、その再現性と移動性を高めることです。利用可能なヒトRPE細胞株ARPE-19は、一次細胞とは異なり(例えば、それらは、あまり色素沈着性)であり、したがって、臨床前の分析^のための限られた値の1。さらに、非ヒト哺乳類細胞は、より少ないコストで、より大きな量で購入することができます。ヒトドナー組織は様々なアイバンクから得ることができますが、入手可能性は限られており、高価です。最後に、新しい先端治療薬品(ATMP、すなわち、細胞、組織、または遺伝子治療薬品)は、患者で試験される前に少なくとも2つの異なる種で適用する必要があり、これらの インビボ 研究は、同種細胞移植の準備を要求する。

網膜神経変性疾患は、AMDのような一般的な疾患だけでなく、網膜細胞死が最終的に失明につながる網膜色素変性症のような稀な疾患を含む先進国の失明の主な原因である。RPE細胞、光受容体、およ....

プロトコル

動物が関与したプロトコルは、認定された人員によって行われ、カントナル・デ・ラ・セクリテ、ド・ランプロイ・エ・ド・ラ・サンテ(DSES)、スイスのジュネーブのドメーヌ・ド・ラルエクスペリメンテーション動物、およびオフタルム・ビジョン研究における動物の使用に関するARVO声明(承認なし)によって承認された。GE/94/17)。成人の健康なブラウンノルウェーラット、C57BL/6マウス、ニュージーランドの白いウサギは、0.9%NaClに希釈したペントバルビタール(150mg/kg)の過剰摂取によって安楽死させ、犠牲の直後に目を欠核化した。ブタとウシの目は、犠牲の6時間以内に地元の食肉処理場から得られ、氷の上の実験室に運ばれました。

1. 準備前

1. 完全な培地(DMEM/ハムのF12は10%胎児ウシ血清(FBS)、80 U/mLペニシリン/80 μg/mLストレプトマイシン、2.5 μg/mLアンホテリシンBを補充します。37°Cの水浴で、培地、1x PBS、0.25%のトリプシン(必要に応じて)を熱します。
2. 無菌の作業場所を準備するためにフードに無菌ドレープを入れてください。フード内に必要なすべての滅菌器具と材料を導入します。
   注:目の核分裂と残りの筋肉組織および皮膚の洗浄のみがフードの外側で行われる処置であり、残りのステップはフードの内部で行われなければならない。

2. ラ....

結果

異種哺乳類からのPE分離
前述のプロトコルを用いて、IPE細胞とRPE細胞を5種分から正常に単離し、培養した。各手順から得られる細胞の数は、眼の種や大きさに依存する(表1)。図1に示すように、細胞は典型的なPE細胞の形態および色素沈着を示す(示されたウサギ細胞を除く、アルビノニュージーランドホワイト(NZW)ウサギ由来である)。21日後?.......

ディスカッション

PE細胞を単離し培養するための標準化された方法を持つことは、レチン性変性疾患に対する新しい治療法の開発の基本です。ここで提示されるプロトコルでは、PE細胞は異なる種から正常に分離され、長期間培養することができます(これまで、最長の培養は2年間^1、38年維持されていました)。典型的なPE細胞形態、色素沈着および機能が観察された(<.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)