JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол сочетает гибридизацию in situ с иммунофлюоресценцией для идентификации генов обонятельных и вомероназальных рецепторов, экспрессируемых в обонятельных сенсорных нейронах после активации химическими стимулами у мыши.

Аннотация

Животные полагаются на химическую коммуникацию для передачи и восприятия соответствующей информации об окружающей среде, начиная от оценки качества пищи и заканчивая обнаружением доступных партнеров для спаривания или угроз. У мышей эта задача выполняется в первую очередь обонятельной системой и лежащими в ее основе подсистемами, включая основную и вспомогательную обонятельные системы. Оба имеют периферические органы, населенные сенсорными нейронами, экспрессирующими рецепторы, сопряженные с G-белком, способные связывать химические сигналы, которые достигают носовой полости. Несмотря на то, что молекулярные характеристики этих рецепторов хорошо изучены, мало что известно об их родственных специфических лигандах. Описанный здесь метод сочетает обнаружение in situ гибридизации обонятельных или вомероназальных рецепторов с иммунодетекцией фосфорилированного рибосомального белка S6 (pS6) – маркера активации нейронов. Этот протокол был разработан для идентификации нейронов, активированных после одного события воздействия очищенных или сложных химических стимулов, обнаруженных обонятельными органами. Важно отметить, что этот метод позволяет исследовать нейроны, запускаемые в биологически значимых контекстах. В идеале этот метод должен быть использован для исследования молекулярной биологии обонятельной системы и изучения обонятельного поведения.

Введение

Хемосигнализация является наиболее распространенной формой коммуникации у животных. У млекопитающих обнаружение химических сигналов опосредовано в основном через обоняние и имеет первостепенное значение для поиска пищи, поиска возможных партнеров для спаривания и избеганияпотенциальных хищников. Обонятельная система мыши далее делится на различные подсистемы, каждая из которых обладает своими анатомическими, физиологическими и молекулярными свойствами4. Среди них основная обонятельная система (МОС) и добавочная обонятельная система (АОС) являются наиболее широко изученными и лучше охарактеризованными.

MOS в основном отвечает за обнаружение летучих химических молекул, которые достигают носовой полости. Это достигается с помощью обонятельных сенсорных нейронов (OSN), которые населяют сенсорный интерфейс системы - главный обонятельный эпителий (MOE). Каждый OSN экспрессирует один из тысяч обонятельных рецепторов (ОШ) моногенным и моноаллельным образом5. Кроме того, ОШ имеют тенденцию к широкой настройке6, и один одорант может связываться с более чем одним ОШ, генерируя комбинаторный код для запахов7.

В свою очередь, AOS в основном отвечает за обнаружение феромонов и кайромонов. Эти лиганды активируют вомероназальные сенсорные нейроны (ВОПН) в вомероназальном органе (ВНО). VSN в апикальной зоне VNO экспрессируют рецепторы из семейства вомероназальных рецепторов 1 (V1R)8, в то время как нейроны в базальной зоне экспрессируют семейство вомероназальных рецепторов 2 (V2R)9. Важно отметить, что было показано, что некоторые VSN совместно экспрессируют более одного вомероназального рецептора 10,11,12.

Несмотря на всю доступную информацию о молекулярных характеристиках ОР и ВР, знания об их родственных лигандах все еще очень ограничены. Идентификация специфических обонятельных нейронов, ответственных за обнаружение молекулы или сложного стимула, является важной задачей для тех, кто изучает обоняние, обонятельное поведение и физиологические реакции. Было предпринято несколько попыток десиротизации обонятельных рецепторов, включая визуализацию кальция7, секвенирование РНК одиночных клеток13,14, гетерологичную экспрессию рецепторов15 и стратегии, основанные на непосредственных ранних генах (ИЭГ)16. В последнее время были использованы некоторые методы для оценки модулирующих эффектов пахучих веществ в сенсорных нейронах с использованием визуализации кальция in vivo 17,18 и стратегий секвенирования РНК одиночных клеток, меченных флуоресцентными белками19. Большинство из этих методов требуют искусственной установки или выполняются на диссоциированных нейронах, что делает невозможным одновременную оценку поведения, вызванного используемыми запахами.

Описанный здесь протокол позволяет идентифицировать сенсорные нейроны, активированные после одного события воздействия запаха, путем комбинации рибозондов, обнаруживающих специфические ОШ или ВР, с иммунодетекцией фосфорилированного рибосомального белка S6 (pS6), являющегося прокси для активации нейронов. Этот метод является надежным способом исследования идентичности сенсорных нейронов, активируемых различными хемосигналами в биологически значимом контексте.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Процедуры с животными проводились в соответствии с Протоколом для животных #1883-1, утвержденным Университетом Кампинаса (Комитет по институциональному уходу за животными и их использованию Института биологии - Комитет по этике использования животных в исследованиях), который следует руководящим принципам, установленным федеральным Национальным советом по контролю за экспериментами на животных (CONCEA).

1. Подготовка материала

  1. Приготовьте 1 л 3% H2O2 (v/v) в 1x PBS. Развести 100 мл 10× PBS и 100 мл 30% H2O2 в 500 мл сверхчистой воды. Дополните объем сверхчистой водой. Готовьте этот раствор непосредственно перед применением.
  2. Приготовьте увлажненную камеру, содержащую кусочки безворсовых лабораторных салфеток, смоченных 5× раствором SSC.
  3. Готовят гибридизационные промывочные растворы: 5× SSC (при 55 °C), 2× SSC (55 °C), 0,2× SSC (55 °C) и 0,1× SSC (55 °C и комнатной температуры). Растворите соответствующие объемы 20× исходного раствора ССК в сверхчистой воде, не содержащей РНКазы. Готовьте разведенные растворы в свежем виде перед началом каждого эксперимента.
  4. Готовят иммуногистохимический блокирующий раствор: 1× PBS/1% BSA/0,1% Triton X-100. Для 100 мл разведите 10 мл 10× PBS, 10 мл 10% BSA и 3,33 мл 3% Triton X-100 в 70 мл сверхчистой воды. Дополните объем сверхчистой водой. Готовьте разведенные растворы в свежем виде перед началом каждого эксперимента.
  5. Приготовьте раствор PTw: 1× PBS/0,1% Tween-20. Для 100 мл разведите 1 мл 10% Tween-20 и 10 мл 10× PBS в 70 мл сверхчистой воды. Дополните объем сверхчистой водой. Готовьте этот раствор в свежем виде перед началом каждого эксперимента.
  6. Приготовьте 0,1 М раствор триэтаноламина, не содержащий РНКазы. Для 250 мл разведите 3,33 мл реагентного триэтаноламинана в 200 мл сверхчистой воды, не содержащей РНКазы, при перемешивании (при приготовлении этого раствора используйте стеклянную посуду без РНКазы и магнитную мешалку). Отрегулируйте pH до 8,0 с помощью HCl. Дополните объем сверхчистой водой, не содержащей РНКазы, и храните в защищенном от света месте до использования. Готовьте этот раствор в свежем виде перед началом каждого эксперимента.
  7. Приготовьте 0,1% H2O2 (v/v) без РНКазы в 1× PBS. Для 1 л разбавьте 100 мл 10× PBS и 3,3 мл 30% H2O2 в 500 мл сверхчистой воды, не содержащей РНКазы. Дополните объем сверхчистой водой, не содержащей РНКазы. Готовьте этот раствор непосредственно перед применением.
  8. Готовят безРНКазные растворы: 0,2 М HCl; 1 М Tris-HCl pH 8,0; 10 мг/мл тРНК дрожжей; 10% паспорта безопасности; 10× ПБС; 100× решение Денхардта; 20× ССК; 50% сульфат декстрана; 6 М HCl
  9. Приготовьте 4% параформальдегидный фиксирующий раствор без РНКазы. Для 100 мл растворите 4 г параформальдегида в 80 мл 1× PBS. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 10 М NaOH. Дополните том 1× PBS. Этот раствор необходимо готовить свежим перед началом каждого эксперимента.
    Осторожность: Параформальдегид является опасным веществом, которое потенциально может причинить вред при вдыхании. Готовьте раствор под вытяжным шкафом и надевайте защитные перчатки, маску и защитные очки.
  10. Приготовьте раствор для диссекции без РНКазы: 30% сахароза/0,45 М ЭДТА pH 8,0/1× PBS. Для 100 мл растворите 30 г сахарозы в 60 мл 0,5 М ЭДТА, не содержащей РНКазы, pH 8,0. Добавьте 10 мл 10× PBS. Дополните объем 0,5 М ЭДТА pH 8,0, не содержащим РНКазы.
  11. Подготовьте стеклянные или пластиковые градуированные цилиндры и стаканы без РНКазы.
  12. Приготовьте растворы для предварительной гибридизации и гибридизации, не содержащие РНКазы: 50% деионизированный формамид (v/v)/600 мМ NaCl/200 мкг/мл тРНК дрожжей/0,25% SDS (w/v)/10 мМ Tris-HCl pH 8,0/1× раствор Денхардта/1 мМ ЭДТА pH 8,0/10% сульфат декстрана (w/v). На 10 мл в градуированном цилиндре добавьте 5 мл деионизированного формамида, 1,2 мл 5 М NaCl, 200 мкл 10 мг/мл тРНК дрожжей, 250 мкл 10% SDS, 100 мкл 1 М Tris-HCl pH 8,0, 200 мкл 50× раствора Денхардта, 20 мкл 500 мл ЭДТА pH 8,0 и 2 мл 50% сульфата декстрана (M.W. 500 000). Дополните объем сверхчистой водой, не содержащей РНКазы. Готовьте этот раствор в свежем виде перед началом каждого эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сульфат декстрана очень вязкий. Целесообразно готовить дополнительные 20% от общего объема растворов для гибридизации/предварительной гибридизации с учетом ошибок пипетирования. При желании тРНК дрожжей может быть исключена из раствора для предварительной гибридизации.
  13. Подготовьте покровные крышки из термопластичной лабораторной пленки. Отрежьте прямоугольные кусочки термопластичной лабораторной пленки на 1-2 мм короче длины и ширины предметного стекла микроскопа.
  14. Приготовьте TN-буфер: 100 мМ Tris-HCl/150 мМ NaCl. Для 100 мл разведите 10 мл 1 М Tris-HCl pH 7,5 и 3 мл 5 М NaCl в 70 мл сверхчистой воды. Дополните объем сверхчистой водой. Готовьте этот раствор в свежем виде перед началом каждого эксперимента.
  15. Приготовьте блокирующий буфер TNB: 0,5% блокирующий реагент А (w/v) в TN Buffer. Для 200 мл растворите 1 г блокирующего реагента А в 200 мл TN Buffer (см. Таблицу материалов для коммерческого источника блокирующего реагента А).
  16. Приготовьте тротиловый буфер: 0,05% Tween-20 в TN Buffer. На 1 л разведите 5 мл 10% Tween-20 в 950 мл TN-буфера. Медленно завершите объем с помощью TN-буфера, чтобы избежать пенообразования. Готовьте этот раствор в свежем виде перед началом каждого эксперимента.
  17. Приготовьте рабочий раствор Tyramide-Alexa 488: 1× амплификационный буфер A/0,0015% H2O2/1:100 тирамид-Alexa 488. Для 100 мкл разведите 1 мкл 0,15% H2O2 и 1 мкл тирамид-Alexa 488 в 98 мкл амплификационного буфера А (см. Таблицу материалов для коммерческих источников тирамида Alexa 488 и амплификационного буфера А). Готовьте этот раствор непосредственно перед применением.
  18. Приготовьте рабочий раствор Tyramide-Alexa 555: 1× амплификационный буфер A/0,0015% H2O2/1:100 тирамид-Alexa 555. Для 100 мкл разведите 1 мкл 0,15% H2O2 и 1 мкл тирамид-Alexa 555 в 98 мкл амплификационного буфера А (см. Таблицу материалов для коммерческих источников тирамида Alexa 555 и амплификационного буфера А). Готовьте этот раствор непосредственно перед применением.
  19. Приготовьте рабочий раствор тирамида-биотина: 1× амплификационный буфер B/0,0015% H2O2/1:50 тирамид-биотин. Для 100 мкл разведите 1 мкл 0,15%Н2О2 и 2 мкл тирамида-биотина в 97 мкл амплификационного буфера В (см. Таблицу материалов для коммерческих источников тирамид-биотина и амплификационного буфера В). Готовьте этот раствор непосредственно перед применением.
  20. Выпекать стеклянную посуду при температуре 200 °C не менее 4 часов. Одноразовую пластиковую посуду (в том числе решетки, банки Coplin и шприцы) обработать 3%H2O2 в течение 15-30 мин с последующей тщательной промывкой водой, не содержащей РНКазы. Обработайте металлические инструменты из нержавеющей стали, такие как инструменты для препарирования, щипцы и держатели для образцов из криостата, 3%H2O2 в течение 15 минут, после чего тщательно промойте водой, не содержащей РНКазы. Очистите поверхности столов, нагреваемые пластины и сухие блоки с помощью чистящего раствора RNase.

2. Синтез рибозонда

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура синтеза меченных дигоксигенином зондов кРНК размером 1 kb для гибридизации in situ посредством транскрипции in vitro основана на ранее опубликованных протоколах 20,21,22,23.

  1. Используйте соответствующие пары олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагмента ДНК размером 1 т..н. из интересующего гена (например, гена обонятельного рецептора). Выберите пары праймеров, которые амплифицируют область, присутствующую в зрелой мРНК, которую необходимо обнаружить (например, кодирующую последовательность гена). Выбор праймеров для различных обонятельных рецепторов представлен в Таблице материалов. Для получения подробной информации о зондах для обнаружения других вомероназальных обонятельных рецепторов, пожалуйста, ознакомьтесь с предыдущими публикациями16,21.
  2. Запустите продукты ПЦР на 0,8% агарозном геле и удалите нужную полосу размером 1 kb.
  3. Очистите фрагмент ДНК с помощью подходящего набора для очистки гелем на основе мини-колонки в соответствии с протоколом производителя.
  4. Количественно оцените очищенный фрагмент ДНК и клонируйте его в подходящий вектор клонирования ПЦР в соответствии с протоколом производителя. Целесообразно использовать клонирующие векторы, содержащие промоторы РНК-полимеразы Т7 и SP6, фланкирующие клонированную ампликон.
  5. Преобразуйте рекомбинантную плазмиду в компетентные бактерии, не поддающиеся рекомбинации, путем химического преобразования или электропорации в соответствии с протоколом производителя.
  6. Семена изолируют колонии трансформирующих бактерий в богатую среду и выделяют плазмиду с помощью мини-препарата ДНК в соответствии с протоколом производителя.
  7. Проведите рестрикционный анализ пищеварения с подходящими ферментами рестрикции и/или секвенирование по Сэнгеру, чтобы проверить идентичность и ориентацию вставленного фрагмента ДНК в соответствии с протоколом производителя.
  8. Выполните рестрикционное расщепление для линеаризации 10 мкг плазмиды с использованием соответствующего фермента рестрикции. Чтобы получить антисмысловой рибозонд после транскрипции in vitro , используйте фермент рестрикции, который расщепляет плазмидную ДНК на конце вставки, противоположной промотору РНК-полимеразы, расположенному ниже по потоку к кодирующей последовательности гена. Для получения чувствительных рибозондов после транскрипции in vitro используйте фермент рестрикции, который расщепляет плазмидную ДНК на конце вставки, противоположной промотору РНК-полимеразы, расположенному выше кодирующей последовательности гена.
  9. Запустите аликвоту продукта реакции линеаризации плазмид на 0,8% агарозном геле для подтверждения полноты расщепления. После подтверждения полной линеаризации очистите оставшуюся часть реакции с помощью набора для очистки ПЦР на основе колонки в соответствии с протоколом производителя.
  10. Синтезируйте меченные дигоксигенином зонды кРНК путем транскрипции in vitro с использованием 1-2 мкг линеаризованной плазмиды в качестве матрицы, соответствующего фермента (например, РНК-полимеразы T7 или SP6) и подходящего набора для мечения дигоксигенина (DIG).
  11. Удалите матрицу ДНК из реакции, расщеплив ее ДНКазой I при 37 °C в течение 30 минут.
  12. Очистите зонды кРНК с помощью мини-набора для очистки РНК на основе колонки или набора для очистки на основе гелевой фильтрации. Разбавьте полученный зонд в 50 мкл воды, не содержащей РНКазы.
  13. Количественно оцените полученный рибозонд, предпочтительно с использованием флуориметрических методов. Обычно ожидаемый выход составляет более 100 нг/мкл.
  14. Запустите рибозонд на автоматизированной системе электрофореза или на 0,8% агарозном геле, не содержащем РНКазы, чтобы проверить качество зонда и его деградацию.
  15. Храните синтезированный зонд при температуре -80 °C до тех пор, пока он не понадобится.

3. Воздействие на мышей обонятельных раздражителей

  1. Индивидуально размещайте каждое животное в чистой клетке не менее чем за 24 часа до контакта. Снимите пищевую решетку не менее чем за 2 часа до воздействия. Все животные, использованные в этом исследовании, были самцами мышей C57BL/6 в возрасте 8-12 недель (средний вес: 20 г).
  2. Подготовьте соответствующий обонятельный стимул. Различные стимулы могут быть использованы для активации обонятельных нейронов в MOE (главный обонятельный эпителий) или VNO (вомероназальный орган). Полный список обонятельных стимулов см. в других публикациях3, 16, 22, 23, 24. Жидкие раздражители, такие как химические растворы, моча или раствор рекомбинантного белка, могут быть нанесены на медицинскую марлю или ватный тампон.
  3. Введите обонятельный стимул в клетку и оставьте животное в покое на 1 ч.
  4. Усыпьте мышь и быстро препарируйте MOE или VNO с помощью инструментов для препарирования, не содержащих РНКазы.

4. Расслоение и замораживание тканей

  1. Препарируйте MOE или VNO под стереомикроскопом с использованием диссекционного раствора.
    1. Для ВНО удалите толстые септальные кости, оставив более мягкие хрящевые оболочки, окружающие орган.
  2. Подготовьте образец к криорезу.
    1. Промокните образец насухо на листе промокательной бумаги и поместите его внутрь гистологической пластиковой формы, содержащей закладную среду.
    2. Для ВНО расположите каждый орган вертикально и притяните его ко дну пластиковой формы с помощью шприца объемом 1 мл (рисунок 1А).
    3. Для MOE поместите его на дно пластиковой формы пластиной в форме крибри вниз.
    4. Удалите излишки пузырьков вокруг образца, так как они могут помешать разделению.
    5. Заморозьте экземпляры на сухом льду.
    6. Храните блок образцов при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные образцы могут храниться в течение нескольких месяцев перед разделением.
  3. Провести криосекцию.
    1. Включите криостат и установите температуру -23 °C не менее чем за 4 часа до использования.
    2. Извлеките замороженный блок из гистологической формы и обрежьте его лезвием бритвы.
    3. Оставьте 5 мм вокруг образца, так как это облегчает работу со срезом (Рисунок 1B).
    4. Используйте закладную среду для крепления блока к держателю образца криостата.
    5. Соберите срезы размером 16 мкм на положительно заряженные предметные стекла микроскопа.
    6. Хранить предметные стекла при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла можно хранить при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев перед гибридизацией in situ .

5. Пошаговый протокол гибридизации in situ

  1. Просушите горки в течение 10 минут с помощью фена. Используйте теплую струю для размораживания предметных стекол, затем переключитесь на струю комнатной температуры, пока закладная среда не станет непрозрачной.
  2. Добавьте 500 мкл на предметное стекло 4% фиксирующего раствора параформальдегида, не содержащего РНКазы, и инкубируйте при 23-26 °C в течение 15 мин для фиксации гистологических срезов.
  3. Дважды промойте предметные стекла в 1× PBS без РНКазы в течение 5 минут каждая.
  4. Добавьте 500 мкл на предметное стекло 0,2 М HCl, не содержащего РНКазы, и инкубируйте при 23-26 °C в течение 10 мин.
  5. Дважды промойте предметные стекла в 1× PBS без РНКазы в течение 5 минут каждая.
  6. Добавьте 500 μл на предметное стекло 0,1% H2O2/1× PBS без РНКазы и инкубируйте в течение 30 минут при 23-26 °C. Выполняйте этот шаг в темное время суток, чтобы предотвратить вызванное светом разложение перекиси водорода.
  7. Дважды промойте предметные стекла в 1× PBS без РНКазы в течение 5 минут каждая.
  8. Выполните ацетилирование, перенеся предметные стекла в банку, содержащую 250 мл триэтаноламина, не содержащего РНКазы, 0,1 М pH 8,0, и магнитную мешалку, в вытяжном шкафу. Добавьте 625 мкл уксусного ангидрида при постоянном перемешивании. Уменьшите скорость перемешивания, добавьте еще 625 мкл капли за каплей на предметные стекла, затем выключите помешивание и выдерживайте 10 минут.
  9. Дважды промойте предметные стекла в 1× PBS без РНКазы в течение 5 минут каждая.
  10. Промойте предметные стекла один раз в 1× PBS при температуре 60 °C в течение 5 минут.
  11. Проведите предварительную гибридизацию, удаляя по одному предметные стекла из 1× PBS и промокнув каждый из них насухо с помощью безворсовой лабораторной папиросной бумаги. Нанесите 400 мкл раствора предварительной гибридизации на каждое предметное стекло и поместите его в увлажненную камеру, предварительно нагретую до 60 °C на водяной бане или в нагретой духовке. Выдерживать при 60 °C в течение 1 ч.
  12. Достаточно нагреть гибридизационный раствор до 60 °С, аликвотировать 200 мкл на предметное стекло в микрофуге пробирки, и нагреть их до 85 °С в течение 10 мин.
  13. Добавьте соответствующий зонд (зонды) кРНК в пробирки с гибридизационным раствором (1 мкг/мл каждый зонд) и денатурируйте при 85 °C в течение 5 минут.
  14. Для гибридизации возьмите по одному предметному стеклу из увлажненной камеры, промокните его насухо и поместите на нагреваемую при температуре 60 °C пластину. Добавьте 200 μл раствора для гибридизации, содержащего рибопробы, и накройте предметное стекло стеклянным покровным стеклом. Выдерживать в течение 12-16 ч в увлажненной камере при температуре 60 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте предметным стеклам остыть после предварительной гибридизации. Температура гибридизации должна быть определена опытным путем для каждого зонда. В качестве отправной точки рекомендуется использовать шестьдесят градусов Цельсия, так как обычно это хорошо работает для зондов размером 1 кб.
  15. Нагрейте растворы для стирки SSC до 55 °C в отдельных банках и поместите их на водяную баню при соответствующей температуре.
  16. После завершения гибридизации снимите покровное стекло с каждого предметного стекла с помощью ванны, содержащей 5× раствор SSC при температуре 55 °C. Держите каждое предметное стекло горизонтально внутри теплого раствора SSC. Когда покровное стекло отсоединится, наклоните заслонку и дайте ей опуститься вниз.
  17. Стирать с 2× SSC при 55 °C в течение 30 минут в выдвижной банке.
  18. Стирать с 0,2× SSC при 55 °C в течение 20 минут в выдвижной банке.
  19. Стирать с 0,1× SSC при 55 °C в течение 20 минут в банке-слайдере.
  20. Перелейте до 0,1× SSC при 23-26 °C и инкубируйте в течение 3 минут в банке-слайдере.
  21. Постирать в PTw в течение 10 минут в банке-слайдере.
  22. Дважды постирайте в TN Buffer, по 5 минут каждая, в банке-слайдере.
  23. Пипетируйте 600 мкл блокирующего буфера TNB на каждое предметное стекло и инкубируйте в течение 3 ч при 23-26 °C.
  24. Нанесите 500 мкл раствора первичного антитела (пероксидаза-конъюгированное антитело против DIG, разведенное в соотношении 1:400 в растворе TNB) на каждое предметное стекло. Осторожно наложите кусок термопластичной лабораторной пленки на каждое предметное стекло и инкубируйте в течение 12-16 часов при температуре 4 °C.
  25. Промыть предметные стекла 6 раз с помощью буфера TNT по 5 минут каждая, при слабом помешивании в банке-слайдере.
  26. Пипетируйте 100 μл рабочего раствора тирамида-биотина на каждое предметное стекло. Накрыть термопластичной лабораторной пленкой и выдерживать 12 мин при температуре 23-26 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот этап инкубации в шахматном порядке, с 2 или 3 слайдами на партию, чтобы обеспечить хороший контроль над временем инкубации. Продолжительность инкубации тирамида может потребоваться оптимизировать в зависимости от чувствительности и концентрации зонда кРНК.
  27. Промыть предметные стекла 6 раз с помощью буфера TNT по 5 минут каждая, при слабом помешивании в банке-слайдере.
  28. Нанесите 200 мкл раствора, содержащего пероксидазу-конъюгированный стрептавидин (SA-HRP, разведенный в 1:100 в буфере TNB) на каждое предметное стекло и накройте термопластичной лабораторной пленкой. Выдерживать при температуре 23-26 °C в течение 1 ч.
  29. Промыть предметные стекла 6 раз с помощью буфера TNT по 5 минут каждая, при слабом помешивании в банке-слайдере.
  30. Нанесите 100 мкл рабочего раствора тирамид-Alexa 488 на каждое предметное стекло, накройте термопластичной лабораторной пленкой и выдержите при температуре 23-26 °C в течение 12 минут в темноте.
  31. Промыть предметные стекла 6 раз с помощью буфера TNT по 5 минут каждая, при слабом помешивании в банке-слайдере.
  32. Инкубируйте в 3% H2O2/1× PBS в банке-слайде в течение 1 ч, чтобы инактивировать пероксидазы из предыдущих этапов.
  33. Промыть предметные стекла 6 раз с помощью буфера TNT по 5 минут каждая, при слабом помешивании в банке-слайдере.

6. Иммуноокрашивание pS6

  1. Нанесите 500 мкл 4% раствора параформальдегида/1× PBS на каждое предметное стекло и инкубируйте при температуре 23-26 °C в течение 15 мин для фиксации срезов.
  2. Нанесите 500 мкл 1× PBS/0,1% Triton X-100 на каждое предметное стекло и инкубируйте в течение 5 минут для проникновения срезов.
  3. Дважды вымойте с 1× PBS в банке-слайдере.
  4. Пипетку по 2-3 капли на секцию коммерчески доступного тирамидного сигнала блокирующего раствора В (Таблица материалов) и инкубируют при 23-26 °С в течение 1 ч.
  5. Пипетировать 400 мкл иммуногистохимического блокирующего раствора на каждое предметное стекло и инкубировать при 23-26 °С в течение 30 мин для блокировки срезов.
  6. Пипет 200 мкл раствора первичного антитела против pS6 кролика (разведенного в соотношении 1:200 в иммуногистохимическом блокирующем растворе; конечная концентрация: 1 г/мл) на каждое предметное стекло, накрывает термопластичной лабораторной пленкой и инкубирует при 4 °С в течение 12-16 ч.
  7. Промыть 3 раза с 1× PBS/0,1% Triton X-100 в течение 5 минут в банке.
  8. Пипетку по 2-3 капли на предметное стекло коммерчески доступного раствора пероксидазы-конъюгированного вторичного антитела против кролика (Таблица материалов) и инкубировать при 23-26 °С в течение 1,5 ч.
  9. Промыть 3 раза с 1× PBS/0,1% Triton X-100 в течение 5 минут в банке.
  10. Промокните предметные стекла насухо и нанесите на каждое предметное стекло от 100 до 200 μл рабочего раствора тирамид-Alexa 555, накройте куском термопластичной лабораторной пленки и выдержите в течение 7 минут в темноте.
  11. Вымойте дважды по 1× PBS по 5 минут в банке-слайдере.
  12. Нанесите 500 мкл разбавленного ядерного красителя (в 1× PBS) на каждое предметное стекло и инкубируйте при 23-26 °C в течение 30 минут.
  13. Дважды вымыть при температуре 1× PBS при температуре 23-26 °C в течение 5 минут в банке-слайдере.
  14. Установите направляющие с защитой от выцветания монтажной среды и дайте монтажной среде застыть в течение 24 часов в темноте.
  15. Храните предметные стекла при соответствующей температуре до получения изображения, чтобы избежать выцветания флуоресценции.

7. Микроскопическая визуализация

  1. Слайды изображения производятся с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа, оснащенного соответствующими фильтрами для используемых флуорофоров.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Текущий протокол направлен на получение микроскопических изображений, в которых ген экспериментатора, представляющий интерес, и маркер нейронной активности pS6 флуоресцентно помечены. Описанный метод включает в себя усиление тирамидного сигнала, которое дает четкую...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Описанный здесь протокол надежно идентифицирует сенсорные нейроны, активируемые химическими сигналами в обонятельной системе посредством комбинации in situ обнаружения рецепторов OR или VR с иммунодетекцией pS6, косвенного маркера нейронной активности. Эксперимент...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет никаких конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим GAG Pereira и JA Yunes за ресурсы, APF Ferreira и WO Bragança за административную и техническую помощь, а также сотрудников Life Sciences Core Facility (LaCTAD-UNICAMP) за помощь в проведении конфокальной микроскопии. Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Сан-Паулу (FAPESP; номера грантов 2009/00473-0 и 2015/50371-0 для F.P.), PRP/UNICAMP (номера грантов 2969/16, 725/15, 348/14 и 315/12 для F.P.), стипендиями FAPESP для V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1) и стипендией Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) для T.S.N.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10x phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922refered to as Amplification Buffer A in working solutions for tyramide-Alexa 488 or tyramide-Alexa 555 signal amplification
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% Bovine Serum Albumin (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
30% hydrogen peroxyde (H2O2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
Acetic anhydrideMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgaroseMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Amplification diluent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EArefered to as Amplification Buffer B in working solution for tyramide-biotin signal amplification
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibodyThermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922refered to as blocking solution B in the tyramide signal development step
Blocking reagent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EArefered to as blocking reagent A in the formulation for TNB buffer
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt's solution (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Deoinized formamideMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Dextran sulfate solution (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 nuclear stainThermo Fisher ScientificH1399n/a
Hydrochloric acid (HCl)Merck (Sigma-Aldrich)320331n/a
Olfactory stimulin/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
ParaformaldehydeMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments)Merck (Roche)11207733910; RRID:AB_514500refered to as peroxidase-conjugated anti-DIG antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold antifade mountantThermo Fisher ScientificP36934refered to as anti-fading mounting medium
RNase-free ultrapure waterThermo Fisher Scientific10977015n/a
Sodium chloride (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Sodium hydroxide (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
SucroseMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TriethanolamineMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Yeast tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape)Agilent5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579refered to as automated electrophoresis system
Mouse: C57BL/6J inbred strainJackson LaboratoriesStock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Micro ColumnsCytiva Biosciences28903408refered to as gel filtration-based purification kit
QIAquick gel extraction kitQiagen28506refered to as mini column-based gel-purification kit
RNeasy MinElute cleanup kitQiagen74204refered to as mini column-based RNA purification kit
TSA Biotin kitAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotides
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vectorPromegaA1360reccommended PCR cloning vector
Other materials
1mL syringesFisher Scientific14-829-10Fn/a
Conical tubes (15 mL and 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Coplin jarsFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Dissecting tools and forcepsRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
Dry bathn/an/an/a
Electrophoresis equipmentFisher Scientific09-528-110Bn/a
Fine point paintbrushesWinsor & Newton10269097n/a
Fluorescence or confocal microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
Heated plateFisher ScientificHP88850200n/a
Humidified chamber (if used at higher temperatures, it will need to be sealed inside a plastic Tupperware container)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Lint-free laboratory KimwipesKimberly-Clark34120refered to as lint-free laboratory tissue paper
MicrocentrifugeEppendorf5401000013n/a
Mouse cagesInnoViveM-BTM, MVX1n/a
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4375786n/a
Pipette p1000, p200, and p20 disposable tipsFisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Plastic histology embedding moldThermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238refered to as highly sensitive fluorometric method
Razor blades or scalpelsFisher Scientific12-640n/a
RNA tapestation or BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System or 2100 Bioanalyzer Instrumentn/a
RNase-free glass or plastic graduated cylinders and beakersFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
StereomicroscopeLeica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus microscope slidesThermo Fisher Scientific12-550-15referred to as positively charged microscope slides
ParafilmBemis CompanyPM999refered to as thermoplastic laboratory film
Water bathThermo Fisher ScientificTSCIR19n/a

Ссылки

  1. Stowers, L., Holy, T. E., Meister, M., Dulac, C., Koentges, G. Loss of sex discrimination and male-male aggression in mice deficient for TRP2. Science. 295 (5559), 1493-1500 (2002).
  2. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141 (4), 692-703 (2010).
  4. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annual review of physiology. 71, 115-140 (2009).
  5. Chess, A., et al. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell. 78, 823-834 (1994).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature Reviews Neuroscience. 5, 263-278 (2004).
  7. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  8. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83 (2), 195-206 (1995).
  9. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90 (4), 763-773 (1997).
  10. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-Expression of Putative Pheromone Receptors in the Sensory Neurons of the Vomeronasal Organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  11. Silvotti, L., Moiani, A., Gatti, R., Tirindelli, R. Combinatorial co-expression of pheromone receptors, V2Rs. Journal of Neurochemistry. 103 (5), 1753-1763 (2007).
  12. Ishii, T., Mombaerts, P. Expression of nonclassical class I major histocompatibility genes defines a tripartite organization of the mouse vomeronasal system. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2332-2341 (2008).
  13. Saraiva, L. R., et al. Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: From whole mucosa to single-cell RNA-seq. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Hanchate, N. K., et al. Single-cell transcriptomics reveals receptor transformations during olfactory neurogenesis. Science. 350, 1251-1255 (2015).
  15. Matsunami, H. Functional expression of mammalian odorant receptors. Chemical Senses. 30, Suppl 1 95-96 (2005).
  16. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  17. Xu, L., Li, W., Voleti, V., Zou, D. J., Hillman, E. M. C., Firestein, S. Widespread receptor-driven modulation in peripheral olfactory coding. Science. 368 (6487), (2020).
  18. Pfister, P., et al. Article Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding. Current Biology. , 1-14 (2020).
  19. de March, C. A., Titlow, W. B., Sengoku, T., Breheny, P., Matsunami, H., McClintock, T. S. Modulation of the combinatorial code of odorant receptor response patterns in odorant mixtures. Molecular and Cellular Neuroscience. 104, 103469(2020).
  20. Nakahara, T. S., Carvalho, V. M. A., Souza, M. A. A., Trintinalia, G. Z., Papes, F. Detection of Activated Mouse Neurons with Temporal Resolution via Dual c-Fos Staining. STAR Protocols. 1 (3), 100153(2020).
  21. Nakahara, T. S., et al. Detection of pup odors by non-canonical adult vomeronasal neurons expressing an odorant receptor gene is influenced by sex and parenting status. BMC biology. 14 (1), 12(2016).
  22. Carvalho, V. M. A., et al. Lack of spatial segregation in the representation of pheromones and kairomones in the mouse medial amygdala. Frontiers in Neuroscience. 9, 1-19 (2015).
  23. Carvalho, V. M. A., et al. Representation of Olfactory Information in Organized Active Neural Ensembles in the Hypothalamus. Cell Reports. 32 (8), 108061(2020).
  24. Papes, F., Nakahara, T. S., Camargo, A. P. Behavioral assays in the study of olfaction: a practical guide. Methods in Molecular Biology, v1820: Olfactory receptors. , 289-388 (2018).
  25. Jiang, Y., Gong, N. N., Hu, X. S., Ni, M. J., Pasi, R., Matsunami, H. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors responding to odors in vivo. Nature Neuroscience. 18, 1446-1454 (2015).
  26. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Neuroscience. 18 (10), (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in situG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены