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Résumé

Ce protocole combine l’hybridation in situ avec l’immunofluorescence pour identifier les gènes des récepteurs olfactifs et voméronasaux exprimés dans les neurones sensoriels olfactifs après activation par des stimuli chimiques chez la souris.

Résumé

Les animaux s’appuient sur la communication chimique pour transmettre et percevoir des informations environnementales pertinentes, allant de l’évaluation de la qualité de la nourriture à la détection des partenaires d’accouplement disponibles ou des menaces. Chez la souris, cette tâche est exécutée principalement par le système olfactif et ses sous-systèmes sous-jacents, y compris les systèmes olfactifs principaux et accessoires. Les deux ont des organes périphériques peuplés de neurones sensoriels exprimant des récepteurs couplés aux protéines G capables de se lier à des signaux chimiques qui atteignent la cavité nasale. Même si les caractéristiques moléculaires de ces récepteurs sont bien comprises, on sait peu de choses sur leurs ligands spécifiques apparentés. La méthode décrite ici combine la détection par hybridation in situ de récepteurs olfactifs ou voméronasaux avec l’immunodétection de la protéine ribosomique phosphorylée S6 (pS6) - un marqueur de l’activation neuronale. Ce protocole a été conçu pour identifier les neurones activés après un seul événement d’exposition à des stimuli chimiques purifiés ou complexes détectés par les organes olfactifs. Il est important de noter que cette technique permet d’étudier les neurones déclenchés dans des contextes biologiquement pertinents. Idéalement, cette méthode devrait être utilisée pour sonder la biologie moléculaire du système olfactif et pour étudier les comportements olfactifs.

Introduction

La chimiosignalisation est la forme de communication la plus répandue chez les animaux. Chez les mammifères, la détection des signaux chimiques est principalement médiée par l’olfaction et est primordiale pour trouver de la nourriture, localiser des partenaires d’accouplement possibles et éviter les prédateurs potentiels 1,2,3. Le système olfactif de la souris est ensuite divisé en différents sous-systèmes, chacun ayant ses propres propriétés anatomiques, physiologiques et moléculaires4. Parmi ceux-ci, le système olfactif principal (MOS) et le système olfactif accessoire (AOS) sont les plus largement étudiés et les mieux caractérisés.

Le MOS est principalement responsable de la détection des molécules chimiques volatiles qui atteignent la cavité nasale. Ceci est accompli par les neurones sensoriels olfactifs (OSN), qui peuplent l’interface sensorielle du système - l’épithélium olfactif principal (MOE). Chaque OSN exprime un récepteur olfactif (OR) sur des milliers de manière monogénique et monoallélique5. De plus, les OR ont tendance à être largement réglés6, et un seul odorant peut se lier à plus d’un OR, générant un code combinatoire pour les odeurs7.

À son tour, l’AOS est principalement responsable de la détection des phéromones et des kairomones. Ces ligands activent les neuros sensoriels voméronasaux (VSN) dans l’organe voméronasal (VNO). Les VSN de la zone apicale du VNO expriment les récepteurs de la famille des récepteurs vomérosaux 1 (V1Rs)8, tandis que les neurones de la zone basale expriment la famille des récepteurs vomérosaux 2 (V2Rs)9. Il est important de noter qu’il a été démontré que certains VSN co-expriment plus d’un récepteur voméronasal 10,11,12.

Malgré toutes les informations disponibles sur les caractéristiques moléculaires des RO et des VR, les connaissances sur leurs ligands apparentés sont encore très limitées. L’identification de neurones olfactifs spécifiques responsables de la détection d’une molécule ou d’un stimulus complexe est une tâche importante pour ceux qui étudient l’olfaction, les comportements olfactifs et les réponses physiologiques. Plusieurs stratégies ont été tentées pour désorphaniser les récepteurs olfactifs, notamment l’imagerie calcique7, le séquençage de l’ARN unicellulaire13,14, l’expression des récepteurs hétérologues15 et les stratégies basées sur les gènes précoces immédiats (IEG)16. Plus récemment, certaines techniques ont été employées pour évaluer les effets modulateurs des odorants dans les neurones sensoriels, à l’aide de l’imagerie calcique in vivo 17,18 et de stratégies de séquençage de l’ARN unicellulaire marquées par des protéines fluorescentes19. La plupart de ces techniques nécessitent une configuration artificielle ou sont réalisées sur des neurones dissociés, ce qui rend impossible l’évaluation simultanée des comportements déclenchés par les odeurs utilisées.

Le protocole décrit ici permet d’identifier les neurones sensoriels activés après un seul événement d’exposition aux odeurs, en combinant des riboprobes qui détectent des ORs ou des VR spécifiques avec l’immunodétection de la protéine ribosomique S6 phosphorylée (pS6), un proxy de l’activation neuronale. Cette méthode est un moyen fiable d’étudier l’identité des neurones sensoriels activés par différents signaux chimiochimiques dans un contexte biologiquement pertinent.

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Protocole

Les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément au protocole animal #1883-1, approuvé par l’Université de Campinas (Comité institutionnel de l’Institut de biologie sur le soin et l’utilisation des animaux - Comité pour l’éthique de l’utilisation des animaux dans la recherche), qui suit les directives établies par le Conseil national fédéral de contrôle de l’expérimentation animale (CONCEA).

1. Préparation du matériel

  1. Préparez 1 L de 3 % H2O2 (v/v) dans 1x PBS. Diluer 100 mL 10× PBS et 100 mL de 30 %H 2O2 dans 500 mL d’eau ultrapure. Complétez le volume avec de l’eau ultra-pure. Préparez cette solution immédiatement avant utilisation.
  2. Préparez une chambre humidifiée contenant des morceaux de lingettes de laboratoire non pelucheuses mouillées avec une solution de SSC 5×.
  3. Préparez des solutions de lavage d’hybridation : 5× SSC (à 55 °C), 2× SSC (55 °C), 0,2× SSC (55 °C) et 0,1 × SSC (55 °C et température ambiante). Dissoudre les volumes appropriés de solution mère de SSC à 20 × dans de l’eau ultrapure sans RNase. Préparez les solutions diluées fraîches avant le début de chaque expérience.
  4. Préparez une solution bloquante d’immunohistochimie : 1× PBS/1 % BSA/0,1 % Triton X-100. Pour 100 ml, diluer 10 ml de PBS 10×, 10 ml de BSA à 10 % et 3,33 ml de Triton X-100 à 3 % dans 70 mL d’eau ultrapure. Complétez le volume avec de l’eau ultra-pure. Préparez les solutions diluées fraîches avant le début de chaque expérience.
  5. Préparez la solution PTw : 1× PBS/0,1 % Tween-20. Pour 100 ml, diluer 1 mL de Tween-20 à 10 % et 10 mL de PBS à 10× dans 70 mL d’eau ultrapure. Complétez le volume avec de l’eau ultra-pure. Préparez cette solution à neuf avant le début de chaque expérience.
  6. Préparez une solution de triéthanolamine 0,1 M sans RNase. Pour 250 ml, diluer 3,33 ml de triéthanolamine de qualité réactif dans 200 ml d’eau ultrapure sans RNase sous agitation (utiliser de la verrerie sans RNase et un agitateur magnétique lors de la préparation de cette solution). Ajustez le pH à 8,0 avec du HCl. Complétez le volume avec de l’eau ultrapure sans RNase et conservez-la à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation. Préparez cette solution à neuf avant le début de chaque expérience.
  7. Préparez sans RNase 0,1 % H2O2 (v/v) dans 1× PBS. Pour 1 L, diluer 100 mL de PBS 10× et 3,3 mL de 30 % H2O2 dans 500 mL d’eau ultrapure sans RNase. Complétez le volume avec de l’eau ultrapure sans RNase. Préparez cette solution immédiatement avant utilisation.
  8. Préparer des solutions exemptes de RNase des éléments suivants : HCl 0,2 M ; 1 M Tris-HCl pH 8,0 ; 10 mg/mL d’ARNt de levure ; 10 % SDS ; 10× PBS ; 100× la solution de Denhardt ; 20× SSC ; 50 % de sulfate de dextran ; 6 M HCl
  9. Préparez une solution fixatrice de paraformaldéhyde à 4 % sans RNase. Pour 100 ml, dissoudre 4 g de paraformaldéhyde dans 80 ml de 1× de PBS. Ajustez le pH à 7,4 avec 10 M de NaOH. Complétez le volume avec 1× PBS. Cette solution doit être préparée fraîche avant le début de chaque expérience.
    Prudence: Le paraformaldéhyde est une substance dangereuse qui peut potentiellement causer des dommages en cas d’inhalation. Préparez la solution sous une hotte et portez des gants de protection, un masque et des lunettes de sécurité.
  10. Préparer une solution de dissection sans RNase : 30 % de saccharose/0,45 M EDTA pH 8,0/1× PBS. Pour 100 ml, dissoudre 30 g de saccharose dans 60 ml de 0,5 M EDTA sans RNase pH 8,0. Ajouter 10 ml de PBS 10×. Complétez le volume avec de l’EDTA sans RNase 0,5 M pH 8,0.
  11. Préparez des cylindres et des béchers gradués en verre ou en plastique sans RNase.
  12. Préparez des solutions de pré-hybridation et d’hybridation sans RNase : 50 % de formamide désionisé (v/v)/600 mM de NaCl/200 μg/mL d’ARNt de levure/0,25 % de SDS (p/v)/10 mM de Tris-HCl pH 8,0/1× solution de Denhardt/1 mM d’EDTA pH 8,0/10 % de sulfate de dextran (p/v). Pour une dose de 10 mL dans un cylindre gradué, ajouter 5 mL de formamide désionisé, 1,2 mL de 5 M de NaCl, 200 μL d’ARNt de levure à 10 mg/mL, 250 μL de SDS à 10 %, 100 L de 1 M de Tris-HCl pH 8,0, 200 μL de solution de Denhardt à 50×, 20 L de 500 mM d’EDTA pH 8,0 et 2 mL de sulfate de dextran à 50 % (M.W. 500,000). Complétez le volume avec de l’eau ultrapure sans RNase. Préparez cette solution à neuf avant le début de chaque expérience.
    REMARQUE : Le sulfate de dextran est très visqueux. Il est conseillé de préparer 20 % supplémentaires du volume total des solutions d’hybridation/pré-hybridation pour tenir compte des erreurs de pipetage. L’ARNt de levure peut être omis de la solution de pré-hybridation, si vous le souhaitez.
  13. Préparer des lamelles de film de laboratoire thermoplastique. Coupez des morceaux de film de laboratoire thermoplastique rectangulaire de 1 à 2 mm plus courts que la longueur et la largeur d’une lame de microscope.
  14. Préparation du tampon TN : 100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl. Pour 100 ml, diluer 10 mL de 1 M de Tris-HCl pH 7,5 et 3 mL de 5 M de NaCl dans 70 mL d’eau ultrapure. Complétez le volume avec de l’eau ultra-pure. Préparez cette solution à neuf avant le début de chaque expérience.
  15. Préparez le tampon de blocage TNB : 0,5 % de réactif de blocage A (w/v) dans le tampon TN. Pour 200 ml, dissoudre 1 g de réactif de blocage A dans 200 ml de tampon TN (voir le Tableau des matériaux pour la source commerciale du réactif de blocage A).
  16. Préparation du tampon TNT : 0,05 % de Tween-20 dans le tampon TN. Pour 1 L, diluer 5 mL de Tween-20 à 10 % dans 950 mL de tampon TN. Complétez lentement le volume avec un tampon TN pour éviter la formation de mousse. Préparez cette solution à neuf avant le début de chaque expérience.
  17. Préparer la solution de travail de Tyramide-Alexa 488 : 1× tampon d’amplification A/0,0015 % H2O2/1:100 tyramide-Alexa 488. Pour 100 μL, diluer 1 μL de 0,15 % H2O2 et 1 μL de tyramide-Alexa 488 dans 98 μL de tampon d’amplification A (voir le Tableau des matériaux pour les sources commerciales de tyramide-Alexa 488 et de tampon d’amplification A). Préparez cette solution immédiatement avant utilisation.
  18. Préparez la solution de travail de Tyramide-Alexa 555 : 1× tampon d’amplification A/0,0015 % H2O2/1:100 tyramide-Alexa 555. Pour 100 μL, diluer 1 μL de 0,15 % de H2O2 et 1 μL de tyramide-Alexa 555 dans 98 μL de tampon d’amplification A (voir le Tableau des matériaux pour les sources commerciales de tyramide-Alexa 555 et de tampon d’amplification A). Préparez cette solution immédiatement avant utilisation.
  19. Préparer la solution de travail Tyramide-biotine : 1× tampon d’amplification B/0,0015 % H2O2/1:50 tyramide-biotine. Pour 100 μL, diluer 1 μL de 0,15 % de H,2O2 et 2 μL de tyramide-biotine dans 97 μL de tampon d’amplification B (voir le Tableau des matériaux pour les sources commerciales de tyramide-biotine et le tampon d’amplification B). Préparez cette solution immédiatement avant utilisation.
  20. Faites cuire la verrerie à 200 °C pendant au moins 4 h. Traitez les articles en plastique non jetables (y compris les supports à glissières, les bocaux Coplin et les seringues) avec 3 %H 2O2 pendant 15 à 30 min, suivi d’un lavage complet à l’eau sans RNase. Traitez les instruments métalliques en acier inoxydable, tels que les outils de dissection, les pinces et les porte-échantillons de cryostat, avec 3 %de H 2O2 pendant 15 min, suivi d’un lavage complet à l’eau sans RNase. Nettoyez les surfaces des paillasses, les plaques chauffantes et les blocs secs avec la solution de nettoyage RNase.

2. Synthèse de ribosondes

REMARQUE : La procédure suivante pour synthétiser des sondes d’ARNc marquées à la digoxigénine de 1 kb pour l’hybridation in situ par transcription in vitro est basée sur les protocoles 20,21,22,23 précédemment publiés.

  1. Utilisez des paires d’amorces oligonucléotidiques appropriées pour amplifier un fragment d’ADN de 1 kb à partir du gène d’intérêt (p. ex., gène du récepteur olfactif). Sélectionnez des paires d’amorces qui amplifient une région présente dans l’ARNm mature à détecter (par exemple, la séquence codante du gène). Une sélection d’amorces pour différents récepteurs olfactifs est fournie dans la Table des matériaux. Pour plus de détails sur les sondes permettant de détecter d’autres récepteurs olfactifs voméronasals, veuillez consulter les publications précédentes16,21.
  2. Exécutez les produits PCR sur un gel d’agarose à 0,8 % et retirez la bande de 1 kb souhaitée.
  3. Purifiez le fragment d’ADN à l’aide d’un mini kit de purification de gel sur colonne approprié selon le protocole du fabricant.
  4. Quantifiez le fragment d’ADN purifié et clonez-le dans un vecteur de clonage PCR approprié selon le protocole du fabricant. Il est conseillé d’utiliser des vecteurs de clonage contenant des promoteurs d’ARN polymérase T7 et SP6 flanquant l’amplicon cloné.
  5. Transformer le plasmide recombinant en bactéries compétentes sans recombinaison par transformation chimique ou électroporation selon le protocole du fabricant.
  6. Isolez les colonies bactériennes transformantes dans un milieu riche et isolez le plasmide via une mini-préparation de l’ADN selon le protocole du fabricant.
  7. Effectuer une analyse de digestion de restriction avec des enzymes de restriction appropriées et/ou un séquençage de Sanger pour vérifier l’identité et l’orientation du fragment d’ADN inséré selon le protocole du fabricant.
  8. Effectuez une digestion de restriction pour linéariser 10 μg du plasmide à l’aide d’une enzyme de restriction appropriée. Pour produire un riboprobe anti-sens après transcription in vitro , utilisez une enzyme de restriction qui digère l’ADN plasmidique à l’extrémité de l’insert opposé au promoteur de l’ARN polymérase situé en aval de la séquence codante du gène. Pour produire des riboprobes sensorielles après transcription in vitro , utilisez une enzyme de restriction qui digère l’ADN plasmidique à l’extrémité de l’insert opposé au promoteur de l’ARN polymérase situé en amont de la séquence codante du gène.
  9. Exécutez une aliquote du produit de réaction de linéarisation plasmidique sur un gel d’agarose à 0,8 % pour confirmer l’exhaustivité de la digestion. Une fois la linéarisation complète confirmée, purifier le reste de la réaction à l’aide d’un kit de nettoyage PCR sur colonne selon le protocole du fabricant.
  10. Synthétisez des sondes d’ARNc marquées à la digoxigénine par transcription in vitro en utilisant 1 à 2 μg du plasmide linéarisé comme matrice, l’enzyme appropriée (par exemple, ARN polymérase T7 ou SP6) et un kit de marquage de digoxigénine (DIG) approprié.
  11. Retirer la matrice d’ADN de la réaction en la digérant avec la DNase I à 37 °C pendant 30 min.
  12. Purifiez les sondes d’ARNc à l’aide d’un kit de purification d’ARN basé sur une mini-colonne ou d’un kit de purification basé sur une filtration sur gel. Éluer la sonde résultante dans 50 μL d’eau exempte de RNase.
  13. Quantifier le riboprobe résultant, de préférence à l’aide de méthodes fluorométriques. Habituellement, le rendement attendu est supérieur à 100 ng/μL.
  14. Exécutez le riboprobe sur un système d’électrophorèse automatisé ou sur un gel d’agarose à 0,8 % sans RNase pour vérifier la qualité et la dégradation de la sonde.
  15. Stockez la sonde synthétisée à -80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

3. Exposition des souris à des stimuli olfactifs

  1. Hébergez individuellement chaque animal dans une cage propre pendant au moins 24 heures avant l’exposition. Retirez la grille alimentaire au moins 2 h avant l’exposition. Tous les animaux utilisés dans cette étude étaient des souris mâles C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines (poids moyen : 20 g).
  2. Préparez le stimulus olfactif approprié. Différents stimuli peuvent être utilisés pour activer les neurones olfactifs dans le MOE (épithélium olfactif principal) ou le VNO (organe voméronasal). Pour une liste complète des stimuli olfactifs, veuillez consulter les autres publications3, 16, 22, 23, 24. Les stimuli liquides, tels que les solutions chimiques, l’urine ou la solution de protéines recombinantes, peuvent être déposés sur une gaze médicale ou une boule de coton.
  3. Insérez le stimulus olfactif dans la cage et laissez l’animal tranquille pendant 1 h.
  4. Euthanasiez le sujet souris et disséquez rapidement le MOE ou le VNO à l’aide d’outils de dissection sans RNase.

4. Dissection et congélation des tissus

  1. Disséquer la ME ou le VNO au stéréomicroscope à l’aide d’une solution de dissection.
    1. Pour le VNO, retirez les os septaux épais, laissant les coquilles cartilagineuses plus molles entourant l’organe.
  2. Préparer l’échantillon pour la cryosection.
    1. Séchez l’échantillon sur une feuille de papier buvard et placez-le dans un moule en plastique histologique contenant un support d’enrobage.
    2. Pour le VNO, disposez chaque organe verticalement et tirez-le vers le bas du moule en plastique à l’aide d’une seringue de 1 mL (Figure 1A).
    3. Pour MOE, placez-le au fond du moule en plastique avec la plaque cribriforme vers le bas.
    4. Retirez l’excès de bulles autour de l’échantillon, car elles peuvent interférer avec la section.
    5. Congelez les échantillons sur de la glace sèche.
    6. Stockez le bloc d’échantillons à -80 °C.
      REMARQUE : Les échantillons congelés peuvent être conservés pendant plusieurs mois avant d’être sectionnés.
  3. Effectuer une cryo-section.
    1. Allumez le cryostat et réglez la température à -23 °C au moins 4 h avant de l’utiliser.
    2. Retirez le bloc congelé du moule en plastique histologique et coupez-le avec une lame de rasoir.
    3. Laissez 5 mm autour de l’éprouvette, car cela facilite la manipulation de la section (Figure 1B).
    4. Utilisez un milieu d’enrobage pour fixer le bloc au porte-échantillon du cryostat.
    5. Prélever des coupes de 16 μm sur des lames de microscope chargées positivement.
    6. Stockez les lames à -80 °C.
      REMARQUE : Les lames peuvent être entreposées à -80 °C pendant plusieurs mois avant l’hybridation in situ .

5. Protocole d’hybridation in situ étape par étape

  1. Séchez les lames pendant 10 min à l’aide d’un sèche-cheveux. Utilisez le jet chaud pour dégivrer les lames, puis passez au jet à température ambiante jusqu’à ce que le support d’enrobage soit opaque.
  2. Ajouter 500 μL par lame de solution fixatrice de paraformaldéhyde à 4 % sans RNase et incuber à 23-26 °C pendant 15 min pour fixer les coupes histologiques.
  3. Lavez les lames deux fois dans du PBS sans RNase 1× pendant 5 minutes chacune.
  4. Ajouter 500 μL par lame de HCl 0,2 M sans RNase et incuber à 23-26 °C pendant 10 min.
  5. Lavez les lames deux fois dans du PBS sans RNase 1× pendant 5 minutes chacune.
  6. Ajouter 500 μL par lame de PBS sans RNase à 0,1 % H2O2/1× et incuber pendant 30 min à 23-26 °C. Effectuez cette étape dans l’obscurité pour éviter la dégradation du peroxyde d’hydrogène induite par la lumière.
  7. Lavez les lames deux fois dans 1× PBS sans RNase pendant 5 minutes chacune.
  8. Effectuer l’acétylation en transférant les lames dans un bocal contenant 250 mL de triéthanolamine sans RNase à 0,1 M pH 8,0 et un barreau d’agitation magnétique, dans une hotte. Ajouter 625 μL d’anhydride acétique en agitant constamment. Réduisez la vitesse d’agitation, ajoutez 625 μL goutte à goutte sur les lames, puis éteignez l’agitation et incubez pendant 10 min.
  9. Lavez les lames deux fois dans 1× PBS sans RNase pendant 5 minutes chacune.
  10. Laver les lames une fois dans un PBS sans RNase 1× à 60 °C pendant 5 min.
  11. Effectuez la pré-hybridation en retirant les lames de 1× PBS une à la fois et en épongeant chacune d’entre elles à l’aide de papier de soie de laboratoire non pelucheux. Placez 400 μL de solution de pré-hybridation sur chaque lame et placez-la dans une chambre humidifiée préchauffée à 60 °C dans un bain-marie ou un four chauffé. Incuber à 60 °C pendant 1 h.
  12. Chauffer suffisamment de solution d’hybridation à 60 °C, aliquote 200 μL par lame dans des tubes de microfuge, et les chauffer à 85 °C pendant 10 min.
  13. Ajouter la ou les sondes d’ARNc appropriées dans les tubes de solution d’hybridation (1 μg/mL par sonde) et dénaturer à 85 °C pendant 5 min.
  14. Pour l’hybridation, prélevez une lame à la fois de la chambre humidifiée, séchez-la et placez-la sur une plaque chauffée à 60 °C. Ajouter 200 μL de solution d’hybridation contenant du riboprobe et recouvrir la lame d’une lamelle en verre. Incuber pendant 12 à 16 h dans la chambre humidifiée à 60 °C.
    REMARQUE : Ne laissez pas les lames refroidir après la pré-hybridation. La température d’hybridation doit être déterminée empiriquement pour chaque sonde. Soixante degrés Celsius sont suggérés comme point de départ, car cela fonctionne généralement bien pour des sondes de 1 kb.
  15. Chauffez les solutions de lavage SSC à 55 °C dans des bocaux séparés et placez-les dans un bain-marie à la température appropriée.
  16. Une fois l’hybridation terminée, retirer la lamelle de chaque lame à l’aide d’un bain contenant une solution de SSC 5× à 55 °C. Tenez chaque lame horizontalement à l’intérieur de la solution SSC chaude. Lorsque la lamelle s’est détachée, inclinez la glissière et laissez la lamelle tomber vers le bas.
  17. Laver avec 2× SSC à 55 °C pendant 30 min dans un bocal à lames.
  18. Laver avec 0,2 × SSC à 55 °C pendant 20 min dans un bocal à lames.
  19. Laver avec 0,1× SSC à 55 °C pendant 20 min dans un bocal à lames.
  20. Transférer à 0,1× SSC à 23-26 °C et incuber pendant 3 min dans un bocal à lames.
  21. Laver en PTw pendant 10 min dans un bocal à lames.
  22. Laver deux fois dans un tampon TN, pendant 5 minutes chacune, dans un bocal à lames.
  23. Pipeter 600 μL de tampon de blocage TNB sur chaque lame et incuber pendant 3 h à 23-26 °C.
  24. Pipeter 500 μL d’une solution d’anticorps primaires (anticorps anti-DIG conjugué à la peroxydase dilué 1:400 dans une solution de TNB) sur chaque lame. Superposez soigneusement un morceau de film de laboratoire thermoplastique sur chaque lame et incubez pendant 12 à 16 h à 4 °C.
  25. Lavez les lames 6 fois avec un tampon TNT pendant 5 minutes chacune, en remuant doucement dans un bocal à lames.
  26. Pipeter 100 μL de solution de travail tyramide-biotine sur chaque lame. Couvrir avec des lamelles de laboratoire en film thermoplastique et incuber pendant 12 min à 23-26 °C.
    REMARQUE : Effectuez cette étape d’incubation de manière échelonnée, avec 2 ou 3 lames par lot, pour permettre un bon contrôle des temps d’incubation. Il peut être nécessaire d’optimiser la durée d’incubation du tyramide, en fonction de la sensibilité et de la concentration de la sonde d’ARNc.
  27. Lavez les lames 6 fois avec un tampon TNT pendant 5 minutes chacune, en remuant doucement dans un bocal à lames.
  28. Pipeter 200 μL de solution contenant de la streptavidine conjuguée à la peroxydase (SA-HRP, diluée 1:100 dans un tampon TNB) sur chaque lame et couvrir d’une lamelle de film de laboratoire thermoplastique. Incuber à 23-26 °C pendant 1 h.
  29. Lavez les lames 6 fois avec un tampon TNT pendant 5 minutes chacune, en remuant doucement dans un bocal à lames.
  30. Pipeter 100 μL de solution de travail de tyramide-Alexa 488 sur chaque lame, couvrir d’une lamelle de laboratoire thermoplastique et incuber à 23-26 °C pendant 12 min dans l’obscurité.
  31. Lavez les lames 6 fois avec un tampon TNT pendant 5 minutes chacune, en remuant doucement dans un bocal à lames.
  32. Incuber à 3 % H2O2/1× PBS dans un bocal à lames pendant 1 h, pour inactiver les peroxydases des étapes précédentes.
  33. Lavez les lames 6 fois avec un tampon TNT pendant 5 minutes chacune, en remuant doucement dans un bocal à lames.

6. Immunomarquage pS6

  1. Pipeter 500 μL de solution de paraformaldéhyde à 4 %/1× PBS sur chaque lame et incuber à 23-26 °C pendant 15 minutes pour fixer les sections.
  2. Pipeter 500 μL de 1× PBS/0,1 % Triton X-100 sur chaque lame et incuber pendant 5 min pour perméabiliser les sections.
  3. Laver deux fois avec 1× PBS dans un bocal à lames.
  4. Pipeter 2 à 3 gouttes par section de la solution de blocage de l’amplification du signal de tyramide B (Table des matériaux) disponible dans le commerce et incuber à 23-26 °C pendant 1 h.
  5. Placez une pipette de 400 μL de solution de blocage de l’immunohistochimie sur chaque lame et incubez à 23-26 °C pendant 30 minutes pour bloquer les sections.
  6. Pipeter 200 μL de solution primaire d’anticorps anti-pS6 de lapin (diluée 1:200 dans une solution bloquant l’immunohistochimie ; concentration finale : 1 μg/mL) sur chaque lame, couvrir d’une lamelle de laboratoire thermoplastique et incuber à 4 °C pendant 12 à 16 h.
  7. Laver 3 fois avec 1× de PBS/0,1 % Triton X-100, pendant 5 minutes chacune dans un bocal à lames.
  8. Pipeter 2 à 3 gouttes par lame d’une solution d’anticorps secondaires anti-lapin conjuguée à la peroxydase disponible dans le commerce (tableau des matériaux) et incuber à 23-26 °C pendant 1,5 h.
  9. Laver 3 fois avec 1× de PBS/0,1 % Triton X-100, pendant 5 minutes chacune dans un bocal à lames.
  10. Épongez les lames à sec et placez par pipette 100 à 200 μL de solution de travail tyramide-Alexa 555 sur chaque lame, recouvrez-les d’un morceau de lamelle de film de laboratoire thermoplastique et incubez pendant 7 min dans l’obscurité.
  11. Lavez deux fois avec 1× PBS pendant 5 min chacun dans un bocal à lames.
  12. Pipeter 500 μL de colorant nucléaire dilué (dans 1× PBS) sur chaque lame et incuber à 23-26 °C pendant 30 min.
  13. Laver deux fois avec 1× PBS à 23-26 °C pendant 5 min chacun dans un bocal à lames.
  14. Montez les diapositives avec un support de montage anti-décoloration et laissez le support de montage durcir pendant 24h dans l’obscurité.
  15. Stockez les lames à la température appropriée jusqu’à l’imagerie, afin d’éviter l’évanouissement par fluorescence.

7. Imagerie microscopique

  1. Image des lames à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou confocal équipé de filtres appropriés pour les fluorophores utilisés.

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Résultats

Le protocole actuel vise à obtenir des images microscopiques dans lesquelles le gène d’intérêt de l’expérimentateur et le marqueur d’activité neuronale pS6 sont marqués par fluorescence. La méthode décrite implique l’amplification du signal Tyramide, qui produit un marquage clair et fort avec peu ou pas de bruit de fond. L’immunomarquage pS6 se présente sous la forme d’un signal fluorescent cytoplasmique qui remplit généralement l’ensemble du corps cellulaire ne...

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Discussion

Le protocole décrit ici identifie de manière fiable les neurones sensoriels activés par des signaux chimiques dans le système olfactif grâce à une combinaison de détection in situ des récepteurs OR ou VR et d’immunodétection de pS6, un marqueur indirect de l’activité neuronale. L’expérimentateur doit prendre des précautions supplémentaires pour maintenir l’intégrité histologique et effectuer toutes les étapes avant l’hybridation dans des conditions exem...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt concurrent d’aucune sorte.

Remerciements

Nous remercions GAG Pereira et JA Yunes pour leurs ressources, APF Ferreira et WO Bragança pour leur aide administrative et technique, et le personnel de la plateforme des sciences de la vie (LaCTAD-UNICAMP) pour son aide en microscopie confocale. Ce travail a été soutenu par la Fondation pour la Recherche de São Paulo (FAPESP ; subventions 2009/00473-0 et 2015/50371-0 à F.P.), par PRP/UNICAMP (subventions 2969/16, 725/15, 348/14 et 315/12 à F.P.), par les bourses FAPESP à V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1), et par la bourse Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) à T.S.N.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10x phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922refered to as Amplification Buffer A in working solutions for tyramide-Alexa 488 or tyramide-Alexa 555 signal amplification
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% Bovine Serum Albumin (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
30% hydrogen peroxyde (H2O2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
Acetic anhydrideMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgaroseMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Amplification diluent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EArefered to as Amplification Buffer B in working solution for tyramide-biotin signal amplification
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibodyThermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922refered to as blocking solution B in the tyramide signal development step
Blocking reagent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EArefered to as blocking reagent A in the formulation for TNB buffer
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt's solution (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Deoinized formamideMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Dextran sulfate solution (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 nuclear stainThermo Fisher ScientificH1399n/a
Hydrochloric acid (HCl)Merck (Sigma-Aldrich)320331n/a
Olfactory stimulin/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
ParaformaldehydeMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments)Merck (Roche)11207733910; RRID:AB_514500refered to as peroxidase-conjugated anti-DIG antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold antifade mountantThermo Fisher ScientificP36934refered to as anti-fading mounting medium
RNase-free ultrapure waterThermo Fisher Scientific10977015n/a
Sodium chloride (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Sodium hydroxide (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
SucroseMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TriethanolamineMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Yeast tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape)Agilent5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579refered to as automated electrophoresis system
Mouse: C57BL/6J inbred strainJackson LaboratoriesStock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Micro ColumnsCytiva Biosciences28903408refered to as gel filtration-based purification kit
QIAquick gel extraction kitQiagen28506refered to as mini column-based gel-purification kit
RNeasy MinElute cleanup kitQiagen74204refered to as mini column-based RNA purification kit
TSA Biotin kitAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotides
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vectorPromegaA1360reccommended PCR cloning vector
Other materials
1mL syringesFisher Scientific14-829-10Fn/a
Conical tubes (15 mL and 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Coplin jarsFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Dissecting tools and forcepsRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
Dry bathn/an/an/a
Electrophoresis equipmentFisher Scientific09-528-110Bn/a
Fine point paintbrushesWinsor & Newton10269097n/a
Fluorescence or confocal microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
Heated plateFisher ScientificHP88850200n/a
Humidified chamber (if used at higher temperatures, it will need to be sealed inside a plastic Tupperware container)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Lint-free laboratory KimwipesKimberly-Clark34120refered to as lint-free laboratory tissue paper
MicrocentrifugeEppendorf5401000013n/a
Mouse cagesInnoViveM-BTM, MVX1n/a
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4375786n/a
Pipette p1000, p200, and p20 disposable tipsFisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Plastic histology embedding moldThermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238refered to as highly sensitive fluorometric method
Razor blades or scalpelsFisher Scientific12-640n/a
RNA tapestation or BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System or 2100 Bioanalyzer Instrumentn/a
RNase-free glass or plastic graduated cylinders and beakersFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
StereomicroscopeLeica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus microscope slidesThermo Fisher Scientific12-550-15referred to as positively charged microscope slides
ParafilmBemis CompanyPM999refered to as thermoplastic laboratory film
Water bathThermo Fisher ScientificTSCIR19n/a

Références

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