Investigación de neuronas sensoriales olfativas activadas en ratones mediante inmunotinción combinada e hibridación in situ

Resumen

Este protocolo combina la hibridación in situ con la inmunofluorescencia para identificar genes de receptores olfativos y vomeronasales expresados en neuronas sensoriales olfativas después de la activación por estímulos químicos en el ratón.

Resumen

Los animales dependen de la comunicación química para transmitir y percibir información ambiental relevante, que va desde la evaluación de la calidad de los alimentos hasta la detección de parejas de apareamiento disponibles o amenazas. En ratones, esta tarea es ejecutada principalmente por el sistema olfativo y sus subsistemas subyacentes, incluidos los sistemas olfativos principal y accesorio. Ambos tienen órganos periféricos poblados por neuronas sensoriales que expresan receptores acoplados a la proteína G capaces de unirse a señales químicas que llegan a la cavidad nasal. A pesar de que las características moleculares de estos receptores se conocen bien, se sabe poco sobre sus ligandos específicos afines. El método descrito aquí combina la detección de hibridación in situ de receptores olfativos o vomeronasales con la inmunodetección de la proteína ribosómica fosforilada S6 (pS6), un marcador de activación neuronal. Este protocolo fue ideado para identificar las neuronas activadas después de un solo evento de exposición a estímulos químicos purificados o complejos detectados por los órganos olfativos. Es importante destacar que esta técnica permite la investigación de neuronas desencadenadas en contextos biológicamente relevantes. Idealmente, este método debería usarse para sondear la biología molecular del sistema olfativo y para estudiar los comportamientos olfativos.

Introducción

La quimioseñalización es la forma de comunicación más extendida en los animales. En los mamíferos, la detección de señales químicas está mediada principalmente por el olfato y es primordial para encontrar alimento, localizar posibles parejas de apareamiento y evitar posibles depredadores ^1,2,3. El sistema olfativo del ratón se divide a su vez en diferentes subsistemas, cada uno con sus propias propiedades anatómicas, fisiológicas y moleculares⁴. Entre estos, el sistema olfativo principal (MOS) y el sistema olfativo accesorio (AOS) son los más estudiados y mejor caracterizados.

El MOS es el principal responsable de la detección de moléculas químicas volátiles que llegan a la cavidad nasal. Esto se logra gracias a las neuronas sensoriales olfativas (OSN), que pueblan la interfaz sensorial del sistema, el epitelio olfativo principal (MOE). Cada OSN expresa uno de los miles de receptores olfativos (OR) de forma monogénica y monoalélica⁵. Además, los OR tienden a ser ampliamente afinados⁶, y un solo odorante puede unirse a más de un OR, generando un código combinatorio para los olores⁷.

A su vez, el AOS es el principal responsable de la detección de feromonas y kairomonas. Estos ligandos activan los neuros sensoriales vomeronasales (VSN) en el órgano vomeronasal (VNO). Las VSNs de la zona apical del VNO expresan receptores de la familia del receptor vomeronasal 1 (V1Rs)⁸, mientras que las neuronas de la zona basal expresan la familia del receptor vomeronasal 2 (V2Rs)⁹. Es importante destacar que se ha demostrado que algunas VSNs co-expresan más de un receptor vomeronasal 10,11,12.

A pesar de toda la información disponible sobre las características moleculares de los OR y los VR, el conocimiento sobre sus ligandos afines es todavía muy limitado. La identificación de neuronas olfativas específicas responsables de la detección de una molécula o estímulo complejo es una tarea importante para quienes investigan el olfato, los comportamientos impulsados por el olfato y las respuestas fisiológicas. Se han intentado varias estrategias para desorfanizar los receptores olfativos, incluyendo la obtención de imágenes de calcio⁷, la secuenciación de ARN unicelular^13,14, la expresión de receptores heterólogos¹⁵ y estrategias basadas en genes tempranos inmediatos (IEGs)¹⁶. Más recientemente, se han empleado algunas técnicas para evaluar los efectos moduladores de los odorantes en las neuronas sensoriales, utilizando imágenes de calcio in vivo ^17,18 y estrategias de secuenciación de ARN unicelular marcado con proteínas fluorescentes¹⁹. La mayoría de estas técnicas exigen una configuración artificial o se realizan en neuronas disociadas, lo que hace imposible evaluar simultáneamente los comportamientos desencadenados por los olores utilizados.

El protocolo aquí descrito permite la identificación de neuronas sensoriales activadas después de un solo evento de exposición al olor, mediante la combinación de ribosondas que detectan OR o VR específicas con la inmunodetección de la proteína ribosómica S6 fosforilada (pS6), un proxy de la activación neuronal. Este método es una forma fiable de investigar la identidad de las neuronas sensoriales activadas por diferentes quimioseñales en un contexto biológicamente relevante.

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Protocolo

Los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Protocolo Animal #1883-1, aprobado por la Universidad de Campinas (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Biología - Comité de Ética en el Uso de Animales en Investigación), que sigue las directrices establecidas por el Consejo Nacional de Control de Experimentación Animal (CONCEA) federal.

1. Preparación del material

1. Prepare 1 L de 3% H₂O₂ (v/v) en 1x PBS. Diluir 100 mL 10× PBS y 100 mL de 30% H₂O₂ en 500 mL de agua ultrapura. Completa el volumen con agua ultrapura. Prepare esta solución inmediatamente antes de usarla.
2. Prepare una cámara humidificada que contenga trozos de toallitas de laboratorio sin pelusa humedecidas con una solución de SSC al 5×.
3. Prepare soluciones de lavado de hibridación: 5× SSC (a 55 °C), 2× SSC (55 °C), 0,2× SSC (55 °C) y 0,1× SSC (55 °C y temperatura ambiente). Disuelva los volúmenes apropiados de solución madre de SSC al 20× en agua ultrapura sin RNasa. Prepare las soluciones diluidas frescas antes del inicio de cada experimento.
4. Prepare la solución de bloqueo inmunohistoquímico: 1× PBS/1% BSA/0,1% Triton X-100. Para 100 mL, diluya 10 mL de PBS al 10×, 10 mL de BSA al 10% y 3.33 mL de Triton X-100 al 3% en 70 mL de agua ultrapura. Completa el volumen con agua ultrapura. Prepare las soluciones diluidas frescas antes del inicio de cada experimento.
5. Preparación de la solución PTw: 1× PBS/0,1% Tween-20. Para 100 mL, diluir 1 mL de Tween-20 al 10% y 10 mL de PBS al 10× en 70 mL de agua ultrapura. Completa el volumen con agua ultrapura. Prepare esta solución de nuevo antes del inicio de cada experimento.
6. Prepare una solución de trietanolamina 0,1 M libre de RNasa. Para 250 mL, diluya 3,33 mL de trietanolamina de grado reactivo en 200 mL de agua ultrapura libre de RNasa bajo agitación (use cristalería sin RNasa y agitador magnético al preparar esta solución). Ajuste el pH a 8.0 con HCl. Complete el volumen con agua ultrapura sin RNasa y almacene protegida de la luz hasta su uso. Prepare esta solución de nuevo antes del inicio de cada experimento.
7. Prepare 0,1% H₂O₂ (v/v) libre de RNasa en 1× PBS. Para 1 L, diluir 100 mL de PBS al 10× y 3,3 mL de 30% H₂O₂ en 500 mL de agua ultrapura libre de RNasa. Completa el volumen con agua ultrapura sin RNasa. Prepare esta solución inmediatamente antes de usarla.
8. Preparar soluciones libres de RNasa de los siguientes elementos: 0,2 M de HCl; 1 m de Tris-HCl pH 8,0; 10 mg/mL de ARNt de levadura; 10% SDS; 10× PBS; 100× la solución de Denhardt; 20× SSC; 50% sulfato de dextrano; 6 M HCl
9. Prepare una solución fijadora de paraformaldehído al 4% libre de RNasa. Para 100 mL, disuelva 4 g de paraformaldehído en 80 mL de 1× PBS. Ajuste el pH a 7,4 con 10 M de NaOH. Completa el volumen con 1× PBS. Esta solución debe prepararse fresca antes del inicio de cada experimento.
   Cautela: El paraformaldehído es una sustancia peligrosa que puede causar daño si se inhala. Prepare la solución debajo de una campana extractora y use guantes protectores, mascarilla y gafas de seguridad.
10. Prepare una solución de disección sin RNasa: 30% de sacarosa/0,45 M EDTA pH 8,0/1× PBS. Para 100 mL, disuelva 30 g de sacarosa en 60 mL de EDTA 0,5 M libre de ARNasa pH 8,0. Agregue 10 mL de PBS al 10×. Completa el volumen con EDTA 0,5 M pH 8,0 libre de RNasa.
11. Prepare cilindros y vasos de precipitados graduados de vidrio o plástico libres de RNasa.
12. Prepare soluciones de prehibridación e hibridación libres de RNasa: 50% formamida desionizada (v/v)/600 mM NaCl/200 μg/mL ARNt de levadura/0,25% SDS (p/v)/10 mM Tris-HCl pH 8,0/1× Solución de Denhardt/1 mM EDTA pH 8,0/10% sulfato de dextrano (p/v). Para 10 mL en un cilindro graduado, agregue 5 mL de formamida desionizada, 1,2 mL de NaCl 5 M, 200 μL de ARNt de levadura 10 mg/mL, 250 μL de SDS al 10%, 100 μL de Tris-HCl a pH 8.0, 200 μL de solución de Denhardt al 50×, 20 μL de pH 8.0 de EDTA de 500 mM y 2 mL de sulfato de dextrano al 50% (M.W. 500,000). Completa el volumen con agua ultrapura sin RNasa. Prepare esta solución de nuevo antes del inicio de cada experimento.
    NOTA: El sulfato de dextrano es muy viscoso. Es aconsejable preparar un 20% adicional del volumen total de soluciones de hibridación/prehibridación para tener en cuenta los errores de pipeteo. El ARNt de levadura puede omitirse de la solución de prehibridación, si se desea.
13. Prepare cubreobjetos de película de laboratorio termoplástica. Corte piezas rectangulares de película de laboratorio termoplástica 1-2 mm más cortas que la longitud y el ancho de un portaobjetos de microscopio.
14. Tampón TN de preparación: 100 mM de Tris-HCl/150 mM de NaCl. Para 100 mL, diluir 10 mL de Tris-HCl de 1 M pH 7,5 y 3 mL de NaCl 5 M en 70 mL de agua ultrapura. Completa el volumen con agua ultrapura. Prepare esta solución de nuevo antes del inicio de cada experimento.
15. Preparación del tampón de bloqueo TNB: 0,5% de reactivo de bloqueo A (p/v) en tampón TN. Para 200 mL, disuelva 1 g de reactivo bloqueante A en 200 mL de tampón TN (consulte la Tabla de materiales para conocer la fuente comercial del reactivo bloqueante A).
16. Preparar tampón TNT: 0.05% Tween-20 en tampón TN. Para 1 L, diluir 5 mL de Tween-20 al 10% en 950 mL de tampón TN. Completa lentamente el volumen con tampón TN para evitar la formación de espuma. Prepare esta solución de nuevo antes del inicio de cada experimento.
17. Prepare la solución de trabajo Tyramide-Alexa 488: 1× tampón de amplificación A/0.0015% H₂O₂/1:100 tyramide-Alexa 488. Para 100 μL, diluya 1 μL de 0,15% H₂O₂ y 1 μL de tiramida-Alexa 488 en 98 μL de tampón de amplificación A (consulte la Tabla de materiales para fuentes comerciales de tiramida-Alexa 488 y tampón de amplificación A). Prepare esta solución inmediatamente antes de usarla.
18. Prepare la solución de trabajo Tyramide-Alexa 555: 1× tampón de amplificación A/0.0015% H₂O₂/1:100 tyramide-Alexa 555. Para 100 μL, diluya 1 μL de 0,15% H₂O₂ y 1 μL de tiramida-Alexa 555 en 98 μL de tampón de amplificación A (consulte la Tabla de materiales para fuentes comerciales de tiramida-Alexa 555 y tampón de amplificación A). Prepare esta solución inmediatamente antes de usarla.
19. Preparar la solución de trabajo de tiramida-biotina: 1× tampón de amplificación B/0,0015% H₂O₂/1:50 tiramida-biotina. Para 100 μL, diluir 1 μL de 0,15% H,_2O2 y 2 μL de tiramida-biotina en 97 μL de tampón de amplificación B (véase la Tabla de materiales para las fuentes comerciales de tiramida-biotina y tampón de amplificación B). Prepare esta solución inmediatamente antes de usarla.
20. Hornee la cristalería a 200 °C durante al menos 4 h. Trate los utensilios de plástico no desechables (incluidos los soportes de portaobjetos, los frascos Coplin y las jeringas) con 3% de H₂O₂ durante 15-30 minutos, seguido de un lavado a fondo con agua libre de ARNasa. Trate los instrumentos metálicos de acero inoxidable, como las herramientas de disección, las pinzas y los portamuestras de criostato, con 3% de H₂O₂ durante 15 min, seguido de un lavado a fondo con agua sin RNasa. Limpie las superficies del banco, la placa calefactada y los bloques secos con la solución de limpieza RNase.

2. Síntesis de ribosonda

NOTA: El siguiente procedimiento para sintetizar sondas de ARNc marcadas con digoxigenina de 1 kb para hibridación in situ mediante transcripción in vitro se basa en los protocolos publicados anteriormente 20,21,22,23.

1. Utilice pares de cebadores de oligonucleótidos apropiados para amplificar un fragmento de ADN de 1 kb del gen de interés (por ejemplo, el gen del receptor olfativo). Seleccione pares de cebadores que amplifiquen una región presente en el ARNm maduro que se va a detectar (por ejemplo, la secuencia codificante del gen). En la Tabla de Materiales se proporciona una selección de cebadores para diferentes receptores olfativos. Para obtener detalles sobre las sondas para detectar otros receptores olfativos vomeronasales, consulte las publicaciones anteriores^16,21.
2. Ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 0,8% y elimine la banda de 1 kb deseada.
3. Purifique el fragmento de ADN utilizando un kit de purificación en gel basado en mini columna adecuado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Cuantifique el fragmento de ADN purificado y clónelo en un vector de clonación de PCR adecuado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Es aconsejable utilizar vectores de clonación que contengan promotores de ARN polimerasa T7 y SP6 flanqueando el amplicón clonado.
5. Transformar el plásmido recombinante en bacterias competentes sin recombinación mediante transformación química o electroporación de acuerdo con el protocolo del fabricante.
6. Siembre las colonias de bacterias transformantes transformantes en un medio rico y aísle el plásmido mediante una minipreparación de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
7. Realizar análisis de digestión de restricción con enzimas de restricción adecuadas y/o secuenciación Sanger para comprobar la identidad y orientación del fragmento de ADN insertado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
8. Realice la digestión de restricción para linealizar 10 μg del plásmido utilizando una enzima de restricción adecuada. Para producir una ribosonda antisentido después de la transcripción in vitro , utilice una enzima de restricción que digiere el ADN plasmídico en el extremo del inserto opuesto al promotor de la ARN polimerasa ubicado aguas abajo de la secuencia codificante del gen. Para producir ribosondas de detección después de la transcripción in vitro , utilice una enzima de restricción que digiere el ADN plasmídico en el extremo del inserto opuesto al promotor de la ARN polimerasa ubicado aguas arriba de la secuencia codificante del gen.
9. Ejecute una alícuota del producto de la reacción de linealización del plásmido en un gel de agarosa al 0,8% para confirmar la integridad de la digestión. Una vez confirmada la linealización completa, purifique el resto de la reacción utilizando un kit de limpieza de PCR basado en columna de acuerdo con el protocolo del fabricante.
10. Sintetice sondas de ARNc marcadas con digoxigenina mediante transcripción in vitro utilizando 1-2 μg del plásmido linealizado como plantilla, la enzima adecuada (por ejemplo, ARN polimerasa T7 o SP6) y un kit de marcaje de digoxigenina (DIG) adecuado.
11. Retire la plantilla de ADN de la reacción digiriéndola con DNasa I a 37 °C durante 30 min.
12. Purifique las sondas de ARNc utilizando un kit de purificación de ARN basado en mini columna o un kit de purificación basado en filtración en gel. Eluir la sonda resultante en 50 μL de agua libre de RNasa.
13. Cuantificar la ribosonda resultante, preferiblemente utilizando métodos fluorométricos. Por lo general, el rendimiento esperado es superior a 100 ng/μL.
14. Ejecute la ribosonda en un sistema de electroforesis automatizado o en un gel de agarosa al 0,8% libre de RNasa para comprobar la calidad y la degradación de la sonda.
15. Guarde la sonda sintetizada a -80 °C hasta que la necesite.

3. Exposición de ratones a estímulos olfativos

1. Aloje individualmente a cada animal en una jaula limpia durante al menos 24 horas antes de la exposición. Retire la rejilla de alimentos al menos 2 horas antes de la exposición. Todos los animales utilizados en este estudio eran ratones machos C57BL/6 de 8-12 semanas de edad (peso promedio: 20 g).
2. Prepara el estímulo olfativo adecuado. Se pueden utilizar diferentes estímulos para activar las neuronas olfativas en el MOE (epitelio olfativo principal) o VNO (órgano vomeronasal). Para obtener una lista completa de estímulos olfativos, consulte otras publicaciones^{3, 16,} 22,23,24. Los estímulos líquidos, como soluciones químicas, orina o solución de proteínas recombinantes, se pueden depositar en una gasa médica o en una bola de algodón.
3. Inserte el estímulo olfativo en la jaula y deje al animal tranquilo durante 1 h.
4. Sacrificar al sujeto de ratón y diseccionar rápidamente el MOE o el VNO utilizando herramientas de disección sin RNasa.

4. Disección y congelación de tejidos

1. Diseccionar el MOE o el VNO bajo un microscopio estereoscópico utilizando una solución de disección.
   1. Para el OVN, retire los huesos septales gruesos, dejando las cáscaras de cartílago más blandas que rodean el órgano.
2. Prepare la muestra para la criosección.
   1. Seque la muestra en un pedazo de papel secante y colóquela dentro de un molde de plástico histológico que contenga medio de inclusión.
   2. Para el OVN, coloque cada órgano verticalmente y tire de él hasta el fondo del molde de plástico con la ayuda de una jeringa de 1 mL (Figura 1A).
   3. Para MOE, colóquelo en el fondo del molde de plástico con la placa cribiforme hacia abajo.
   4. Elimine el exceso de burbujas alrededor de la muestra, ya que pueden interferir con el corte.
   5. Congele los especímenes en hielo seco.
   6. Almacene el bloque de muestras a -80 °C.
      NOTA: Las muestras congeladas pueden almacenarse durante varios meses antes de seccionarlas.
3. Realizar crioseccionamientos.
   1. Encienda el criostato y ajuste la temperatura a -23 °C al menos 4 h antes de usarlo.
   2. Retire el bloque congelado del molde de plástico histológico y recórtelo con una cuchilla de afeitar.
   3. Deje 5 mm alrededor de la muestra, ya que esto facilita el manejo de la sección (Figura 1B).
   4. Utilice un medio de inclusión para fijar el bloque al portamuestras del criostato.
   5. Recoja secciones de 16 μm en portaobjetos de microscopio cargados positivamente.
   6. Guarde los portaobjetos a -80 °C.
      NOTA: Los portaobjetos pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses antes de la hibridación in situ .

5. Protocolo de hibridación in situ paso a paso

1. Seque los portaobjetos durante 10 minutos con un secador de pelo. Utilice el chorro tibio para descongelar los portaobjetos, luego cambie a chorro a temperatura ambiente hasta que el medio de inclusión esté opaco.
2. Añadir 500 μL por portaobjetos de solución fijadora de paraformaldehído al 4% libre de RNasa e incubar a 23-26 °C durante 15 min para fijar las secciones histológicas.
3. Lave los portaobjetos dos veces en 1× PBS sin RNasa durante 5 minutos cada uno.
4. Añadir 500 μL por portaobjetos de HCl 0,2 M libre de RNasa e incubar a 23-26 °C durante 10 min.
5. Lave los portaobjetos dos veces en 1× PBS sin RNasa durante 5 minutos cada uno.
6. Añadir 500 μL por portaobjetos de PBS libre de RNasa 0,1% H₂O₂/1× e incubar durante 30 min a 23-26 °C. Realice este paso en la oscuridad para evitar la degradación del peróxido de hidrógeno inducida por la luz.
7. Lave los portaobjetos dos veces en 1× PBS sin RNasa durante 5 minutos cada uno.
8. Realice la acetilación transfiriendo los portaobjetos a un frasco que contenga 250 mL de trietanolamina libre de RNasa 0,1 M pH 8,0 y una barra agitadora magnética, en una campana extractora. Añadir 625 μL de anhídrido acético bajo agitación constante. Baje la velocidad de agitación, agregue otros 625 μL gota a gota en los portaobjetos, luego apague la agitación e incube durante 10 minutos.
9. Lave los portaobjetos dos veces en 1× PBS sin RNasa durante 5 minutos cada uno.
10. Lavar los portaobjetos una vez en 1× PBS sin RNasa a 60 °C durante 5 min.
11. Realice la prehibridación retirando los portaobjetos de 1× PBS uno a la vez y secando cada uno de ellos con papel de seda de laboratorio sin pelusa. Pipetear 400 μL de solución de prehibridación en cada portaobjetos y colocarlo dentro de una cámara humidificada precalentada a 60 °C en un baño de agua o en un horno caliente. Incubar a 60 °C durante 1 h.
12. Calentar suficiente solución de hibridación a 60 °C, alícuota 200 μL por portaobjetos en tubos de microfuga, y calentarlos hasta 85 °C durante 10 min.
13. Añada la(s) sonda(s) de ARNc apropiada(s) a los tubos de solución de hibridación (1 μg/mL cada sonda) y desnaturalice a 85 °C durante 5 min.
14. Para la hibridación, tome un portaobjetos a la vez de la cámara humidificada, séquelo y colóquelo en una placa calentada a 60 °C. Añada 200 μL de solución de hibridación que contenga ribosonda y cubra el portaobjetos con un cubreobjetos de vidrio. Incubar durante 12-16 h en la cámara humidificada a 60 °C.
    NOTA: No permita que los portaobjetos se enfríen después de la prehibridación. La temperatura de hibridación debe determinarse empíricamente para cada sonda. Se sugiere sesenta grados centígrados como punto de partida, ya que generalmente funciona bien para sondas de 1 kb.
15. Calentar las soluciones de lavado SSC a 55 °C en frascos separados y colocarlos en un baño de agua a la temperatura adecuada.
16. Una vez finalizada la hibridación, retire el cubreobjetos de cada portaobjetos utilizando un baño que contenga una solución de 5× SSC a 55 °C. Sostenga cada portaobjetos horizontalmente dentro de la solución de SSC tibia. Cuando el cubreobjetos se haya desprendido, incline la corredera y deje que el cubreobjetos caiga hasta el fondo.
17. Lavar con 2× SSC a 55 °C durante 30 min en un frasco deslizante.
18. Lavar con un acero inoxidable de 0,2× a 55 °C durante 20 min en un frasco deslizante.
19. Lavar con 0,1× SSC a 55 °C durante 20 min en un frasco deslizante.
20. Transfiera a 0,1× SSC a 23-26 °C e incube durante 3 minutos en un frasco de portaobjetos.
21. Lavar en PTw durante 10 min en un frasco deslizante.
22. Lavar dos veces en TN Buffer, durante 5 minutos cada una, en un frasco deslizante.
23. Pipetear 600 μL de tampón de bloqueo de TNB en cada portaobjetos e incubar durante 3 h a 23-26 °C.
24. Pipetear 500 μL de solución de anticuerpo primario (anticuerpo anti-DIG conjugado con peroxidasa diluido 1:400 en solución de TNB) en cada portaobjetos. Superponga con cuidado un trozo de película termoplástica de laboratorio en cada portaobjetos e incube durante 12-16 h a 4 °C.
25. Lave los portaobjetos 6 veces con TNT Buffer durante 5 minutos cada uno, revolviendo suavemente en un frasco de portaobjetos.
26. Pipetear 100 μL de solución de trabajo de tiramida-biotina en cada portaobjetos. Cubrir con cubreobjetos de film termoplástico de laboratorio e incubar durante 12 min a 23-26 °C.
    NOTA: Realice este paso de incubación de forma escalonada, con 2 o 3 portaobjetos por lote, para permitir un buen control de los tiempos de incubación. Es posible que sea necesario optimizar la duración de la incubación de la tiramida, en función de la sensibilidad y la concentración de la sonda de ARNc.
27. Lave los portaobjetos 6 veces con TNT Buffer durante 5 minutos cada uno, revolviendo suavemente en un frasco de portaobjetos.
28. Pipetear 200 μL de solución que contiene estreptavidina conjugada con peroxidasa (SA-HRP, diluida 1:100 en tampón TNB) en cada portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos de película de laboratorio termoplástica. Incubar a 23-26 °C durante 1 h.
29. Lave los portaobjetos 6 veces con TNT Buffer durante 5 minutos cada uno, revolviendo suavemente en un frasco de portaobjetos.
30. Pipetear 100 μL de solución de trabajo de tiramida-Alexa 488 en cada portaobjetos, cubrir con cubreobjetos de película de laboratorio termoplástica e incubar a 23-26 °C durante 12 min en la oscuridad.
31. Lave los portaobjetos 6 veces con TNT Buffer durante 5 minutos cada uno, revolviendo suavemente en un frasco de portaobjetos.
32. Incubar en 3% H₂O₂/1× PBS en un frasco deslizante durante 1 h, para inactivar las peroxidasas de los pasos anteriores.
33. Lave los portaobjetos 6 veces con TNT Buffer durante 5 minutos cada uno, revolviendo suavemente en un frasco de portaobjetos.

6. Inmunotinción de pS6

1. Pipetear 500 μL de solución de paraformaldehído/1× PBS al 4% en cada portaobjetos e incubar a 23-26 °C durante 15 min para fijar las secciones.
2. Pipetear 500 μL de Triton X-100 al 1×/0,1% en cada portaobjetos e incubar durante 5 min para permeabilizar las secciones.
3. Lave dos veces con 1× PBS en un frasco deslizante.
4. Pipetear 2-3 gotas por sección de la solución de bloqueo de amplificación de señal de tiramida disponible en el mercado B (Tabla de Materiales) e incubar a 23-26 °C durante 1 h.
5. Pipetear 400 μL de solución de bloqueo inmunohistoquímico en cada portaobjetos e incubar a 23-26 °C durante 30 min para bloquear secciones.
6. Pipetear 200 μL de solución de anticuerpo primario anti-pS6 de conejo (diluida 1:200 en solución de bloqueo inmunohistoquímico; concentración final: 1 μg/mL) en cada portaobjetos, cubrir con cubreobjetos de película termoplástica de laboratorio e incubar a 4 °C durante 12-16 h.
7. Lave 3 veces con 1× PBS/0.1% Triton X-100, durante 5 minutos cada una en un frasco deslizante.
8. Pipetear 2-3 gotas por portaobjetos de solución de anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con peroxidasa disponibles en el mercado (Tabla de Materiales) e incubar a 23-26 °C durante 1,5 h.
9. Lave 3 veces con 1× PBS/0.1% Triton X-100, durante 5 minutos cada una en un frasco deslizante.
10. Seque los portaobjetos y pipetee de 100 a 200 μL de solución de trabajo de tiramida-Alexa 555 en cada portaobjetos, cúbralos con un trozo de cubreobjetos de película de laboratorio termoplástica e incube durante 7 minutos en la oscuridad.
11. Lave dos veces con 1× PBS durante 5 minutos cada una en un frasco deslizante.
12. Pipetear 500 μL de tinción nuclear diluida (en 1× PBS) en cada portaobjetos e incubar a 23-26 °C durante 30 min.
13. Lavar dos veces con 1× PBS a 23-26 °C durante 5 min cada una en un frasco deslizante.
14. Monte las guías con un medio de montaje antidecoloración y deje que el medio de montaje se cure durante 24 horas en la oscuridad.
15. Guarde los portaobjetos a la temperatura adecuada hasta la obtención de imágenes, para evitar el desvanecimiento de la fluorescencia.

7. Imágenes de microscopía

1. Portaobjetos de imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia o confocal equipado con filtros adecuados para los fluoróforos utilizados.

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Resultados

El protocolo actual tiene como objetivo obtener imágenes de microscopía en las que el gen de interés del experimentador y el marcador de actividad neuronal pS6 estén marcados con fluorescencia. El método descrito implica la amplificación de señal de tiramida, que produce un etiquetado claro y fuerte con poco o ningún antecedente. La inmunotinción de pS6 aparece como una señal fluorescente citoplasmática que generalmente llena todo el cuerpo de la célula neuronal, mientras que...

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Discusión

El protocolo descrito aquí identifica de forma fiable las neuronas sensoriales activadas por señales químicas en el sistema olfativo mediante una combinación de detección in situ de receptores OR o VR con inmunodetección de pS6, un marcador indirecto de la actividad neuronal. El experimentador debe tener especial cuidado para mantener la integridad histológica y realizar todos los pasos antes de la hibridación en condiciones libres de ARNasa. De lo contrario, se puede pr...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9625	n/a
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923 or B40922	refered to as Amplification Buffer A in working solutions for tyramide-Alexa 488 or tyramide-Alexa 555 signal amplification
20x SSC	Merck (Calbiochem)	8310-OP	n/a
30% Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck (Sigma-Aldrich)	A9576	n/a
30% hydrogen peroxyde (H2O2)	Merck (Sigma-Aldrich)	H1009	n/a
Acetic anhydride	Merck (Sigma-Aldrich)	320102	n/a
Agarose	Merck (Sigma-Aldrich)	A9539	n/a
Amplification diluent (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	refered to as Amplification Buffer B in working solution for tyramide-biotin signal amplification
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	Cat# 44-923G, RRID:AB_2533798	n/a
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923 or B40922	refered to as blocking solution B in the tyramide signal development step
Blocking reagent (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	refered to as blocking reagent A in the formulation for TNB buffer
DAPI nuclear stain	Thermo Fisher Scientific	D1306	n/a
Denhardt's solution (50x)	Merck (Sigma-Aldrich)	D9905	n/a
Deoinized formamide	Merck (Sigma-Aldrich)	F9037	n/a
Dextran sulfate solution (50%)	Merck (Chemicon)	S4030	n/a
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)	Merck (Sigma-Aldrich)	E9884	n/a
Hoechst 33342 nuclear stain	Thermo Fisher Scientific	H1399	n/a
Hydrochloric acid (HCl)	Merck (Sigma-Aldrich)	320331	n/a
Olfactory stimuli	n/a	Papes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)	n/a
Paraformaldehyde	Merck (Sigma-Aldrich)	P6148	n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments)	Merck (Roche)	11207733910; RRID:AB_514500	refered to as peroxidase-conjugated anti-DIG antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
ProLong Gold antifade mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934	refered to as anti-fading mounting medium
RNase-free ultrapure water	Thermo Fisher Scientific	10977015	n/a
Sodium chloride (NaCl)	Merck (Sigma-Aldrich)	S9888	n/a
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Merck (Sigma-Aldrich)	436143	n/a
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck (Sigma-Aldrich)	S8045	n/a
Sucrose	Merck (Sigma-Aldrich)	S0389	n/a
Triethanolamine	Merck (Sigma-Aldrich)	T58300	n/a
Triton X-100	Merck (Sigma-Aldrich)	X100	n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)	Merck (Sigma-Aldrich)	T5941	n/a
Tween-20	Merck (Sigma-Aldrich)	822184	n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)	Thermo Fisher Scientific	B40923	n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
Yeast tRNA	Merck (Roche)	10109495001	n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit	Thermo Fisher Scientific	B40922	n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit	Thermo Fisher Scientific	B40923	n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)	Merck (Roche)	11175025910	n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape)	Agilent	5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579	refered to as automated electrophoresis system
Mouse: C57BL/6J inbred strain	Jackson Laboratories	Stock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)	n/a
ProbeQuant G-50 Micro Columns	Cytiva Biosciences	28903408	refered to as gel filtration-based purification kit
QIAquick gel extraction kit	Qiagen	28506	refered to as mini column-based gel-purification kit
RNeasy MinElute cleanup kit	Qiagen	74204	refered to as mini column-based RNA purification kit
TSA Biotin kit	Akoya Biosciences (Perkin Elmer)	SAT700001EA	n/a
Oligonucleotides
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG CAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT TCCC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA GAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA ACG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA ATAGTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT GTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT GGC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG TTC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Olfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC AAGC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA CTG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG AG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT TCTTACAGGACAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT AAGCAAGGAATTCCAC – 3'	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC CAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC CAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG ATCT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC A – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC TTCTGGAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG CCAGATATGTCAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT CCCAGATGCTTTTGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT AGCTGAGAAATACAAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA GA – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA CTGT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT TCC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT TGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC G – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG TG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG GC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC C – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC AG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA AGCATCG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT TGGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT TTAGAC – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT GATGTGA – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT CTACTACACCATGATGG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a	Vmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’	Integrated DNA Technologies	n/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vector	Promega	A1360	reccommended PCR cloning vector
Other materials
1mL syringes	Fisher Scientific	14-829-10F	n/a
Conical tubes (15 mL and 50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22, 14-959-49B	n/a
Coplin jars	Fisher Scientific	12-567-099, 07-200-81	n/a
Cryostat	Leica Biosystems	CMS 1850	n/a
Dissecting tools and forceps	Roboz	RS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111	n/a
Dry bath	n/a	n/a	n/a
Electrophoresis equipment	Fisher Scientific	09-528-110B	n/a
Fine point paintbrushes	Winsor & Newton	10269097	n/a
Fluorescence or confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5II	n/a
Heated plate	Fisher Scientific	HP88850200	n/a
Humidified chamber (if used at higher temperatures, it will need to be sealed inside a plastic Tupperware container)	Thermo Fisher Scientific	22-045-034	n/a
Lint-free laboratory Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	refered to as lint-free laboratory tissue paper
Microcentrifuge	Eppendorf	5401000013	n/a
Mouse cages	InnoVive	M-BTM, MVX1	n/a
PCR Thermocycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	n/a
Pipette p1000, p200, and p20 disposable tips	Fisher Scientific	02-707-408, 02-707-411, 02-707-438	n/a
Plastic histology embedding mold	Thermo Fisher Scientific	22-19	n/a
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33238	refered to as highly sensitive fluorometric method
Razor blades or scalpels	Fisher Scientific	12-640	n/a
RNA tapestation or BioAnalyzer	Agilent	4200 TapeStation System or 2100 Bioanalyzer Instrument	n/a
RNase-free glass or plastic graduated cylinders and beakers	Fisher Scientific	10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25D	n/a
Stereomicroscope	Leica Microsystems	M80	n/a
SuperFrost Plus microscope slides	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	referred to as positively charged microscope slides
Parafilm	Bemis Company	PM999	refered to as thermoplastic laboratory film
Water bath	Thermo Fisher Scientific	TSCIR19	n/a