التحقيق في الخلايا العصبية الحسية الشمية للفأر المنشط عن طريق التلوين المناعي المشترك والتهجين في الموقع

Summary

يجمع هذا البروتوكول بين التهجين في الموقع والتألق المناعي لتحديد جينات المستقبلات الشمية والقيلية المعبر عنها في الخلايا العصبية الحسية الشمية بعد التنشيط بواسطة المحفزات الكيميائية في الفأر.

Abstract

تعتمد على الاتصالات الكيميائية لنقل المعلومات البيئية ذات الصلة وإدراكها ، بدءا من تقييم جودة الغذاء إلى اكتشاف شركاء التزاوج أو التهديدات المتاحة. في الفئران ، يتم تنفيذ هذه المهمة بشكل أساسي بواسطة نظام حاسة الشم وأنظمته الفرعية الأساسية ، بما في ذلك أنظمة حاسة الشم الرئيسية والملحقة. كلاهما لهما أعضاء طرفية مأهولة بالخلايا العصبية الحسية التي تعبر عن مستقبلات مقترنة ببروتين G قادرة على ربط الإشارات الكيميائية التي تصل إلى تجويف الأنف. على الرغم من أن الخصائص الجزيئية لهذه المستقبلات مفهومة جيدا ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن الروابط المحددة المشابهة. تجمع الطريقة الموضحة هنا بين الكشف عن التهجين في الموقع للمستقبلات الشمية أو الحمض مع الكشف المناعي عن البروتين الريبوسومي الفسفوري S6 (pS6) - علامة على تنشيط الخلايا العصبية. تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد الخلايا العصبية التي يتم تنشيطها بعد حدث واحد من التعرض لمحفزات كيميائية منقاة أو معقدة تكتشفها الأعضاء الشمية. الأهم من ذلك ، تسمح هذه التقنية بالتحقيق في الخلايا العصبية التي يتم تشغيلها في السياقات ذات الصلة بيولوجيا. من الناحية المثالية ، يجب استخدام هذه الطريقة لاستكشاف البيولوجيا الجزيئية للنظام الشمي ودراسة السلوكيات الشمية.

Introduction

الإشارات الكيميائية هي أكثر أشكال الاتصال انتشارا في. في الثدييات ، يتم الكشف عن الإشارات الكيميائية بشكل أساسي من خلال حاسة الشم وهو أمر بالغ الأهمية للعثور على الطعام ، وتحديد شركاء التزاوج المحتملين ، وتجنب المفترسة^{المحتملة 1،2،3}. ينقسم نظام حاسة الشم بالماوس أيضا إلى أنظمة فرعية مختلفة ، لكل منها خصائصها التشريحية والفسيولوجية والجزيئية⁴. من بين هؤلاء ، يعد نظام حاسة الشم الرئيسي (MOS) ونظام حاسة الشم الملحقة (AOS) الأكثر دراسة على نطاق واسع وأفضل.

MOS مسؤول في الغالب عن الكشف عن الجزيئات الكيميائية المتطايرة التي تصل إلى تجويف الأنف. يتم تحقيق ذلك عن طريق الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs) ، التي تملأ الواجهة الحسية للنظام - الظهارة الشمية الرئيسية (MOE). يعبر كل OSN عن واحد من آلاف المستقبلات الشمية (ORs) بطريقة أحادية الجين وأحادية^{الأليل.} علاوة على ذلك ، تميل ORs إلى أن تكون مضبوطة على نطاق^{واسع 6} ، وقد يرتبط رائحة واحدة بأكثر من OR ، مما يولد رمزا توافقيا للروائح⁷.

في المقابل ، فإن AOS مسؤول بشكل أساسي عن الكشف عن الفرمون والكايرومون. تعمل هذه الروابط على تنشيط الخلايا العصبية الحسية الصوتية (VSNs) في العضو الصوتي (VNO). تعبر شبكات VSNs في المنطقة القمية عن مستقبلات VNO من عائلة المستقبلات الصوتية 1 (V1Rs)⁸ ، بينما تعبر الخلايا العصبية في المنطقة القاعدية عن عائلة المستقبلات الصوتية 2 (V2Rs)⁹. الأهم من ذلك ، فقد ثبت أن بعض VSNs تشارك في التعبير عن أكثر من مستقبلات صوتية^10،11،12.

على الرغم من جميع المعلومات المتاحة حول الخصائص الجزيئية ل ORs و VRs ، إلا أن المعرفة حول الروابط المماثلة لها لا تزال محدودة للغاية. يعد تحديد الخلايا العصبية الشمية المحددة المسؤولة عن اكتشاف جزيء أو محفز معقد مهمة مهمة لأولئك الذين يبحثون في حاسة الشم والسلوكيات التي يحركها حاسة الشم والاستجابات الفسيولوجية. تمت محاولة العديد من الاستراتيجيات لنزع التيمات من المستقبلات الشمية ، بما في ذلك تصوير الكالسيوم⁷ ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية^13،14 ، وتعبير المستقبلات غير المتجانسة¹⁵ ، والاستراتيجيات القائمة على الجينات المبكرة الفورية (IEGs) ¹⁶. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام بعض التقنيات لتقييم التأثيرات المعدلة للروائح في الخلايا العصبية الحسية ، باستخدام تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ^17،18 واستراتيجيات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ببروتين^{الفلورسنت 19}. تتطلب معظم هذه التقنيات إعدادا اصطناعيا أو يتم إجراؤها على الخلايا العصبية المنفصلة ، مما يجعل من المستحيل تقييم السلوكيات التي تسببها الروائح المستخدمة في وقت واحد.

يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتحديد الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بعد حدث واحد من التعرض للرائحة ، من خلال الجمع بين الريبوبرابات التي تكتشف ORs أو VRs مع الكشف المناعي عن البروتين الريبوزومي S6 الفسفوري (pS6) ، وهو وكيل للتنشيط العصبي. هذه الطريقة هي طريقة موثوقة للتحقيق في هوية الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بواسطة إشارات كيميائية مختلفة في سياق ذي صلة بيولوجيا.

Protocol

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكول # 1883-1 ، المعتمد من قبل جامعة كامبيناس (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في معهد الأحياء - لجنة الأخلاقيات في استخدام في البحث) ، والذي يتبع المبادئ التوجيهية التي وضعها المجلس الوطني الفيدرالي للتحكم في تجارب (CONCEA).

1. تحضير المواد

1. قم بإعداد 1 لتر من 3٪ H₂O₂ (v / v) في 1x PBS. خفف 100 مل 10× PBS و 100 مل من 30٪ H₂O₂ في 500 مل من الماء عالي النقاء. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء. قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
2. قم بإعداد حجرة مرطبة تحتوي على قطع من مناديل المختبر الخالية من النسالة المبللة بمحلول 5× SSC.
3. تحضير محاليل غسيل التهجين: 5× SSC (عند 55 درجة مئوية) ، 2× SSC (55 درجة مئوية) ، 0.2× SSC (55 درجة مئوية) و 0.1× SSC (55 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة). قم بإذابة الكميات المناسبة من محلول مخزون SSC 20× في ماء فائق النقاء خال من RNase. تحضير المحاليل المخففة طازجة قبل بدء كل تجربة.
4. تحضير محلول حجب الكيمياء المناعية: 1× PBS / 1٪ BSA / 0.1٪ Triton X-100. بالنسبة إلى 100 مل ، قم بتخفيف 10 مل من 10× PBS ، و 10 مل من 10٪ BSA و 3.33 مل من 3٪ Triton X-100 في 70 مل من الماء عالي النقاء. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء. تحضير المحاليل المخففة طازجة قبل بدء كل تجربة.
5. تحضير محلول PTw: 1× PBS / 0.1٪ Tween-20. للحصول على 100 مل ، قم بتخفيف 1 مل من 10٪ Tween-20 و 10 مل من 10× PBS في 70 مل من الماء فائق النقاء. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
6. تحضير محلول ثلاثي إيثانول أمين 0.1 متر خال من RNase. للحصول على 250 مل ، قم بتخفيف 3.33 مل من ثلاثي إيثانول أمين من فئة الكاشف في 200 مل من الماء فائق النقاء الخالي من RNase تحت التحريك (استخدم الأواني الزجاجية الخالية من RNase والنمام المغناطيسي عند تحضير هذا المحلول). اضبط درجة الحموضة على 8.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. أكمل مستوى الصوت بماء فائق النقاء خال من RNase واحفظه محميا من الضوء حتى الاستخدام. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
7. قم بإعداد 0.1٪ H₂O₂ (v / v) خال من RNase في 1× PBS. للحصول على 1 لتر ، قم بتخفيف 100 مل من 10× PBS و 3.3 مل من 30٪ H₂O₂ في 500 مل من الماء فائق النقاء الخالي من RNase. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء الخالي من RNase. قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
8. تحضير محاليل خالية من RNase لما يلي: 0.2 M HCl ؛ 1 م تريس حمض الهيدروكلوريك 8.0 ؛ 10 مجم / مل خميرة tRNA ؛ 10٪ SDS ؛ 10× برنامج تلفزيوني ؛ 100× حل دينهاردت. 20× SSC; 50٪ كبريتات ديكستران 6 م حمض الهيدروكلوريك
9. تحضير محلول مثبت 4٪ بارافورمالدهيد خال من RNase. للحصول على 100 مل ، قم بإذابة 4 جم من بارافورمالدهيد في 80 مل من 1× PBS. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 مع 10 M هيدروكسيد الصوديوم. أكمل مستوى الصوت ب 1× PBS. يجب تحضير هذا الحل طازجا قبل بدء كل تجربة.
   أنذر: بارافورمالديهايد مادة خطرة يمكن أن تسبب ضررا إذا تم استنشاقها. قم بإعداد المحلول تحت غطاء الدخان وارتداء القفازات الواقية والقناع ونظارات السلامة.
10. تحضير محلول تشريح خال من RNase: 30٪ سكروز / 0.45 م EDTA درجة الحموضة 8.0 / 1× PBS. للحصول على 100 مل ، قم بإذابة 30 جم من السكروز في 60 مل من 0.5 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 الخالي من RNase. أضف 10 مل من 10× PBS. أكمل مستوى الصوت ب 0.5 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 الخالي من RNase.
11. قم بإعداد أسطوانات وأكواب زجاجية أو بلاستيكية متدرجة خالية من RNase.
12. تحضير محاليل التهجين والتهجين المسبق الخالية من RNase: 50٪ فورماميد منزوع الأيونات (حجم / حجم) / 600 ملي كلوريد الصوديوم / 200 ميكروغرام / مل خميرة الحمض النووي الريبي / 0.25٪ SDS (وزن / حجم) / 10 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 8.0 / 1× محلول دينهاردت / 1 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8.0 / 10٪ كبريتات ديكستران (وزن / حجم). للحصول على 10 مل في أسطوانة متدرجة ، أضف 5 مل من الفورماميد منزوع الأيونات ، و 1.2 مل من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 200 ميكرولتر من 10 مجم / مل من الخميرة tRNA ، و 250 ميكرولتر من 10٪ SDS ، و 100 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl pH 8.0 ، و 200 ميكرولتر من 50× محلول Denhardt ، و 20 ميكرولتر من 500 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8.0 ، و 2 مل من 50٪ كبريتات ديكستران (MW 500،000). أكمل الحجم بالماء فائق النقاء الخالي من RNase. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
    ملاحظة: كبريتات ديكستران لزجة جدا. ينصح بإعداد 20٪ إضافية من الحجم الإجمالي لحلول التهجين / التهجين المسبق لحساب أخطاء سحب العينات. يمكن حذف الحمض النووي الريبي للخميرة من محلول ما قبل التهجين ، إذا رغبت في ذلك.
13. تحضير أغطية فيلم مختبر اللدائن الحرارية. قطع قطع فيلم مختبر لدائن حرارية مستطيلة أقصر بمقدار 1-2 مم من طول وعرض شريحة المجهر.
14. تحضير المخزن المؤقت TN: 100 ملي مولار Tris-HCl / 150 ملي كلوريد الصوديوم. للحصول على 100 مل ، قم بتخفيف 10 مل من 1 M Tris-HCl pH 7.5 و 3 مل من 5 M كلوريد الصوديوم في 70 مل من الماء فائق النقاء. أكمل الحجم بالماء فائق النقاء. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
15. إعداد المخزن المؤقت لحجب TNB: كاشف حجب 0.5٪ A (w/v) في TN Buffer. للحصول على 200 مل ، قم بإذابة 1 جم من الكاشف المانع A في 200 مل من TN Buffer (انظر جدول المواد للمصدر التجاري للكاشف المانع A).
16. تحضير المخزن المؤقت TNT: 0.05٪ Tween-20 في TN Buffer. لمدة 1 لتر ، قم بتخفيف 5 مل من 10٪ Tween-20 في 950 مل من المخزن المؤقت TN. أكمل مستوى الصوت ببطء باستخدام المخزن المؤقت TN لتجنب الرغوة. قم بإعداد هذا المحلول طازجا قبل بدء كل تجربة.
17. تحضير حل عمل Tyramide-Alexa 488: 1× المخزن المؤقت للتضخيم A / 0.0015٪ H₂O₂/1: 100 التيراميد - Alexa 488. بالنسبة ل 100 ميكرولتر ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 0.15٪ H₂O₂ و 1 ميكرولتر من التيراميد - Alexa 488 في 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم A (انظر جدول المواد للمصادر التجارية للتيراميد - أليكسا 488 ومخزن التضخيم A). قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
18. تحضير حل عمل Tyramide-Alexa 555: 1× المخزن المؤقت للتضخيم A / 0.0015٪ H₂O₂/1: 100 Tyramide-Alexa 555. بالنسبة ل 100 ميكرولتر ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 0.15٪ H₂O₂ و 1 ميكرولتر من التيراميد Alexa 555 في 98 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم A (انظر جدول المواد للمصادر التجارية للتيراميد - Alexa 555 ومخزن التضخيم A). قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
19. تحضير حل عمل التيراميد البيوتين: 1× المخزن المؤقت للتضخيم B / 0.0015٪ H₂O₂ / 1: 50 التيراميد البيوتين. وبالنسبة إلى 100 ميكرولتر، يخفف 1 ميكرولتر من 0.15٪ H₂O₂ و2 ميكرولتر من بيوتين التيراميد في 97 ميكرولتر من مخزن التضخيم B (انظر جدول المواد للمصادر التجارية للتيراميد البيوتين ومخزن التضخيم B). قم بإعداد هذا المحلول مباشرة قبل الاستخدام.
20. تخبز الأواني الزجاجية على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل. عالج الأواني البلاستيكية غير التي لا تستخدم لمرة واحدة (بما في ذلك الرفوف المنزلقة وبرطمانات كوبلن والمحاقن) بنسبة 3٪ H₂O₂ لمدة 15-30 دقيقة ، متبوعا بغسيل شامل تحت الماء الخالي من RNase. عالج الأدوات المعدنية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مثل أدوات التشريح والملقط وحاملات عينات التبريد ، بنسبة 3٪ H₂O₂ لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بغسيل شامل تحت الماء الخالي من RNase. نظف أسطح مقاعد البدلاء واللوح المسخن والكتل الجافة باستخدام محلول تنظيف RNase.

2. تخليق الريبوبروب

ملاحظة: يعتمد الإجراء التالي لتصنيع مجسات cRNA المسماة ب digoxigenin 1 كيلو بايت للتهجين في الموقع عبر النسخ في المختبر على البروتوكولات المنشورة^{سابقا 20،21،22،23}.

1. استخدم أزواج أولي قليل النوكليوتيدات المناسبة لتضخيم جزء من الحمض النووي 1 كيلو بايت من الجين المعني (على سبيل المثال ، جين المستقبلات الشمي). حدد أزواج التمهيدي التي تضخم منطقة موجودة في الرنا المرسال الناضج المراد اكتشافها (على سبيل المثال ، تسلسل ترميز الجين). يتم توفير مجموعة مختارة من الاشعال لمستقبلات حاسة الشم المختلفة في جدول المواد. للحصول على تفاصيل حول المجسات للكشف عن مستقبلات حاسة الشم الأخرى ، يرجى مراجعة المنشورات السابقة^16،21.
2. قم بتشغيل منتجات PCR على جل الاغاروز بنسبة 0.8٪ وقم بإزالة النطاق المطلوب 1 كيلو بايت.
3. قم بتنقية جزء الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية هلام صغيرة مناسبة قائمة على العمود وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
4. قم بتحديد جزء الحمض النووي المنقى واستنساخه في ناقل استنساخ PCR مناسب وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ينصح باستخدام نواقل الاستنساخ التي تحتوي على محفزات بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 و SP6 التي تحيط بالمضخم المستنسخ.
5. قم بتحويل البلازميد المؤتلف إلى بكتيريا مختصة خالية من إعادة التركيب عن طريق التحويل الكيميائي أو التثقيب الكهربائي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
6. عزل البذور المستعمرات البكتيرية المتحولة إلى وسط غني وعزل البلازميد عن طريق تحضير الحمض النووي المصغر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
7. قم بإجراء تحليل هضم تقييد باستخدام إنزيمات التقييد المناسبة و / أو تسلسل سانجر للتحقق من هوية واتجاه جزء الحمض النووي المدرج وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
8. قم بإجراء عملية الهضم المقيدة لخطية 10 ميكروغرام من البلازميد باستخدام إنزيم تقييد مناسب. لإنتاج مسبار ريبوبروب مضاد للإحساس بعد النسخ في المختبر ، استخدم إنزيم تقييد يهضم الحمض النووي البلازميد في أقصى الإدخال المقابل لمحفز بوليميراز الحمض النووي الريبي الموجود في اتجاه مجرى النهر لتسلسل ترميز الجين. لإنتاج ريبوبروبس حسي بعد النسخ في المختبر ، استخدم إنزيم تقييد يهضم الحمض النووي البلازميد في أقصى الإدخال المقابل لمحفز بوليميراز الحمض النووي الريبي الموجود في اتجاه المنبع لتسلسل ترميز الجين.
9. قم بتشغيل حصة من منتج تفاعل خطية البلازميد على هلام الاغاروز بنسبة 0.8٪ للتأكد من اكتمال الهضم. بمجرد تأكيد الخطية الكاملة ، قم بتنقية ما تبقى من التفاعل باستخدام مجموعة تنظيف PCR القائمة على العمود وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
10. قم بتجميع مجسات الحمض النووي الريبي المسمى بالديجوكسيجينين عن طريق النسخ في المختبر باستخدام 1-2 ميكروغرام من البلازميد الخطي كقالب ، والإنزيم المناسب (على سبيل المثال ، T7 أو SP6 RNA polymerase) ، ومجموعة أدوات وضع العلامات على digoxigenin (DIG) مناسبة.
11. قم بإزالة قالب الحمض النووي من التفاعل عن طريق الهضم باستخدام DNase I عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
12. قم بتنقية مجسات الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي المصغرة القائمة على العمود أو مجموعة تنقية قائمة على الترشيح الهلامي. قم بإزالة المسبار الناتج في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
13. حدد كمية الريبوبروب الناتج ، ويفضل استخدام طرق الفلورومترية. عادة ما يكون العائد المتوقع أعلى من 100 نانوغرام / ميكرولتر.
14. قم بتشغيل مسبار الريبوبروب على نظام الرحلان الكهربائي الآلي أو على هلام الاغاروز 0.8٪ خال من RNase للتحقق من جودة المسبار وتدهوره.
15. قم بتخزين المسبار المركب عند -80 درجة مئوية لحين الحاجة.

3. تعرض الفئران للمنبهات الشمية

1. ضع كل على حدة في قفص نظيف لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التعرض. قم بإزالة شبكة الطعام قبل ساعتين على الأقل من التعرض. كانت جميع المستخدمة في هذه الدراسة من ذكور C57BL / 6 من الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا (متوسط الوزن: 20 جم).
2. تحضير المنبه الشمي المناسب. يمكن استخدام محفزات مختلفة لتنشيط الخلايا العصبية الشمية في MOE (الظهارة الشمية الرئيسية) أو VNO (العضو الشمي). للحصول على قائمة شاملة بالمحفزات الشمية ، يرجى الرجوع إلى المنشورات الأخرى^{3 ، 16 ، 22 ، 23 ، 24}. يمكن ترسيب المحفزات السائلة ، مثل المحاليل الكيميائية أو البول أو محلول البروتين المؤتلف ، على شاش طبي أو كرة قطنية.
3. أدخل المنبه الشمي في القفص واترك دون إزعاج لمدة 1 ساعة.
4. قم بالقتل الرحيم لموضوع الماوس وقم بتشريح MOE أو VNO بسرعة باستخدام أدوات التشريح الخالية من RNase.

4. تشريح الأنسجة والتجميد

1. قم بتشريح MOE أو VNO تحت مجهر مجسم باستخدام محلول التشريح.
   1. بالنسبة ل VNO ، قم بإزالة عظام الحاجز السميكة ، تاركا قشور الغضاريف الأكثر نعومة المحيطة بالعضو.
2. تحضير عينة للتقسيم بالتبريد.
   1. جفف العينة على قطعة من ورق النشاف وضعها داخل قالب بلاستيكي نسيجي يحتوي على وسيط تضمين.
   2. بالنسبة إلى VNO ، رتب كل عضو عموديا واسحبه إلى أسفل القالب البلاستيكي بمساعدة حقنة سعة 1 مل (الشكل 1 أ).
   3. بالنسبة لوزارة التربية والتعليم ، ضعه في الجزء السفلي من القالب البلاستيكي بحيث تكون اللوحة المصفوية متجهة لأسفل.
   4. قم بإزالة الفقاعات الزائدة حول العينة لأنها يمكن أن تتداخل مع التقسيم.
   5. تجميد العينات على الثلج الجاف.
   6. قم بتخزين كتلة العينة عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات المجمدة لعدة أشهر قبل التقسيم.
3. قم بإجراء التقسيم بالتبريد.
   1. قم بتشغيل ناظم البرد واضبط درجة الحرارة على -23 درجة مئوية قبل 4 ساعات على الأقل من الاستخدام.
   2. قم بإزالة الكتلة المجمدة من القالب البلاستيكي النسيجي وقم بقصها بشفرة حلاقة.
   3. اترك 5 مم حول العينة ، لأن هذا يجعل التعامل مع القسم أسهل (الشكل 1 ب).
   4. استخدم وسيط التضمين لتوصيل الكتلة بحامل عينة المبرد.
   5. اجمع 16 ميكرومتر على شرائح مجهر موجبة الشحنة.
   6. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية لعدة أشهر قبل التهجين في الموقع .

5. بروتوكول التهجين في الموقع خطوة بخطوة

1. جفف الشرائح لمدة 10 دقائق باستخدام مجفف الشعر. استخدم النفاثة الدافئة لإذابة الجليد من الشرائح ، ثم قم بالتبديل إلى نفاثة درجة حرارة الغرفة حتى يصبح وسط التضمين معتما.
2. أضف 500 ميكرولتر لكل شريحة من محلول تثبيت بارافورمالدهيد 4٪ خال من RNase واحتضانه عند 23-26 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإصلاح الأقسام النسيجية.
3. اغسل الشرائح مرتين في 1× PBS خالية من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما.
4. أضف 500 ميكرولتر لكل شريحة من 0.2 M HCl الخالي من RNase واحتضنه عند 23-26 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
5. اغسل الشرائح مرتين في 1× PBS خالية من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما.
6. أضف 500 ميكرولتر لكل شريحة من 0.1٪ H₂O₂/1× PBS الخالية من RNase واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 23-26 درجة مئوية. قم بتنفيذ هذه الخطوة في الظلام لمنع تدهور بيروكسيد الهيدروجين الناجم عن الضوء.
7. اغسل الشرائح مرتين في 1× PBS خالية من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما.
8. قم بإجراء الأستلة عن طريق نقل الشرائح إلى وعاء يحتوي على 250 مل من ثلاثي إيثانول أمين خال من RNase 0.1 M pH 8.0 وقضيب تقليب مغناطيسي ، في غطاء دخان. أضف 625 ميكرولتر من أنهيدريد الخل تحت التحريك المستمر. اخفض سرعة التقليب ، وأضف 625 ميكرولتر أخرى قطرة قطرة على الشرائح ، ثم أطفئ التحريك واحتضنه لمدة 10 دقائق.
9. اغسل الشرائح مرتين في 1× PBS خالية من RNase لمدة 5 دقائق لكل منهما.
10. اغسل الشرائح مرة واحدة في 1× PBS خالية من RNase عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
11. قم بإجراء التهجين المسبق عن طريق إزالة الشرائح من 1× PBS واحدة تلو الأخرى وتجفيف كل منها باستخدام مناديل مختبرية خالية من النسالة. Pipet 400 ميكرولتر من محلول التهجين المسبق على كل شريحة ووضعها داخل غرفة رطبة مدفأة مسبقا عند 60 درجة مئوية في حمام مائي أو فرن ساخن. احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
12. قم بتسخين محلول تهجين كاف إلى 60 درجة مئوية ، وتناول 200 ميكرولتر لكل شريحة في أنابيب الطرد الدقيق ، وتسخينها حتى 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
13. أضف مسبار (مسبارات) الحمض النووي الريبي المرسال المناسب إلى أنابيب محلول التهجين (1 ميكروغرام / مل لكل مسبار) وقم بتغيير طبيعة الأرض عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
14. للتهجين ، خذ شريحة واحدة في كل مرة من الغرفة المرطبة ، وجففها وضعها على طبق ساخن 60 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من محلول التهجين المحتوي على الريبوبروب وقم بتغطية الشريحة بغطاء زجاجي. احتضان لمدة 12-16 ساعة في الغرفة المرطبة عند 60 درجة مئوية.
    ملاحظة: لا تسمح للشرائح بالتبريد بعد التهجين المسبق. يجب تحديد درجة حرارة التهجين تجريبيا لكل مسبار. يقترح ستون درجة مئوية كنقطة انطلاق ، لأنها تعمل بشكل جيد بشكل عام مع مجسات 1 كيلو بايت.
15. قم بتسخين محاليل الغسيل SSC إلى 55 درجة مئوية في برطمانات منفصلة وضعها في حمام مائي عند درجة الحرارة المناسبة.
16. بعد الانتهاء من التهجين ، قم بإزالة الغطاء من كل شريحة باستخدام حمام يحتوي على محلول SSC 5× عند 55 درجة مئوية. أمسك كل شريحة أفقيا داخل محلول SSC الدافئ. عندما ينفصل الغطاء ، قم بإمالة الشريحة واترك الغطاء يسقط إلى الأسفل.
17. يغسل ب 2× SSC عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وعاء منزلق.
18. يغسل ب 0.2× SSC عند 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في وعاء منزلق.
19. يغسل ب 0.1× SSC عند 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في وعاء منزلق.
20. انقله إلى 0.1× SSC عند 23-26 درجة مئوية واحتضنه لمدة 3 دقائق في وعاء منزلق.
21. يغسل في PTw لمدة 10 دقائق في وعاء منزلق.
22. يغسل مرتين في TN Buffer ، لمدة 5 دقائق لكل منهما ، في وعاء منزلق.
23. PIPET 600 ميكرولتر من TNB يحجب المخزن المؤقت على كل شريحة ويحتضن لمدة 3 ساعات عند 23-26 درجة مئوية.
24. Pipet 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (الجسم المضاد المضاد للديجي المترافق بالبيروكسيداز المخفف 1: 400 في محلول TNB) على كل شريحة. قم بتراكب قطعة من فيلم المختبر بالحرارة بعناية على كل شريحة واحتضانها لمدة 12-16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
25. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.
26. Pipet 100 ميكرولتر من محلول عمل التيراميد والبيوتين على كل شريحة. قم بتغطيتها بأغطية فيلم مختبر لدن بالحرارة واحتضانها لمدة 12 دقيقة عند 23-26 درجة مئوية.
    ملاحظة: قم بتنفيذ خطوة الحضانة هذه بطريقة متداخلة ، مع 2 أو 3 شرائح لكل دفعة ، للسماح بالتحكم الجيد في أوقات الحضانة. قد تحتاج مدة حضانة التيراميد إلى الأمثل ، اعتمادا على حساسية مسبار الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي وتركيزه.
27. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.
28. Pipet 200 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الستربتافيدين المترافق مع البيروكسيديز (SA-HRP ، مخفف 1: 100 في المخزن المؤقت TNB) على كل شريحة وتغطيتها بغطاء فيلم مختبر لدن بالحرارة. احتضان عند 23-26 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
29. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.
30. Pipet 100 ميكرولتر من محلول عمل التيراميد Alexa 488 على كل شريحة ، قم بتغطيتها بغطاء فيلم مختبر لدن بالحرارة واحتضانها عند 23-26 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة في الظلام.
31. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.
32. احتضان في 3٪ H₂O₂/1× PBS في وعاء منزلق لمدة 1 ساعة ، لتعطيل البيروكسيداز من الخطوات السابقة.
33. اغسل الشرائح 6 مرات باستخدام TNT Buffer لمدة 5 دقائق لكل منها ، تحت التحريك الخفيف في وعاء منزلق.

6. pS6 immunostaining

1. Pipet 500 ميكرولتر من محلول 4٪ paraformaldehyde / 1× PBS على كل شريحة وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإصلاح الأقسام.
2. Pipet 500 ميكرولتر من 1× PBS / 0.1٪ Triton X-100 على كل شريحة واحتضانها لمدة 5 دقائق لاختراق الأقسام.
3. اغسل مرتين باستخدام 1× PBS في وعاء منزلق.
4. Pipet 2-3 قطرات لكل قسم من محلول حجب تضخيم إشارة التيراميد المتاح تجاريا B (جدول المواد) وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
5. Pipet 400 ميكرولتر من محلول حجب الكيمياء المناعية على كل شريحة وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لحجب الأقسام.
6. Pipet 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية للأرانب المضادة ل pS6 (مخفف 1: 200 في محلول حجب الكيمياء المناعية ؛ التركيز النهائي: 1 ميكروغرام / مل) على كل شريحة ، وتغطيتها بغطاء فيلم مختبر لدن بالحرارة ، وتحتضن عند 4 درجات مئوية لمدة 12-16 ساعة.
7. اغسل 3 مرات باستخدام 1× PBS / 0.1٪ Triton X-100 ، لمدة 5 دقائق لكل منهما في وعاء منزلق.
8. Pipet 2-3 قطرات لكل شريحة من محلول الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب المترافق مع البيروكسيديز المتوفرة تجاريا (جدول المواد) وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
9. اغسل 3 مرات باستخدام 1× PBS / 0.1٪ Triton X-100 ، لمدة 5 دقائق لكل منهما في وعاء منزلق.
10. تجف الشرائح وتضع 100 إلى 200 ميكرولتر من محلول عمل التيراميد Alexa 555 على كل شريحة ، وتراكب بقطعة من غطاء فيلم المختبر بالحرارة ، وتحتضن لمدة 7 دقائق في الظلام.
11. اغسل مرتين باستخدام 1× PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما في وعاء منزلق.
12. Pipet 500 ميكرولتر من البقعة النووية المخففة (في 1× PBS) على كل شريحة وتحتضن عند 23-26 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
13. اغسل مرتين باستخدام 1× PBS عند 23-26 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لكل منهما في وعاء منزلق.
14. قم بتركيب الشرائح مع وسيط تثبيت مضاد للبهتان واترك وسط التركيب يعالج لمدة 24 ساعة في الظلام.
15. قم بتخزين الشرائح في درجة الحرارة المناسبة حتى التصوير ، لتجنب تلاشي الفلورة.

7. التصوير المجهري

1. تنزلق الصورة باستخدام مجهر متألق أو مجهر متحد البؤر مزود بمرشحات مناسبة للفلوروفورات المستخدمة.

النتائج

يهدف البروتوكول الحالي إلى الحصول على صور مجهرية يتم فيها تصنيف جين المجرب المعني وعلامة النشاط العصبي pS6 بالفلورسنت. تتضمن الطريقة الموصوفة تضخيم إشارة التيراميد ، والذي ينتج عنه وضع علامات واضحة وقوية مع خلفية قليلة أو معدومة. يظهر التلوين المناعي pS6 كإشارة فلورية سيت...

Discussion

يحدد البروتوكول الموصوف هنا بشكل موثوق الخلايا العصبية الحسية التي يتم تنشيطها بواسطة الإشارات الكيميائية في الجهاز الشمي من خلال مزيج من الكشف في الموقع عن مستقبلات OR أو VR مع الكشف المناعي ل pS6 ، وهي علامة غير مباشرة للنشاط العصبي. يجب على المجرب توخي الحذر الشديد ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9625	n/a
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923 or B40922	refered to as Amplification Buffer A in working solutions for tyramide-Alexa 488 or tyramide-Alexa 555 signal amplification
20x SSC	Merck (Calbiochem)	8310-OP	n/a
30% Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck (Sigma-Aldrich)	A9576	n/a
30% hydrogen peroxyde (H2O2)	Merck (Sigma-Aldrich)	H1009	n/a
Acetic anhydride	Merck (Sigma-Aldrich)	320102	n/a
Agarose	Merck (Sigma-Aldrich)	A9539	n/a
Amplification diluent (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	refered to as Amplification Buffer B in working solution for tyramide-biotin signal amplification
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	Cat# 44-923G, RRID:AB_2533798	n/a
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923 or B40922	refered to as blocking solution B in the tyramide signal development step
Blocking reagent (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	refered to as blocking reagent A in the formulation for TNB buffer
DAPI nuclear stain	Thermo Fisher Scientific	D1306	n/a
Denhardt's solution (50x)	Merck (Sigma-Aldrich)	D9905	n/a
Deoinized formamide	Merck (Sigma-Aldrich)	F9037	n/a
Dextran sulfate solution (50%)	Merck (Chemicon)	S4030	n/a
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)	Merck (Sigma-Aldrich)	E9884	n/a
Hoechst 33342 nuclear stain	Thermo Fisher Scientific	H1399	n/a
Hydrochloric acid (HCl)	Merck (Sigma-Aldrich)	320331	n/a
Olfactory stimuli	n/a	Papes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)	n/a
Paraformaldehyde	Merck (Sigma-Aldrich)	P6148	n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments)	Merck (Roche)	11207733910; RRID:AB_514500	refered to as peroxidase-conjugated anti-DIG antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
ProLong Gold antifade mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934	refered to as anti-fading mounting medium
RNase-free ultrapure water	Thermo Fisher Scientific	10977015	n/a
Sodium chloride (NaCl)	Merck (Sigma-Aldrich)	S9888	n/a
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Merck (Sigma-Aldrich)	436143	n/a
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck (Sigma-Aldrich)	S8045	n/a
Sucrose	Merck (Sigma-Aldrich)	S0389	n/a
Triethanolamine	Merck (Sigma-Aldrich)	T58300	n/a
Triton X-100	Merck (Sigma-Aldrich)	X100	n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)	Merck (Sigma-Aldrich)	T5941	n/a
Tween-20	Merck (Sigma-Aldrich)	822184	n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923	n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
Yeast tRNA	Merck (Roche)	10109495001	n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit	Thermo Fisher Scientific	B40923	n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)	Merck (Roche)	11175025910	n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape)	Agilent	5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579	refered to as automated electrophoresis system
Mouse: C57BL/6J inbred strain	Jackson Laboratories	Stock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)	n/a
ProbeQuant G-50 Micro Columns	Cytiva Biosciences	28903408	refered to as gel filtration-based purification kit
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28506	refered to as mini column-based gel-purification kit
RNeasy MinElute cleanup kit	Qiagen	74204	refered to as mini column-based RNA purification kit
TSA Biotin kit	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
Oligonucleotides
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG CAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT TCCC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA GAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA ACG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA ATAGTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT GTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT GGC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG TTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC AAGC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA CTG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG AG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT TCTTACAGGACAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT AAGCAAGGAATTCCAC – 3'	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC CAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC CAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG ATCT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC A – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC TTCTGGAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG CCAGATATGTCAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT CCCAGATGCTTTTGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT AGCTGAGAAATACAAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA GA – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA CTGT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT TCC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT TGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG GC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC C – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC AG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA AGCATCG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT TGGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT TTAGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT GATGTGA – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT CTACTACACCATGATGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vector	Promega	A1360	reccommended PCR cloning vector
Other materials
1mL syringes	Fisher Scientific	14-829-10F	n/a
Conical tubes (15 mL and 50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22, 14-959-49B	n/a
Coplin jars	Fisher Scientific	12-567-099, 07-200-81	n/a
Cryostat	Leica Biosystems	CMS 1850	n/a
Dissecting tools and forceps	Roboz	RS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111	n/a
Dry bath	n/a	n/a	n/a
Electrophoresis equipment	Fisher Scientific	09-528-110B	n/a
Fine point paintbrushes	Winsor & Newton	10269097	n/a
Fluorescence or confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5II	n/a
Heated plate	Fisher Scientific	HP88850200	n/a
Humidified chamber (if used at higher temperatures, it will need to be sealed inside a plastic Tupperware container)	Thermo Fisher Scientific	22-045-034	n/a
Lint-free laboratory Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	refered to as lint-free laboratory tissue paper
Microcentrifuge	Eppendorf	5401000013	n/a
Mouse cages	InnoVive	M-BTM, MVX1	n/a
PCR Thermocycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	n/a
Pipette p1000, p200, and p20 disposable tips	Fisher Scientific	02-707-408, 02-707-411, 02-707-438	n/a
Plastic histology embedding mold	Thermo Fisher Scientific	22-19	n/a
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	refered to as highly sensitive fluorometric method
Razor blades or scalpels	Fisher Scientific	12-640	n/a
RNA tapestation or BioAnalyzer	Agilent	4200 TapeStation System or 2100 Bioanalyzer Instrument	n/a
RNase-free glass or plastic graduated cylinders and beakers	Fisher Scientific	10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25D	n/a
Stereomicroscope	Leica Microsystems	M80	n/a
SuperFrost Plus microscope slides	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	referred to as positively charged microscope slides
Parafilm	Bemis Company	PM999	refered to as thermoplastic laboratory film
Water bath	Thermo Fisher Scientific	TSCIR19	n/a