A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يجمع هذا البروتوكول بين التهجين في الموقع والتألق المناعي لتحديد جينات المستقبلات الشمية والقيلية المعبر عنها في الخلايا العصبية الحسية الشمية بعد التنشيط بواسطة المحفزات الكيميائية في الفأر.
تعتمد على الاتصالات الكيميائية لنقل المعلومات البيئية ذات الصلة وإدراكها ، بدءا من تقييم جودة الغذاء إلى اكتشاف شركاء التزاوج أو التهديدات المتاحة. في الفئران ، يتم تنفيذ هذه المهمة بشكل أساسي بواسطة نظام حاسة الشم وأنظمته الفرعية الأساسية ، بما في ذلك أنظمة حاسة الشم الرئيسية والملحقة. كلاهما لهما أعضاء طرفية مأهولة بالخلايا العصبية الحسية التي تعبر عن مستقبلات مقترنة ببروتين G قادرة على ربط الإشارات الكيميائية التي تصل إلى تجويف الأنف. على الرغم من أن الخصائص الجزيئية لهذه المستقبلات مفهومة جيدا ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن الروابط المحددة المشابهة. تجمع الطريقة الموضحة هنا بين الكشف عن التهجين في الموقع للمستقبلات الشمية أو الحمض مع الكشف المناعي عن البروتين الريبوسومي الفسفوري S6 (pS6) - علامة على تنشيط الخلايا العصبية. تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد الخلايا العصبية التي يتم تنشيطها بعد حدث واحد من التعرض لمحفزات كيميائية منقاة أو معقدة تكتشفها الأعضاء الشمية. الأهم من ذلك ، تسمح هذه التقنية بالتحقيق في الخلايا العصبية التي يتم تشغيلها في السياقات ذات الصلة بيولوجيا. من الناحية المثالية ، يجب استخدام هذه الطريقة لاستكشاف البيولوجيا الجزيئية للنظام الشمي ودراسة السلوكيات الشمية.
الإشارات الكيميائية هي أكثر أشكال الاتصال انتشارا في. في الثدييات ، يتم الكشف عن الإشارات الكيميائية بشكل أساسي من خلال حاسة الشم وهو أمر بالغ الأهمية للعثور على الطعام ، وتحديد شركاء التزاوج المحتملين ، وتجنب المفترسةالمحتملة 1،2،3. ينقسم نظام حاسة الشم بالماوس أيضا إلى أنظمة فرعية مختلفة ، لكل منها خصائصها التشريحية والفسيولوجية والجزيئية4. من بين هؤلاء ، يعد نظام حاسة الشم الرئيسي (MOS) ونظام حاسة الشم الملحقة (AOS) الأكثر دراسة على نطاق واسع وأفضل.
MOS مسؤول في الغالب عن الكشف عن الجزيئات الكيميائية المتطايرة التي تصل إلى تجويف الأنف. يتم تحقيق ذلك عن طريق الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs) ، التي تملأ الواجهة الحسية للنظام - الظهارة الشمية الرئيسية (MOE). يعبر كل OSN عن واحد من آلاف المستقبلات الشمية (ORs) بطريقة أحادية الجين وأحاديةالأليل. علاوة على ذلك ، تميل ORs إلى أن تكون مضبوطة على نطاقواسع 6 ، وقد يرتبط رائحة واحدة بأكثر من OR ، مما يولد رمزا توافقيا للروائح7.
في المقابل ، فإن AOS مسؤول بشكل أساسي عن الكشف عن الفرمون والكايرومون. تعمل هذه الروابط على تنشيط الخلايا العصبية الحسية الصوتية (VSNs) في العضو الصوتي (VNO). تعبر شبكات VSNs في المنطقة القمية عن مستقبلات VNO من عائلة المستقبلات الصوتية 1 (V1Rs)8 ، بينما تعبر الخلايا العصبية في المنطقة القاعدية عن عائلة المستقبلات الصوتية 2 (V2Rs)9. الأهم من ذلك ، فقد ثبت أن بعض VSNs تشارك في التعبير عن أكثر من مستقبلات صوتية10،11،12.
على الرغم من جميع المعلومات المتاحة حول الخصائص الجزيئية ل ORs و VRs ، إلا أن المعرفة حول الروابط المماثلة لها لا تزال محدودة للغاية. يعد تحديد الخلايا العصبية الشمية المحددة المسؤولة عن اكتشاف جزيء أو محفز معقد مهمة مهمة لأولئك الذين يبحثون في حاسة الشم والسلوكيات التي يحركها حاسة الشم والاستجابات الفسيولوجية. تمت محاولة العديد من الاستراتيجيات لنزع التيمات من المستقبلات الشمية ، بما في ذلك تصوير الكالسيوم7 ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية13،14 ، وتعبير المستقبلات غير المتجانسة15 ، والاستراتيجيات القائمة على الجينات المبكرة الفورية (IEGs) 16. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام بعض التقنيات لتقييم التأثيرات المعدلة للروائح في الخلايا العصبية الحسية ، باستخدام تصوير الكالسيوم في الجسم الحي 17،18 واستراتيجيات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ببروتينالفلورسنت 19. تتطلب معظم هذه التقنيات إعدادا اصطناعيا أو يتم إجراؤها على الخلايا العصبية المنفصلة ، مما يجعل من المستحيل تقييم السلوكيات التي تسببها الروائح المستخدمة في وقت واحد.
يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتحديد الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بعد حدث واحد من التعرض للرائحة ، من خلال الجمع بين الريبوبرابات التي تكتشف ORs أو VRs مع الكشف المناعي عن البروتين الريبوزومي S6 الفسفوري (pS6) ، وهو وكيل للتنشيط العصبي. هذه الطريقة هي طريقة موثوقة للتحقيق في هوية الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بواسطة إشارات كيميائية مختلفة في سياق ذي صلة بيولوجيا.
تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكول # 1883-1 ، المعتمد من قبل جامعة كامبيناس (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في معهد الأحياء - لجنة الأخلاقيات في استخدام في البحث) ، والذي يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعها المجلس الوطني الفيدرالي للتحكم في تجارب (CONCEA).
1. تحضير المواد
2. تخليق الريبوبروب
ملاحظة: يعتمد الإجراء التالي لتصنيع مجسات cRNA المسماة ب digoxigenin 1 كيلو بايت للتهجين في الموقع عبر النسخ في المختبر على البروتوكولات المنشورةسابقا 20،21،22،23.
3. تعرض الفئران للمنبهات الشمية
4. تشريح الأنسجة والتجميد
5. بروتوكول التهجين في الموقع خطوة بخطوة
6. pS6 immunostaining
7. التصوير المجهري
يهدف البروتوكول الحالي إلى الحصول على صور مجهرية يتم فيها تصنيف جين المجرب المعني وعلامة النشاط العصبي pS6 بالفلورسنت. تتضمن الطريقة الموصوفة تضخيم إشارة التيراميد ، والذي ينتج عنه وضع علامات واضحة وقوية مع خلفية قليلة أو معدومة. يظهر التلوين المناعي pS6 كإشارة فلورية سيت...
يحدد البروتوكول الموصوف هنا بشكل موثوق الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بواسطة الإشارات الكيميائية في الجهاز الشمي من خلال مزيج من الكشف في الموقع عن مستقبلات OR أو VR مع الكشف المناعي ل pS6 ، وهي علامة غير مباشرة للنشاط العصبي. يجب على المجرب توخي الحذر الشديد ?...
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة من أي نوع.
نشكر GAG Pereira و JA Yunes على الموارد ، و APF Ferreira و WO Bragança للمساعدة الإدارية والفنية ، وموظفي المرفق الأساسي لعلوم الحياة (LaCTAD-UNICAMP) للمساعدة في الفحص المجهري متحد البؤر. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للأبحاث (FAPESP ؛ أرقام المنح 2009/00473-0 و 2015/50371-0 إلى F.P.) ، من قبل PRP / UNICAMP (أرقام المنح 2969/16 و 725/15 و 348/14 و 315/12 إلى F.P.) ، من قبل زمالات FAPESP إلى V.M.A.C. (2014 / 25594-3 ، 2012 / 21786-0 ، 2012 / 01689-0) ، T.S.N. (2012 / 04026-1) ، ومن قبل زمالة Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) إلى T.S.N.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | n/a |
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit) | Thermo Fisher Scientific | B40923 or B40922 | refered to as Amplification Buffer A in working solutions for tyramide-Alexa 488 or tyramide-Alexa 555 signal amplification |
20x SSC | Merck (Calbiochem) | 8310-OP | n/a |
30% Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck (Sigma-Aldrich) | A9576 | n/a |
30% hydrogen peroxyde (H2O2) | Merck (Sigma-Aldrich) | H1009 | n/a |
Acetic anhydride | Merck (Sigma-Aldrich) | 320102 | n/a |
Agarose | Merck (Sigma-Aldrich) | A9539 | n/a |
Amplification diluent (from TSA Biotin kit) | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | refered to as Amplification Buffer B in working solution for tyramide-biotin signal amplification |
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | Cat# 44-923G, RRID:AB_2533798 | n/a |
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit) | Thermo Fisher Scientific | B40923 or B40922 | refered to as blocking solution B in the tyramide signal development step |
Blocking reagent (from TSA Biotin kit) | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | refered to as blocking reagent A in the formulation for TNB buffer |
DAPI nuclear stain | Thermo Fisher Scientific | D1306 | n/a |
Denhardt's solution (50x) | Merck (Sigma-Aldrich) | D9905 | n/a |
Deoinized formamide | Merck (Sigma-Aldrich) | F9037 | n/a |
Dextran sulfate solution (50%) | Merck (Chemicon) | S4030 | n/a |
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Merck (Sigma-Aldrich) | E9884 | n/a |
Hoechst 33342 nuclear stain | Thermo Fisher Scientific | H1399 | n/a |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck (Sigma-Aldrich) | 320331 | n/a |
Olfactory stimuli | n/a | Papes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020) | n/a |
Paraformaldehyde | Merck (Sigma-Aldrich) | P6148 | n/a |
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments) | Merck (Roche) | 11207733910; RRID:AB_514500 | refered to as peroxidase-conjugated anti-DIG antibody |
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit) | Thermo Fisher Scientific | B40922 | n/a |
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit) | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | n/a |
ProLong Gold antifade mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | refered to as anti-fading mounting medium |
RNase-free ultrapure water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | n/a |
Sodium chloride (NaCl) | Merck (Sigma-Aldrich) | S9888 | n/a |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 436143 | n/a |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck (Sigma-Aldrich) | S8045 | n/a |
Sucrose | Merck (Sigma-Aldrich) | S0389 | n/a |
Triethanolamine | Merck (Sigma-Aldrich) | T58300 | n/a |
Triton X-100 | Merck (Sigma-Aldrich) | X100 | n/a |
Trizma hydrochloride (Tris-Cl) | Merck (Sigma-Aldrich) | T5941 | n/a |
Tween-20 | Merck (Sigma-Aldrich) | 822184 | n/a |
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit) | Thermo Fisher Scientific | B40922 | n/a |
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit) | Thermo Fisher Scientific | B40923 | n/a |
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit) | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | n/a |
Yeast tRNA | Merck (Roche) | 10109495001 | n/a |
Critical Commercial Assays and Animals | |||
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit | Thermo Fisher Scientific | B40922 | n/a |
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit | Thermo Fisher Scientific | B40923 | n/a |
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Merck (Roche) | 11175025910 | n/a |
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape) | Agilent | 5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579 | refered to as automated electrophoresis system |
Mouse: C57BL/6J inbred strain | Jackson Laboratories | Stock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664) | n/a |
ProbeQuant G-50 Micro Columns | Cytiva Biosciences | 28903408 | refered to as gel filtration-based purification kit |
QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28506 | refered to as mini column-based gel-purification kit |
RNeasy MinElute cleanup kit | Qiagen | 74204 | refered to as mini column-based RNA purification kit |
TSA Biotin kit | Akoya Biosciences (Perkin Elmer) | SAT700001EA | n/a |
Oligonucleotides | |||
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG CAG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr692 |
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT TCCC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr124 |
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG TG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA GAG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr1509 |
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC G – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA ACG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr1512 |
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA ATAGTC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG G – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr78 |
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA G – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC TG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr691 |
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT GTC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT GGC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr638 |
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG TTC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Olfr569 |
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC AAGC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA CTG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r1 |
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG AG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT TCTTACAGGACAG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r2 |
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT AAGCAAGGAATTCCAC – 3' | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC CAC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r13 |
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC CAG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG ATCT – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r89 |
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC A – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC TTCTGGAG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r118 |
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG CCAGATATGTCAC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT CCCAGATGCTTTTGG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r116 |
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT AGCTGAGAAATACAAC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA GA – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r28 |
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA CTGT – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT TCC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r41 |
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT TGG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC G – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r46 |
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG TG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG GC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r69 |
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC C – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC AG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r58 |
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA AGCATCG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r90 |
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT TGGAC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT TTAGAC – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r107 |
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT GATGTGA – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT CTACTACACCATGATGG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | Vmn2r83 |
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’ | Integrated DNA Technologies | n/a | |
Recombinant DNA | |||
pGEM-T-Easy vector | Promega | A1360 | reccommended PCR cloning vector |
Other materials | |||
1mL syringes | Fisher Scientific | 14-829-10F | n/a |
Conical tubes (15 mL and 50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22, 14-959-49B | n/a |
Coplin jars | Fisher Scientific | 12-567-099, 07-200-81 | n/a |
Cryostat | Leica Biosystems | CMS 1850 | n/a |
Dissecting tools and forceps | Roboz | RS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111 | n/a |
Dry bath | n/a | n/a | n/a |
Electrophoresis equipment | Fisher Scientific | 09-528-110B | n/a |
Fine point paintbrushes | Winsor & Newton | 10269097 | n/a |
Fluorescence or confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5II | n/a |
Heated plate | Fisher Scientific | HP88850200 | n/a |
Humidified chamber (if used at higher temperatures, it will need to be sealed inside a plastic Tupperware container) | Thermo Fisher Scientific | 22-045-034 | n/a |
Lint-free laboratory Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | refered to as lint-free laboratory tissue paper |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5401000013 | n/a |
Mouse cages | InnoVive | M-BTM, MVX1 | n/a |
PCR Thermocycler | Thermo Fisher Scientific | 4375786 | n/a |
Pipette p1000, p200, and p20 disposable tips | Fisher Scientific | 02-707-408, 02-707-411, 02-707-438 | n/a |
Plastic histology embedding mold | Thermo Fisher Scientific | 22-19 | n/a |
Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33238 | refered to as highly sensitive fluorometric method |
Razor blades or scalpels | Fisher Scientific | 12-640 | n/a |
RNA tapestation or BioAnalyzer | Agilent | 4200 TapeStation System or 2100 Bioanalyzer Instrument | n/a |
RNase-free glass or plastic graduated cylinders and beakers | Fisher Scientific | 10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25D | n/a |
Stereomicroscope | Leica Microsystems | M80 | n/a |
SuperFrost Plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | referred to as positively charged microscope slides |
Parafilm | Bemis Company | PM999 | refered to as thermoplastic laboratory film |
Water bath | Thermo Fisher Scientific | TSCIR19 | n/a |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved