Aktive Edilmiş Fare Koku Alma Duyu Nöronlarının Kombine İmmün Boyama ve İn Situ Hibridizasyon ile İncelenmesi

Özet

Bu protokol, farede kimyasal uyaranlarla aktivasyondan sonra koku alma duyu nöronlarında eksprese edilen koku alma ve vomeronazal reseptör genlerini tanımlamak için in situ hibridizasyonu, immünofloresan ile birleştirir.

Özet

Hayvanlar, gıda kalitesinin değerlendirilmesinden mevcut çiftleşme ortaklarının veya tehditlerin tespitine kadar ilgili çevresel bilgileri iletmek ve algılamak için kimyasal iletişime güvenir. Farelerde, bu görev öncelikle koku alma sistemi ve ana ve aksesuar koku alma sistemleri de dahil olmak üzere temel alt sistemleri tarafından yürütülür. Her ikisi de, burun boşluğuna ulaşan kimyasal ipuçlarını bağlayabilen G-proteinine bağlı reseptörleri eksprese eden duyusal nöronlar tarafından doldurulan periferik organlara sahiptir. Bu reseptörlerin moleküler özellikleri iyi anlaşılmış olsa da, akraba spesifik ligandları hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada tarif edilen yöntem, koku alma veya vomeronazal reseptörlerin in situ hibridizasyon tespitini, nöronal aktivasyonun bir belirteci olan fosforile ribozomal protein S6'nın (pS6) immüno-tespiti ile birleştirir. Bu protokol, koku alma organları tarafından tespit edilen saflaştırılmış veya karmaşık kimyasal uyaranlara maruz kalma olayından sonra aktive olan nöronları tanımlamak için tasarlanmıştır. Daha da önemlisi, bu teknik biyolojik olarak ilgili bağlamlarda tetiklenen nöronların araştırılmasına izin verir. İdeal olarak, bu yöntem koku alma sisteminin moleküler biyolojisini araştırmak ve koku alma davranışlarını incelemek için kullanılmalıdır.

Giriş

Kemosinyalizasyon, hayvanlarda en yaygın iletişim şeklidir. Memelilerde, kimyasal ipuçlarının tespitine esas olarak koku alma aracılık eder ve yiyecek bulmak, olası çiftleşme ortaklarını bulmak ve potansiyel yırtıcılardan kaçınmak için çok önemlidir ^1,2,3. Fare koku alma sistemi ayrıca her biri kendi anatomik, fizyolojik ve moleküler özelliklerine sahip farklı alt sistemlere ayrılmıştır⁴. Bunlar arasında, ana koku alma sistemi (MOS) ve aksesuar koku alma sistemi (AOS) en yaygın olarak çalışılan ve daha iyi karakterize edilenlerdir.

MOS çoğunlukla burun boşluğuna ulaşan uçucu kimyasal moleküllerin tespitinden sorumludur. Bu, sistemin duyusal arayüzünü - ana koku alma epiteli (MOE) - dolduran koku alma duyusal nöronları (OSN'ler) tarafından gerçekleştirilir. Her OSN, binlerce koku alma reseptöründen (OR) birini monogenik ve monoalelik bir şekilde ifade eder⁵. Ayrıca, ameliyathaneler geniş çapta ayarlanma eğilimindedir⁶ ve tek bir koku verici birden fazla ameliyathaneye bağlanabilir ve kokular⁷ için bir kombinatoryal kod oluşturabilir.

Buna karşılık, AOS esas olarak feromon ve kairomon tespitinden sorumludur. Bu ligandlar, vomeronazal organda (VNO) vomeronazal duyusal nöroları (VSN'ler) aktive eder. VNO'nun apikal bölgesindeki VSN'ler, vomeronazal reseptör 1 ailesinden (V1Rs)⁸ reseptörleri eksprese ederken, bazal bölgedeki nöronlar vomeronazal reseptör 2 ailesini (V2R'ler)⁹ eksprese eder. Önemli olarak, bazı VSN'lerin birden fazla vomeronazal reseptörü birlikte eksprese ettiği gösterilmiştir 10,11,12.

OR'lerin ve VR'lerin moleküler özellikleri hakkında mevcut tüm bilgilere rağmen, akraba ligandları hakkındaki bilgiler hala çok sınırlıdır. Bir molekülün veya karmaşık uyaranın saptanmasından sorumlu spesifik koku alma nöronlarının tanımlanması, koku alma, koku alma güdümlü davranışlar ve fizyolojik tepkileri araştıranlar için önemli bir görevdir. Kalsiyum görüntüleme⁷, tek hücreli RNA dizilimi^13,14, heterolog reseptör ekspresyonu¹⁵ ve anında erken genlere (IEG'ler)¹⁶ dayalı stratejiler dahil olmak üzere koku alma reseptörlerini deorphanize etmek için çeşitli stratejiler denenmiştir. Daha yakın zamanlarda, in vivo kalsiyum görüntüleme^17,18 ve floresan protein etiketli tek hücreli RNA dizileme stratejileri¹⁹ kullanılarak duyusal nöronlardaki koku maddelerinin modülatör etkilerini değerlendirmek için bazı teknikler kullanılmıştır. Bu tekniklerin çoğu yapay bir kurulum gerektirir veya ayrışmış nöronlar üzerinde gerçekleştirilir, bu da kullanılan kokuların tetiklediği davranışları aynı anda değerlendirmeyi imkansız hale getirir.

Burada açıklanan protokol, belirli OR'leri veya VR'leri tespit eden riboprobları, nöronal aktivasyon için bir vekil olan fosforile S6 ribozomal proteininin (pS6) immüno-tespiti ile birleştirerek, tek bir kokuya maruz kalma olayından sonra aktive edilen duyusal nöronların tanımlanmasına izin verir. Bu yöntem, biyolojik olarak ilgili bir bağlamda farklı kemosinyaller tarafından aktive edilen duyusal nöronların kimliğini araştırmanın güvenilir bir yoludur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan prosedürleri, Campinas Üniversitesi (Biyoloji Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi - Araştırmada Hayvan Kullanımında Etik Komitesi) tarafından onaylanan ve federal Ulusal Hayvan Deneyleri Kontrol Konseyi (CONCEA) tarafından belirlenen yönergeleri izleyen Hayvan Protokolü #1883-1'e uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Malzeme hazırlama

1. 1x PBS'de 1 L %3 H₂O₂ (h / h) hazırlayın. 100 mL, 10× PBS ve 100 mL %30_H2O2'yi500 mL ultra saf suda seyreltin. Hacmi ultra saf su ile tamamlayın. Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
2. 5 × SSC solüsyonu ile ıslatılmış, tüy bırakmayan laboratuvar mendili parçaları içeren nemlendirilmiş bir oda hazırlayın.
3. Hibridizasyon yıkama çözeltileri hazırlayın: 5× SSC (55 °C'de), 2× SSC (55 °C), 0.2× SSC (55 °C) ve 0.1× SSC (55 °C ve oda sıcaklığı). Uygun hacimlerde 20× SSC stok çözeltisini RNaz içermeyen ultra saf suda çözün. Her deneye başlamadan önce seyreltilmiş çözeltileri taze olarak hazırlayın.
4. İmmünohistokimya bloke edici çözelti hazırlayın: 1× PBS /% 1 BSA /% 0.1 Triton X-100. 100 mL için, 10 mL 10× PBS, 10 mL% 10 BSA ve 3.33 mL% 3 Triton X-100'ü 70 mL ultra saf suda seyreltin. Hacmi ultra saf su ile tamamlayın. Her deneye başlamadan önce seyreltilmiş çözeltileri taze olarak hazırlayın.
5. PTw çözeltisi hazırlayın: 1× PBS /% 0.1 Tween-20. 100 mL için, 1 mL %10 Tween-20 ve 10 mL 10× PBS'yi 70 mL ultra saf suda seyreltin. Hacmi ultra saf su ile tamamlayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
6. RNaz içermeyen 0.1 M trietanolamin çözeltisi hazırlayın. 250 mL için, 3.33 mL reaktif dereceli trietanolamini çalkalama altında 200 mL RNaz içermeyen ultra saf su içinde seyreltin (bu çözeltiyi hazırlarken RNaz içermeyen cam eşya ve manyetik karıştırıcı kullanın). HCl ile pH'ı 8.0'a ayarlayın. Hacmi RNaz içermeyen ultra saf su ile tamamlayın ve kullanana kadar ışıktan koruyarak saklayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
7. 1× PBS'de RNaz içermeyen% 0.1 H₂O₂ (h / h) hazırlayın. 1 L için, 100 mL 10× PBS ve 3.3 mL %30_H2O2'yi 500mL RNaz içermeyen ultra saf suda seyreltin. Hacmi RNaz içermeyen ultra saf su ile tamamlayın. Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
8. Aşağıdakilerin RNaz içermeyen çözeltilerini hazırlayın: 0.2 M HCl; 1 m Tris-HCl pH 8.0; 10 mg/mL maya tRNA'sı; % 10 SDS; 10× PBS; ×100 Denhardt'ın çözümü; 20× SSC; % 50 dekstran sülfat; 6 milyon HCl
9. RNaz içermeyen% 4 paraformaldehit fiksatif çözelti hazırlayın. 100 mL için, 4 g paraformaldehiti 80 mL 1× PBS'de çözün. 10 M NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Birimi 1× PBS ile tamamlayın. Bu çözelti, her deney başlamadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
   Dikkat: Paraformaldehit, solunması halinde potansiyel olarak zarar verebilecek tehlikeli bir maddedir. Çeker ocak altında solüsyon hazırlayın ve koruyucu eldiven, maske ve koruyucu gözlük takın.
10. RNaz içermeyen diseksiyon solüsyonu hazırlayın:% 30 sükroz / 0.45 M EDTA pH 8.0 / 1× PBS. 100 mL için, 30 g sakarozu 60 mL RNaz içermeyen 0.5 M EDTA pH 8.0 içinde çözün. 10 mL 10× PBS ekleyin. Hacmi RNaz içermeyen 0,5 M EDTA pH 8.0 ile tamamlayın.
11. RNaz içermeyen cam veya plastik dereceli silindirler ve beherler hazırlayın.
12. RNaz içermeyen ön hibridizasyon ve hibridizasyon çözeltileri hazırlayın: %50 deiyonize formamid (h/h)/600 mM NaCl/200 μg/mL maya tRNA/%0,25 SDS (a/h)/10 mM Tris-HCl pH 8,0/1× Denhardt çözeltisi/1 mM EDTA pH 8,0/%10 dekstran sülfat (a/h). Dereceli bir silindirde 10 mL için 5 mL deiyonize formamid, 1.2 mL 5 M NaCl, 200 μL 10 mg / mL maya tRNA, 250 μL %10 SDS, 100μL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 200 μL 50× Denhardt çözeltisi, 20μL 500 mM EDTA pH 8.0 ve 2 mL %50 dekstran sülfat (M.W. 500.000). Hacmi RNaz içermeyen ultra saf su ile tamamlayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
    NOT: Dekstran sülfat çok viskozdur. Pipetleme hatalarını hesaba katmak için hibridizasyon/ön hibridizasyon çözeltilerinin toplam hacminin fazladan %20'sinin hazırlanması tavsiye edilir. İstenirse maya tRNA'sı ön hibridizasyon çözeltisinden çıkarılabilir.
13. Termoplastik laboratuvar filmi lamellerini hazırlayın. Bir mikroskop lamının uzunluğundan ve genişliğinden 1-2 mm daha kısa dikdörtgen termoplastik laboratuvar filmi parçaları kesin.
14. TN tamponu hazırlayın: 100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl. 100 mL için, 10 mL 1 M Tris-HCl pH 7.5 ve 3 mL 5 M NaCl'yi 70 mL ultra saf suda seyreltin. Hacmi ultra saf su ile tamamlayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
15. TNB bloke edici tamponu hazırlayın: TN Tamponunda% 0.5 bloke edici reaktif A (w / v). 200 mL için, 1 g bloke edici reaktif A'yı 200 mL TN Tamponunda çözün (ticari bloke edici reaktif A kaynağı için Malzeme Tablosuna bakınız).
16. TNT tamponu hazırlayın: TN Tamponunda% 0.05 Ara-20. 1 L için, 950 mL TN tamponunda 5 mL% 10 Tween-20 seyreltin. Köpürmeyi önlemek için hacmi TN tamponu ile yavaşça tamamlayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
17. Tyramide-Alexa 488 çalışma çözümünü hazırlayın: 1× amplifikasyon tamponu A /% 0.0015 H₂O₂/1: 100 tiramid-Alexa 488. 100 μL için, 1 μL% 0.15 H₂O₂ ve 1 μL tiramide-Alexa 488'i 98 μL amplifikasyon tamponu A'da seyreltin (ticari tiramid-Alexa 488 kaynakları ve amplifikasyon tamponu A için Malzeme Tablosuna bakın). Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
18. Tyramide-Alexa 555 çalışma çözümünü hazırlayın: 1× amplifikasyon tamponu A /% 0.0015 H₂O₂ / 1: 100 tiramid-Alexa 555. 100 μL için, 1 μL% 0.15 H₂O₂ ve 1 μL tiramid-Alexa 555'i 98 μL amplifikasyon tamponu A'da seyreltin (ticari tiramide-Alexa 555 kaynakları ve amplifikasyon tamponu A için Malzeme Tablosuna bakın). Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
19. Tiramid-biotin çalışma solüsyonu hazırlayın: 1× amplifikasyon tamponu B /% 0.0015 H₂O₂ / 1: 50 tiramid-biotin. 100 μL için, 1 μL% 0.15_H2O₂ ve 2 μL tiramid-biyotini 97 μL amplifikasyon tamponu B'de seyreltin (ticari tiramit-biyotin kaynakları ve amplifikasyon tamponu B için Malzeme Tablosuna bakınız). Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
20. Cam eşyaları 200 °C'de en az 4 saat pişirin. Tek kullanımlık olmayan plastik malzemelere (sürgülü raflar, Coplin kavanozları ve şırıngalar dahil) 15-30 dakika boyunca %3 H₂O₂ uygulayın, ardından RNaz içermeyen su altında iyice yıkayın. Diseksiyon aletleri, forseps ve kriyostat numune tutucuları gibi paslanmaz çelik metal aletlere 15 dakika boyunca% 3 H₂O₂ uygulayın ve ardından RNaz içermeyen su altında iyice yıkayın. Tezgah yüzeylerini, ısıtılmış plakayı ve kuru blokları RNase temizleme solüsyonu ile temizleyin.

2. Riboprob sentezi

NOT: İn vitro transkripsiyon yoluyla in situ hibridizasyon için 1 kb digoksigenin etiketli cRNA problarını sentezlemek için aşağıdaki prosedür, daha önce yayınlanmış^{protokollere dayanmaktadır 20,21,22,23}.

1. İlgilenilen genden (örneğin, koku alma reseptörü geni) 1 kb'lık bir DNA fragmanını amplifiye etmek için uygun oligonükleotid primer çiftleri kullanın. Tespit edilecek olgun mRNA'da bulunan bir bölgeyi amplifiye eden primer çiftlerini seçin (örneğin, genin kodlama dizisi). Farklı koku alma reseptörleri için bir dizi primer, Malzeme Tablosunda verilmiştir. Diğer vomeronazal koku alma reseptörlerini tespit etmek için problarla ilgili ayrıntılar için lütfen önceki yayınları^{kontrol edin 16,21}.
2. PCR ürünlerini %0.8'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın ve istenen 1 kb bandını çıkarın.
3. Üreticinin protokolüne göre uygun bir mini sütun bazlı jel saflaştırma kiti kullanarak DNA parçasını saflaştırın.
4. Saflaştırılmış DNA fragmanını ölçün ve üreticinin protokolüne göre uygun bir PCR klonlama vektörüne klonlayın. Klonlanmış amplikonu çevreleyen T7 ve SP6 RNA polimeraz promotörleri içeren klonlama vektörlerinin kullanılması tavsiye edilir.
5. Rekombinant plazmidi, üreticinin protokolüne göre kimyasal dönüşüm veya elektroporasyon yoluyla yetkin rekombinasyon içermeyen bakterilere dönüştürün.
6. Tohum, transformant bakteri kolonilerini zengin ortama izole edin ve plazmidi üreticinin protokolüne göre DNA mini hazırlığı yoluyla izole edin.
7. Üreticinin protokolüne göre eklenen DNA parçasının kimliğini ve yönünü kontrol etmek için uygun kısıtlama enzimleri ve/veya Sanger dizilimi ile kısıtlama sindirim analizi yapın.
8. Uygun bir kısıtlama enzimi kullanarak 10 μg plazmiti doğrusallaştırmak için kısıtlama sindirimi gerçekleştirin. İn vitro transkripsiyondan sonra bir anti-sens riboprob üretmek için, genin kodlama dizisinin aşağısında bulunan RNA polimeraz promotörüne karşı ekin uç noktasında plazmit DNA'yı sindiren bir kısıtlama enzimi kullanın. İn vitro transkripsiyondan sonra anlamlı riboproblar üretmek için, genin kodlama dizisinin yukarısında bulunan RNA polimeraz promotörüne karşı ekin ucundaki plazmit DNA'yı sindiren bir kısıtlama enzimi kullanın.
9. Sindirimin eksiksizliğini doğrulamak için plazmid doğrusallaştırma reaksiyonu ürününün bir kısmını %0.8'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın. Tam doğrusallaştırma onaylandıktan sonra, reaksiyonun geri kalanını üreticinin protokolüne göre sütun tabanlı bir PCR temizleme kiti kullanarak saflaştırın.
10. Şablon olarak 1-2 μg doğrusallaştırılmış plazmit, uygun enzim (örneğin, T7 veya SP6 RNA polimeraz) ve uygun bir digoksigenin (DIG) etiketleme kiti kullanarak in vitro transkripsiyon yoluyla digoksigenin etiketli cRNA problarını sentezleyin.
11. DNaz I ile 37 ° C'de 30 dakika sindirerek DNA şablonunu reaksiyondan çıkarın.
12. cRNA problarını, mini kolon bazlı bir RNA saflaştırma kiti veya jel filtrasyon bazlı bir saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Elde edilen probu 50 μL RNaz içermeyen suda elute edin.
13. Elde edilen riboprobu, tercihen florometrik yöntemler kullanarak nicelleştirin. Genellikle beklenen verim 100 ng/μL'nin üzerindedir.
14. Prob kalitesini ve bozulmasını kontrol etmek için riboprobu otomatik bir elektroforez sisteminde veya RNaz içermeyen %0.8 agaroz jel üzerinde çalıştırın.
15. Sentezlenen probu ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.

3. Farelerin koku alma uyaranlarına maruz kalması

1. Maruz kalmadan önce her hayvanı en az 24 saat boyunca temiz bir kafeste ayrı ayrı barındırın. Maruz kalmadan en az 2 saat önce yiyecek ızgarasını çıkarın. Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar 8-12 haftalık erkek C57BL / 6 farelerdi (ortalama ağırlık: 20 g).
2. Uygun koku alma uyaranını hazırlayın. MOE (ana koku alma epiteli) veya VNO'daki (vomeronazal organ) koku alma nöronlarını aktive etmek için farklı uyaranlar kullanılabilir. Koku uyaranlarının kapsamlı bir listesi için lütfen diğer yayınlara^{bakın 3, 16,} 22,23,24. Kimyasal çözeltiler, idrar veya rekombinant protein çözeltisi gibi sıvı uyaranlar, tıbbi bir gazlı bez veya pamuk top üzerinde biriktirilebilir.
3. Koku alma uyaranını kafese yerleştirin ve hayvanı 1 saat boyunca rahatsız etmeyin.
4. Fare deneğine ötenazi yapın ve RNaz içermeyen diseksiyon araçlarını kullanarak MOE veya VNO'yu hızlı bir şekilde inceleyin.

4. Doku diseksiyonu ve dondurma

1. MOE veya VNO'yu diseksiyon solüsyonu kullanarak stereomikroskop altında inceleyin.
   1. VNO için, organı çevreleyen daha yumuşak kıkırdak kabuklarını bırakarak kalın septal kemikleri çıkarın.
2. Kriyo-kesit için numune hazırlayın.
   1. Numuneyi bir parça kurutma kağıdı üzerinde kurulayın ve gömme ortamı içeren histolojik plastik bir kalıba yerleştirin.
   2. VNO için, her bir organı dikey olarak düzenleyin ve 1 mL'lik bir şırınga yardımıyla plastik kalıbın dibine çekin (Şekil 1A).
   3. MOE için, cribriform plaka aşağı bakacak şekilde plastik kalıbın altına yerleştirin.
   4. Numunenin etrafındaki fazla kabarcıkları çıkarın, çünkü bunlar kesit almayı engelleyebilir.
   5. Örnekleri kuru buz üzerinde dondurun.
   6. Numune bloğunu -80 °C'de saklayın.
      NOT: Dondurulmuş numuneler, kesitlere ayrılmadan önce birkaç ay saklanabilir.
3. Kriyo-kesit alma gerçekleştirin.
   1. Kriyostatı açın ve kullanmadan en az 23 saat önce sıcaklığı -4 °C'ye ayarlayın.
   2. Donmuş bloğu histolojik plastik kalıptan çıkarın ve bir tıraş bıçağıyla kesin.
   3. Numunenin etrafında 5 mm bırakın, çünkü bu kesit işlemeyi kolaylaştırır (Şekil 1B).
   4. Bloğu kriyostatın numune tutucusuna takmak için gömme ortamı kullanın.
   5. Pozitif yüklü mikroskop slaytları üzerine 16 μm'lik kesitler toplayın.
   6. Slaytları -80 °C'de saklayın.
      NOT: Slaytlar, yerinde hibridizasyondan önce birkaç ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.

5. Adım adım yerinde hibridizasyon protokolü

1. Slaytları bir saç kurutma makinesi kullanarak 10 dakika kurutun. Slaytların buzunu çözmek için ılık jeti kullanın, ardından gömme ortamı opak olana kadar oda sıcaklığındaki jete geçin.
2. RNaz içermeyen% 4 paraformaldehit fiksatif çözelti slaytı başına 500 μL ekleyin ve histolojik bölümleri sabitlemek için 23-26 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
3. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
4. RNaz içermeyen 0.2 M HCl slayt başına 500 μL ekleyin ve 23-26 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
5. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
6. RNaz içermeyen% 0.1 H₂O₂ / 1 PBS slayt başına 500 μL ekleyin× ve 23-26 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Hidrojen peroksitin ışık kaynaklı bozulmasını önlemek için bu adımı karanlıkta gerçekleştirin.
7. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
8. Slaytları bir çeker ocakta 250 mL RNaz içermeyen trietanolamin 0.1 M pH 8.0 ve manyetik karıştırma çubuğu içeren bir kavanoza aktararak asetilasyon gerçekleştirin. Sürekli karıştırarak 625 μL asetik anhidrit ekleyin. Karıştırma hızını azaltın, slaytların üzerine damla damla 625 μL daha ekleyin, ardından karıştırmayı kapatın ve 10 dakika inkübe edin.
9. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
10. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de 60 ° C'de 5 dakika boyunca bir kez yıkayın.
11. Slaytları 1× PBS'den birer birer çıkararak ve tüy bırakmayan laboratuvar kağıt mendil kullanarak her birini kurulayarak ön hibridizasyon gerçekleştirin. Her slayta 400 μL ön hibridizasyon solüsyonu pipetleyin ve bir su banyosunda veya ısıtılmış fırında 60 °C'de önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. 60 °C'de 1 saat inkübe edin.
12. Mikrofüj tüplerinde slayt başına 200 μL, 60 ° C'ye kadar yeterli hibridizasyon çözeltisini ısıtın ve 10 dakika boyunca 85 ° C'ye kadar ısıtın.
13. Uygun cRNA probunu (probu) hibridizasyon çözeltisi tüplerine (her prob 1 μg/mL) ekleyin ve 85 ° C'de 5 dakika denatüre edin.
14. Hibridizasyon için, nemlendirilmiş odadan her seferinde bir slayt alın, kurulayın ve 60 °C ısıtılmış bir plakaya yerleştirin. 200 μL riboprob içeren hibridizasyon çözeltisi ekleyin ve slaytı bir cam lamel ile örtün. Nemlendirilmiş odada 60 °C'de 12-16 saat inkübe edin.
    NOT: Ön hibridizasyondan sonra slaytların soğumasına izin vermeyin. Hibridizasyon sıcaklığı, her prob için ampirik olarak belirlenmelidir. Altmış santigrat derece, genellikle 1 kb problar için iyi çalıştığı için başlangıç noktası olarak önerilir.
15. SSC yıkama solüsyonlarını ayrı kavanozlarda 55 °C'ye ısıtın ve uygun sıcaklıkta bir su banyosuna koyun.
16. Hibridizasyon bittikten sonra, 55 ° C'de 5 × SSC çözeltisi içeren bir banyo kullanarak lamel her slayttan lameli çıkarın. Her slaytı sıcak SSC çözeltisinin içinde yatay olarak tutun. Lamel ayrıldığında, sürgüyü eğin ve lamellerin aşağıya düşmesine izin verin.
17. Sürgülü bir kavanozda 55 ° C'de 2× SSC ile 30 dakika yıkayın.
18. Sürgülü bir kavanozda 55 ° C'de 20 dakika boyunca ×0,2 SSC ile yıkayın.
19. Sürgülü bir kavanozda 55 ° C'de 20 dakika boyunca 0,1 × SSC ile yıkayın.
20. 23-26 ° C'de ×0.1 SSC'ye aktarın ve bir slayt kavanozunda 3 dakika inkübe edin.
21. Sürgülü bir kavanozda 10 dakika boyunca PTw'de yıkayın.
22. TN Buffer'da her biri 5 dakika boyunca iki kez sürgülü bir kavanozda yıkayın.
23. Her slayta 600 μL TNB bloke edici tampon pipetleyin ve 23-26 ° C'de 3 saat inkübe edin.
24. Her slayta 500 μL primer antikor solüsyonu (TNB solüsyonunda 1:400 oranında seyreltilmiş peroksidaz konjuge anti-DIG antikor) pipetleyin. Her slaytın üzerine dikkatlice bir parça termoplastik laboratuvar filmi yerleştirin ve 4 °C'de 12-16 saat inkübe edin.
25. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.
26. Her slayta 100 μL tiramid-biotin çalışma solüsyonu pipetleyin. Termoplastik laboratuvar filmi lamelleri ile örtün ve 23-26 °C'de 12 dakika inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süreleri üzerinde iyi bir kontrol sağlamak için bu inkübasyon adımını, parti başına 2 veya 3 slayt ile kademeli bir şekilde gerçekleştirin. Tiramid inkübasyon süresinin, cRNA prob duyarlılığına ve konsantrasyonuna bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir.
27. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.
28. Her slayta peroksidaz konjuge streptavidin (SA-HRP, TNB tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş) içeren 200 μL çözelti pipetleyin ve termoplastik bir laboratuvar filmi lamel ile örtün. 23-26 °C'de 1 saat inkübe edin.
29. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.
30. Her slayta 100 μL tiramide-Alexa 488 çalışma solüsyonu pipetleyin, termoplastik laboratuvar filmi lamel ile örtün ve karanlıkta 23-26 °C'de 12 dakika inkübe edin.
31. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.
32. Önceki adımlardan peroksidazları inaktive etmek için% 3 H₂O₂/1 ×PBS'de 1 saat boyunca bir slayt kavanozda 1 saat inkübe edin.
33. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.

6. pS6 immün boyama

1. Her slayta 500 μL %4 paraformaldehit/1× PBS solüsyonu pipetleyin ve bölümleri sabitlemek için 23-26 °C'de 15 dakika inkübe edin.
2. Her slayta 500 μL 1× PBS /% 0.1 Triton X-100 pipetleyin ve bölümleri geçirgenleştirmek için 5 dakika inkübe edin.
3. Sürgülü bir kavanozda 1× PBS ile iki kez yıkayın.
4. Piyasada bulunan tiramid sinyal amplifikasyon bloke edici solüsyon B'nin (Malzeme Tablosu) her bölümü için 2-3 damla pipetleyin ve 23-26 ° C'de 1 saat inkübe edin.
5. Her slayta 400 μL immünohistokimya bloke edici solüsyon pipetleyin ve bölümleri bloke etmek için 23-26 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
6. Her slayta 200 μL tavşan anti-pS6 primer antikor solüsyonu (immünohistokimya bloke etme solüsyonunda 1:200 oranında seyreltilmiş; son konsantrasyon: 1 μg/mL) pipetleyin, termoplastik laboratuvar filmi lamel ile örtün ve 4 °C'de 12-16 saat inkübe edin.
7. 1× PBS/%0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca 3 kez sürgülü bir kavanozda yıkayın.
8. Ticari olarak temin edilebilen peroksidaz konjuge tavşan önleyici ikincil antikor çözeltisinden (Malzeme Tablosu) slayt başına 2-3 damla pipetleyin ve 23-26 ° C'de 1.5 saat inkübe edin.
9. 1× PBS/%0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca 3 kez sürgülü bir kavanozda yıkayın.
10. Kurulayın, slaytları kurulayın ve her slayta 100 ila 200 μL tiramide-Alexa 555 çalışma solüsyonu pipetleyin, bir parça termoplastik laboratuvar filmi lamel ile kaplayın ve karanlıkta 7 dakika inkübe edin.
11. Bir sürgülü kavanozda her biri 5 dakika boyunca 1× PBS ile iki kez yıkayın.
12. Her slayta 500 μL seyreltilmiş nükleer leke (1× PBS'de) pipetleyin ve 23-26 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
13. Bir sürgülü kavanozda 23-26 ° C'de 1× PBS ile her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
14. Slaytları solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı ile monte edin ve montaj ortamının karanlıkta 24 saat kürlenmesine izin verin.
15. Floresan solmasını önlemek için slaytları görüntülemeye kadar uygun sıcaklıkta saklayın.

7. Mikroskopi görüntüleme

1. Kullanılan floroforlar için uygun filtrelerle donatılmış bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak görüntü slaytları.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Mevcut protokol, deneycinin ilgilendiği genin ve nöronal aktivite belirteci pS6'nın floresan olarak etiketlendiği mikroskopi görüntüleri elde etmeyi amaçlamaktadır. Açıklanan yöntem, çok az arka plan ile veya hiç arka plan olmadan net ve güçlü etiketleme üreten Tyramid Signal Amplification'ı içerir. pS6 immün boyama, genellikle tüm nöronal hücre gövdesini dolduran sitoplazmik floresan sinyali olarak görünürken, koku alma reseptörü nöronları için in si...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, nöronal aktivitenin dolaylı bir belirteci olan pS6'nın immünotespiti ile OR veya VR reseptörlerinin yerinde tespitinin bir kombinasyonu yoluyla koku alma sistemindeki kimyasal ipuçlarıyla aktive edilen duyusal nöronları güvenilir bir şekilde tanımlar. Deneyci, histoloji bütünlüğünü korumak için ekstra dikkat göstermeli ve RNaz içermeyen koşullar altında hibridizasyondan önce tüm adımları gerçekleştirmelidir. Bunun yapılm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9625	n/a
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923 or B40922	refered to as Amplification Buffer A in working solutions for tyramide-Alexa 488 or tyramide-Alexa 555 signal amplification
20x SSC	Merck (Calbiochem)	8310-OP	n/a
30% Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck (Sigma-Aldrich)	A9576	n/a
30% hydrogen peroxyde (H2O2)	Merck (Sigma-Aldrich)	H1009	n/a
Acetic anhydride	Merck (Sigma-Aldrich)	320102	n/a
Agarose	Merck (Sigma-Aldrich)	A9539	n/a
Amplification diluent (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	refered to as Amplification Buffer B in working solution for tyramide-biotin signal amplification
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	Cat# 44-923G, RRID:AB_2533798	n/a
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923 or B40922	refered to as blocking solution B in the tyramide signal development step
Blocking reagent (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	refered to as blocking reagent A in the formulation for TNB buffer
DAPI nuclear stain	Thermo Fisher Scientific	D1306	n/a
Denhardt's solution (50x)	Merck (Sigma-Aldrich)	D9905	n/a
Deoinized formamide	Merck (Sigma-Aldrich)	F9037	n/a
Dextran sulfate solution (50%)	Merck (Chemicon)	S4030	n/a
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)	Merck (Sigma-Aldrich)	E9884	n/a
Hoechst 33342 nuclear stain	Thermo Fisher Scientific	H1399	n/a
Hydrochloric acid (HCl)	Merck (Sigma-Aldrich)	320331	n/a
Olfactory stimuli	n/a	Papes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)	n/a
Paraformaldehyde	Merck (Sigma-Aldrich)	P6148	n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments)	Merck (Roche)	11207733910; RRID:AB_514500	refered to as peroxidase-conjugated anti-DIG antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
ProLong Gold antifade mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934	refered to as anti-fading mounting medium
RNase-free ultrapure water	Thermo Fisher Scientific	10977015	n/a
Sodium chloride (NaCl)	Merck (Sigma-Aldrich)	S9888	n/a
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Merck (Sigma-Aldrich)	436143	n/a
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck (Sigma-Aldrich)	S8045	n/a
Sucrose	Merck (Sigma-Aldrich)	S0389	n/a
Triethanolamine	Merck (Sigma-Aldrich)	T58300	n/a
Triton X-100	Merck (Sigma-Aldrich)	X100	n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)	Merck (Sigma-Aldrich)	T5941	n/a
Tween-20	Merck (Sigma-Aldrich)	822184	n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923	n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
Yeast tRNA	Merck (Roche)	10109495001	n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit	Thermo Fisher Scientific	B40923	n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)	Merck (Roche)	11175025910	n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape)	Agilent	5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579	refered to as automated electrophoresis system
Mouse: C57BL/6J inbred strain	Jackson Laboratories	Stock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)	n/a
ProbeQuant G-50 Micro Columns	Cytiva Biosciences	28903408	refered to as gel filtration-based purification kit
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28506	refered to as mini column-based gel-purification kit
RNeasy MinElute cleanup kit	Qiagen	74204	refered to as mini column-based RNA purification kit
TSA Biotin kit	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
Oligonucleotides
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG CAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT TCCC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA GAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA ACG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA ATAGTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT GTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT GGC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG TTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC AAGC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA CTG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG AG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT TCTTACAGGACAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT AAGCAAGGAATTCCAC – 3'	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC CAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC CAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG ATCT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC A – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC TTCTGGAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG CCAGATATGTCAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT CCCAGATGCTTTTGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT AGCTGAGAAATACAAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA GA – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA CTGT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT TCC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT TGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG GC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC C – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC AG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA AGCATCG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT TGGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT TTAGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT GATGTGA – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT CTACTACACCATGATGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vector	Promega	A1360	reccommended PCR cloning vector
Other materials
1mL syringes	Fisher Scientific	14-829-10F	n/a
Conical tubes (15 mL and 50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22, 14-959-49B	n/a
Coplin jars	Fisher Scientific	12-567-099, 07-200-81	n/a
Cryostat	Leica Biosystems	CMS 1850	n/a
Dissecting tools and forceps	Roboz	RS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111	n/a
Dry bath	n/a	n/a	n/a
Electrophoresis equipment	Fisher Scientific	09-528-110B	n/a
Fine point paintbrushes	Winsor & Newton	10269097	n/a
Fluorescence or confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5II	n/a
Heated plate	Fisher Scientific	HP88850200	n/a
Humidified chamber (if used at higher temperatures, it will need to be sealed inside a plastic Tupperware container)	Thermo Fisher Scientific	22-045-034	n/a
Lint-free laboratory Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	refered to as lint-free laboratory tissue paper
Microcentrifuge	Eppendorf	5401000013	n/a
Mouse cages	InnoVive	M-BTM, MVX1	n/a
PCR Thermocycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	n/a
Pipette p1000, p200, and p20 disposable tips	Fisher Scientific	02-707-408, 02-707-411, 02-707-438	n/a
Plastic histology embedding mold	Thermo Fisher Scientific	22-19	n/a
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	refered to as highly sensitive fluorometric method
Razor blades or scalpels	Fisher Scientific	12-640	n/a
RNA tapestation or BioAnalyzer	Agilent	4200 TapeStation System or 2100 Bioanalyzer Instrument	n/a
RNase-free glass or plastic graduated cylinders and beakers	Fisher Scientific	10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25D	n/a
Stereomicroscope	Leica Microsystems	M80	n/a
SuperFrost Plus microscope slides	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	referred to as positively charged microscope slides
Parafilm	Bemis Company	PM999	refered to as thermoplastic laboratory film
Water bath	Thermo Fisher Scientific	TSCIR19	n/a