JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה משלב הכלאה באתרה עם אימונופלואורסצנציה כדי לזהות גנים של קולטני ריח וומרונזאלי המתבטאים בתאי עצב חושי ריח לאחר הפעלה על ידי גירויים כימיים בעכבר.

Abstract

בעלי חיים מסתמכים על תקשורת כימית כדי להעביר ולתפוס מידע סביבתי רלוונטי, החל מהערכת איכות המזון ועד לזיהוי שותפים או איומים זמינים להזדווגות. בעכברים, משימה זו מבוצעת בעיקר על ידי מערכת הריח ותת-המערכות הבסיסיות שלה, כולל מערכות הריח הראשיות והאביזרים. לשניהם יש איברים היקפיים המאוכלסים על ידי נוירונים חושיים המבטאים קולטנים מצומדים לחלבון G המסוגלים לקשור רמזים כימיים המגיעים לחלל האף. למרות שהמאפיינים המולקולריים של קולטנים אלה מובנים היטב, מעט ידוע על הליגנדים הספציפיים שלהם. השיטה המתוארת כאן משלבת זיהוי הכלאה באתרה של קולטני ריח או וומרונזאלי עם זיהוי חיסוני של חלבון ריבוזומלי זרחני S6 (pS6) - סמן להפעלה עצבית. פרוטוקול זה תוכנן כדי לזהות נוירונים המופעלים לאחר אירוע יחיד של חשיפה לגירויים כימיים מטוהרים או מורכבים שזוהו על ידי איברי הריח. חשוב לציין, טכניקה זו מאפשרת לחקור נוירונים המופעלים בהקשרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. באופן אידיאלי, יש להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את הביולוגיה המולקולרית של מערכת הריח ולחקור התנהגויות ריח.

Introduction

איתות כימי הוא צורת התקשורת הנפוצה ביותר בקרב בעלי חיים. ביונקים, זיהוי רמזים כימיים מתווך בעיקר באמצעות חוש הריח והוא בעל חשיבות עליונה למציאת מזון, איתור שותפים אפשריים להזדווגות והימנעות מטורפים פוטנציאליים 1,2,3. מערכת הריח של העכבר מחולקת עוד יותר לתת-מערכות שונות, שלכל אחת מהן תכונות אנטומיות, פיזיולוגיות ומולקולריות משלה4. בין אלה, מערכת הריח הראשית (MOS) ומערכת הריח הנלווית (AOS) הן הנחקרות ביותר ומאופיינות טוב יותר.

ה-MOS אחראי בעיקר על איתור מולקולות כימיות נדיפות המגיעות לחלל האף. זה מושג על ידי נוירונים חושי ריח (OSNs), המאכלסים את הממשק החושי של המערכת - אפיתל הריח הראשי (MOE). כל OSN מבטא אחד מתוך אלפי קולטני ריח (ORs) בצורה מונוגנית ומונואללית5. יתר על כן, OR נוטים להיות מכוונים באופן רחב6, וריח בודד עשוי להיקשר ליותר מ-OR אחד, וליצור קוד קומבינטורי לריחות7.

בתורו, ה-AOS אחראי בעיקר על זיהוי פרומון וקיירומון. ליגנדים אלה מפעילים נוירוסים חושיים וומרונזאליים (VSNs) באיבר הוומרונזאלי (VNO). VSNs באזור האפיקלי של ה-VNO מבטאים קולטנים ממשפחת הקולטנים הוומרונזאליים 1 (V1Rs)8, בעוד נוירונים באזור הבסיס מבטאים את משפחת הקולטנים הוומרונזאליים 2 (V2Rs)9. חשוב לציין, הוכח שחלק מה-VSNs מבטאים במשותף יותר מקולטן וומרונזאלי אחד 10,11,12.

למרות כל המידע הזמין על המאפיינים המולקולריים של ORs ו-VRs, הידע על הליגנדים הקוגנטיים שלהם עדיין מוגבל מאוד. זיהוי נוירוני ריח ספציפיים האחראים לזיהוי מולקולה או גירוי מורכב הוא משימה חשובה עבור אלה החוקרים חוש ריח, התנהגויות מונעות ריח ותגובות פיזיולוגיות. מספר אסטרטגיות נוסו לביטול יתמות קולטני הריח, כולל הדמיית סידן7, ריצוף RNA של תא בודד13,14, ביטוי קולטנים הטרולוגיים15 ואסטרטגיות המבוססות על גנים מוקדמים מיידיים (IEGs)16. לאחרונה, נעשה שימוש בכמה טכניקות כדי להעריך את ההשפעות המווסתות של ריחות בנוירונים חושיים, תוך שימוש בהדמיית סידן in vivo 17,18 ואסטרטגיות ריצוף RNA חד-תאיות מתויגות בחלבון פלואורסצנטי19. רוב הטכניקות הללו דורשות הגדרה מלאכותית או מבוצעות על נוירונים מנותקים, מה שהופך את זה לבלתי אפשרי להעריך בו זמנית התנהגויות המופעלות על ידי הריחות שבהם נעשה שימוש.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי של נוירונים חושיים המופעלים לאחר אירוע יחיד של חשיפה לריח, על ידי שילוב ריבופרוב המזהים ORs או VRs ספציפיים עם זיהוי חיסוני של חלבון ריבוזומלי S6 זרחני (pS6), פרוקסי להפעלה עצבית. שיטה זו היא דרך אמינה לחקור את זהותם של נוירונים חושיים המופעלים על ידי אותות כימולוגיים שונים בהקשר רלוונטי מבחינה ביולוגית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים #1883-1, שאושר על ידי אוניברסיטת קמפינאס (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון לביולוגיה - הוועדה לאתיקה בשימוש בבעלי חיים במחקר), העוקבת אחר ההנחיות שנקבעו על ידי המועצה הלאומית הפדרלית לבקרת ניסויים בבעלי חיים (CONCEA).

1. הכנת חומר

  1. הכן 1 ליטר של 3% H2O2 (v/v) ב-1x PBS. לדלל 100 מ"ל 10× PBS ו-100 מ"ל של 30% H2O2 ב-500 מ"ל מים טהורים במיוחד. השלימו את הנפח עם מים טהורים במיוחד. הכן פתרון זה מיד לפני השימוש.
  2. הכן תא לח המכיל חתיכות מגבוני מעבדה נטולי מוך רטובים בתמיסת SSC 5×.
  3. הכן פתרונות שטיפה היברידיים: 5× SSC (ב-55 מעלות צלזיוס), 2× SSC (55 מעלות צלזיוס), 0.2× SSC (55 מעלות צלזיוס) ו-0.1× SSC (55 מעלות צלזיוס וטמפרטורת החדר). ממיסים את הכמויות המתאימות של תמיסת מלאי SSC של 20× במים טהורים ללא RNase. הכן את התמיסות המדוללות טריות לפני תחילת כל ניסוי.
  4. הכן תמיסה חוסמת אימונוהיסטוכימיה: 1× PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100. עבור 100 מ"ל, יש לדלל 10 מ"ל של 10× PBS, 10 מ"ל של 10% BSA ו-3.33 מ"ל של 3% Triton X-100 ב-70 מ"ל של מים טהורים במיוחד. השלימו את הנפח עם מים טהורים במיוחד. הכן את התמיסות המדוללות טריות לפני תחילת כל ניסוי.
  5. הכן תמיסת PTw: 1× PBS/0.1% Tween-20. עבור 100 מ"ל, יש לדלל 1 מ"ל של 10% Tween-20 ו-10 מ"ל של 10× PBS ב-70 מ"ל מים טהורים במיוחד. השלימו את הנפח עם מים טהורים במיוחד. הכן תמיסה זו טרייה לפני תחילת כל ניסוי.
  6. הכן תמיסת טריאתנולאמין 0.1M ללא RNase. עבור 250 מ"ל, יש לדלל 3.33 מ"ל של טריאתנולאמין בדרגת ריאגנט ב-200 מ"ל של מים טהורים ללא RNase תחת תסיסה (השתמש בכלי זכוכית נטולי RNase ובמערבל מגנטי בעת הכנת תמיסה זו). התאימו את ה-pH ל-8.0 עם HCl. השלימו את הנפח עם מים טהורים במיוחד נטולי RNase ואחסנו מוגן מאור עד לשימוש. הכן תמיסה זו טרייה לפני תחילת כל ניסוי.
  7. הכן ללא RNase 0.1% H2O2 (v/v) ב-1× PBS. עבור 1 ליטר, יש לדלל 100 מ"ל של 10× PBS ו-3.3 מ"ל של 30% H2O2 ב-500 מ"ל של מים טהורים ללא RNase. השלימו את הנפח עם מים טהורים במיוחד ללא RNase. הכן פתרון זה מיד לפני השימוש.
  8. הכן פתרונות נטולי RNase מהדברים הבאים: 0.2 M HCl; 1 מ' Tris-HCl pH 8.0; 10 מ"ג/מ"ל tRNA שמרים; 10% SDS; 10× PBS; 100× הפתרון של דנהרדט; 20× SSC; 50% דקסטרן סולפט; 6 מ' הידרוכלוריד
  9. הכן תמיסת קיבוע פרפורמלדהיד 4% ללא RNase. עבור 100 מ"ל, ממיסים 4 גרם פרפורמלדהיד ב 80 מ"ל של 1× PBS. התאם את ה-pH ל-7.4 עם 10 M NaOH. השלם את עוצמת הקול עם 1× PBS. יש להכין פתרון זה טרי לפני תחילת כל ניסוי.
    זהירות: פרפורמלדהיד הוא חומר מסוכן שעלול לגרום נזק בשאיפה. הכן תמיסה מתחת למכסה אדים ולבש כפפות מגן, מסכה ומשקפי מגן.
  10. הכן תמיסת דיסקציה ללא RNase: 30% סוכרוז/0.45 M EDTA pH 8.0/1× PBS. עבור 100 מ"ל, ממיסים 30 גרם סוכרוז ב-60 מ"ל של 0.5 M EDTA pH 8.0 ללא RNase. הוסף 10 מ"ל של 10× PBS. השלם את הנפח עם 0.5 M EDTA pH 8.0 ללא RNase.
  11. הכן גלילים וכוסות מזכוכית או פלסטיק ללא RNase.
  12. הכן פתרונות קדם-הכלאה והכלאה ללא RNase: 50% פורממיד דה-יונים (v/v)/600 מ"מ NaCl/200 מיקרוגרם/מ"ל שמרים tRNA/0.25% SDS (w/v)/10 מ"מ Tris-HCl pH 8.0/1× תמיסת דנהרדט/1 מ"מ EDTA pH 8.0/10% דקסטרן סולפט (w/v). עבור 10 מ"ל בצילינדר מדורג, הוסף 5 מ"ל של פורממיד נטול יונים, 1.2 מ"ל של 5 M NaCl, 200 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל שמרים tRNA, 250 מיקרוליטר של 10% SDS, 100 מיקרוליטר של 1 M Tris-HCl pH 8.0, 200 מיקרוליטר של 50× תמיסת דנהרדט, 20μL של 500 מ"מ EDTA pH 8.0 ו-2 מ"ל של 50% דקסטרן סולפט (M.W. 500,000). השלימו את הנפח עם מים טהורים במיוחד ללא RNase. הכן תמיסה זו טרייה לפני תחילת כל ניסוי.
    הערה: דקסטרן סולפט הוא צמיג מאוד. רצוי להכין 20% נוספים מהנפח הכולל של פתרונות הכלאה/טרום-הכלאה כדי לקחת בחשבון שגיאות פיפטינג. ניתן להשמיט tRNA של שמרים מתמיסת הקדם-הכלאה, אם תרצה.
  13. הכן כיסויי סרטי מעבדה תרמופלסטיים. חותכים חתיכות סרט מעבדה תרמופלסטיות מלבניות קצרות ב-1-2 מ"מ מהאורך והרוחב של שקופית מיקרוסקופ.
  14. הכן מאגר TN: 100 מ"מ Tris-HCl / 150 מ"מ NaCl. עבור 100 מ"ל, יש לדלל 10 מ"ל של 1 M Tris-HCl pH 7.5 ו-3 מ"ל של 5 M NaCl ב-70 מ"ל מים טהורים במיוחד. השלימו את הנפח עם מים טהורים במיוחד. הכן תמיסה זו טרייה לפני תחילת כל ניסוי.
  15. הכן מאגר חסימת TNB: 0.5% מגיב חסימה A (w/v) במאגר TN. עבור 200 מ"ל, ממיסים 1 גרם של מגיב חוסם A ב-200 מ"ל של TN Buffer (ראה טבלת חומרים למקור מסחרי של מגיב חוסם A).
  16. הכן מאגר TNT: 0.05% Tween-20 במאגר TN. עבור 1 ליטר, יש לדלל 5 מ"ל של 10% Tween-20 ב-950 מ"ל של מאגר TN. השלם לאט את עוצמת הקול עם מאגר TN כדי למנוע קצף. הכן תמיסה זו טרייה לפני תחילת כל ניסוי.
  17. הכן פתרון עבודה של Tyramide-Alexa 488: 1× מאגר הגברה A/0.0015% H2O2/1:100 טירמיד-אלקסה 488. עבור 100 מיקרוליטר, יש לדלל 1 מיקרוליטר של 0.15% H2O2 ו-1 מיקרוליטר של טירמיד-אלקסה 488 ב-98 מיקרוליטר של מאגר הגברה A (ראה טבלת חומרים למקורות מסחריים של טירמיד-אלקסה 488 ומאגר הגברה A). הכן פתרון זה מיד לפני השימוש.
  18. הכן את פתרון העבודה של Tyramide-Alexa 555: 1× מאגר הגברה A/0.0015% H2O2/1:100 טירמיד-Alexa 555. עבור 100 מיקרוליטר, יש לדלל 1 מיקרוליטר של 0.15% H2O2 ו-1 מיקרוליטר של טירמיד-אלקסה 555 ב-98 מיקרוליטר של מאגר הגברה A (ראה טבלת חומרים למקורות מסחריים של טירמיד-אלקסה 555 ומאגר הגברה A). הכן פתרון זה מיד לפני השימוש.
  19. הכן תמיסת עבודה של טירמיד-ביוטין: 1× מאגר הגברה B/0.0015% H2O2/1:50 טירמיד-ביוטין. עבור 100 מיקרוליטר, יש לדלל 1 מיקרוליטר של 0.15% H,2O2 ו-2 מיקרוליטר של טירמיד-ביוטין ב-97 מיקרוליטר של מאגר הגברה B (ראה טבלת חומרים למקורות מסחריים של טירמיד-ביוטין ומאגר הגברה B). הכן פתרון זה מיד לפני השימוש.
  20. אופים כלי זכוכית בחום של 200 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות. טפלו בכלי פלסטיק לא חד פעמיים (כולל מדפי שקופיות, צנצנות קופלין ומזרקים) עם 3% H2O2 למשך 15-30 דקות, ולאחר מכן שטיפה יסודית תחת מים ללא RNase. טפל במכשירי מתכת מנירוסטה, כגון כלי דיסקציה, מלקחיים ומחזיקי דגימות קריוסטט, עם 3% H2O2 למשך 15 דקות, ולאחר מכן שטיפה יסודית תחת מים ללא RNase. נקה משטחי ספסל, צלחת מחוממת ובלוקים יבשים עם תמיסת ניקוי RNase.

2. סינתזת ריבופרוב

הערה: ההליך הבא לסינתזה של בדיקות cRNA עם תווית של 1 kb digoxigenin עבור הכלאה באתרה באמצעות שעתוק במבחנה מבוסס על פרוטוקולים שפורסמו בעבר 20,21,22,23.

  1. השתמש בזוגות פריימר אוליגונוקלאוטידים מתאימים כדי להגביר מקטע DNA של 1 קילו-בייט מהגן המעניין (למשל, גן קולטן ריח). בחר זוגות פריימרים המגדילים אזור הקיים ב-mRNA הבוגר שיש לזהות (לדוגמה, רצף הקידוד של הגן). מבחר פריימרים לקולטני ריח שונים מסופק בטבלת החומרים. לפרטים על בדיקות לאיתור קולטני ריח וומרונזאליים אחרים, אנא עיין בפרסומים קודמים16,21.
  2. הפעל את מוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוז 0.8% והסר את רצועת ה-1 kb הרצויה.
  3. טהר את שבר ה-DNA באמצעות ערכת טיהור ג'ל מתאימה מבוססת מיני עמודה על פי פרוטוקול היצרן.
  4. כמת את שבר ה-DNA המטוהר ושכפל אותו לווקטור שיבוט PCR מתאים בהתאם לפרוטוקול היצרן. רצוי להשתמש בווקטורי שיבוט המכילים מקדמי RNA פולימראז T7 ו-SP6 המאגפים את המגבר המשובט
  5. הפוך את הפלסמיד הרקומביננטי לחיידקים מוכשרים ללא רקומבינציה באמצעות טרנספורמציה כימית או אלקטרופורציה על פי פרוטוקול היצרן.
  6. זרעים בודדו מושבות חיידקים טרנספורמטיביות למדיום עשיר ומבודדים את הפלסמיד באמצעות מיני הכנת DNA על פי פרוטוקול היצרן.
  7. בצע ניתוח עיכול הגבלה עם אנזימי הגבלה מתאימים ו/או ריצוף סנגר כדי לבדוק את הזהות והכיוון של מקטע ה-DNA שהוכנס בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  8. בצע עיכול הגבלה כדי ליניאריזציה של 10 מיקרוגרם של הפלסמיד באמצעות אנזים הגבלה מתאים. כדי לייצר ריבופרוב אנטי-חושי לאחר שעתוק במבחנה , השתמש באנזים הגבלה המעכל את ה-DNA של הפלסמיד בקצה התוסף הנגדי למקדם ה-RNA פולימראז הממוקם במורד הזרם לרצף הקידוד של הגן. כדי לייצר ריבופרובסקי חישה לאחר שעתוק במבחנה , השתמש באנזים הגבלה המעכל את ה-DNA של הפלסמיד בקצה התוסף הנגדי למקדם ה-RNA פולימראז הממוקם במעלה הזרם לרצף הקידוד של הגן.
  9. הפעל מנה של מוצר תגובת הליניאריזציה של הפלסמיד על ג'ל אגרוז 0.8% כדי לאשר את שלמות העיכול. לאחר אישור הליניאריזציה המלאה, טהר את שארית התגובה באמצעות ערכת ניקוי PCR מבוססת עמודות בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  10. סנתז בדיקות cRNA עם תווית דיגוקסיגנין על ידי שעתוק במבחנה באמצעות 1-2 מיקרוגרם של הפלסמיד הליניארי כתבנית, האנזים המתאים (למשל, T7 או SP6 RNA פולימראז), וערכת תיוג דיגוקסיגנין (DIG) מתאימה.
  11. הסר את תבנית ה-DNA מהתגובה על ידי עיכול עם DNase I ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  12. טהר את בדיקות ה-cRNA באמצעות ערכת טיהור RNA מבוססת עמודה מיני או ערכת טיהור מבוססת סינון ג'ל. לחסל את הגשושית המתקבלת ב-50 מיקרוליטר של מים נטולי RNase.
  13. כמת את הריבופרוב המתקבל, רצוי בשיטות פלואורומטריות. בדרך כלל, התשואה הצפויה היא מעל 100 ננוגרם/מיקרוליטר.
  14. הפעל את הריבופרוב על מערכת אלקטרופורזה אוטומטית או על ג'ל אגרוז 0.8% נטול RNase כדי לבדוק את איכות הבדיקה והשפלה.
  15. אחסן את הגשושית המסונתזת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד הצורך.

3. חשיפת עכברים לגירוי ריח

  1. יש לשכן כל בעל חיים בנפרד בכלוב נקי למשך 24 שעות לפחות לפני החשיפה. הסר את רשת המזון לפחות שעתיים לפני החשיפה. כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה היו עכברים זכרים בני 8-12 שבועות C57BL/6 (משקל ממוצע: 20 גרם).
  2. הכן את גירוי הריח המתאים. ניתן להשתמש בגירויים שונים כדי להפעיל נוירוני ריח ב-MOE (אפיתל הריח הראשי) או VNO (איבר הוומרונזאלי). לרשימה מקיפה של גירוי ריח, אנא עיין בפרסומים אחרים3, 16, 22,23,24. גירויים נוזליים, כגון תמיסות כימיות, שתן או תמיסת חלבון רקומביננטית, יכולים להיות מופקדים על גזה רפואית או צמר גפן.
  3. הכנס את גירוי הריח לכלוב והשאיר את החיה ללא הפרעה למשך שעה.
  4. המתת חסד של נושא העכבר וניתוח מהיר של ה-MOE או ה-VNO באמצעות כלי ניתוח ללא RNase.

4. חיתוך והקפאת רקמות

  1. נתח את ה-MOE או ה-VNO תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות תמיסת דיסקציה.
    1. עבור ה- VNO, הסר את עצמות המחיצה העבות והשאיר את קליפות הסחוס הרכות יותר המקיפות את האיבר.
  2. הכן דגימה לחיתוך קריו.
    1. כתם את הדגימה יבשה על פיסת נייר סופג והניח אותה בתוך תבנית פלסטיק היסטולוגית המכילה מדיום הטבעה.
    2. עבור VNO, סדרו כל איבר בצורה אנכית ומשכו אותו לתחתית תבנית הפלסטיק בעזרת מזרק של 1 מ"ל (איור 1A).
    3. עבור MOE, הנח אותו בתחתית תבנית הפלסטיק כשצלחת הקריבריפורם פונה כלפי מטה.
    4. הסר את עודפי הבועות סביב הדגימה מכיוון שהן עלולות להפריע לחתך.
    5. הקפיא דגימות על קרח יבש.
    6. אחסן את גוש הדגימה ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: דגימות קפואות עשויות להיות מאוחסנות מספר חודשים לפני החיתוך.
  3. בצע חיתוך קריו.
    1. הפעל את הקריוסטט והגדר את הטמפרטורה ל-23 מעלות צלזיוס לפחות 4 שעות לפני השימוש.
    2. הסר את הגוש הקפוא מתבנית הפלסטיק ההיסטולוגית וחתוך אותו בעזרת סכין גילוח.
    3. השאירו 5 מ"מ סביב הדגימה, מכיוון שהדבר מקל על הטיפול בחתך (איור 1B).
    4. השתמש במדיום הטבעה כדי לחבר את הבלוק למחזיק הדגימה של הקריוסטט.
    5. אסוף מקטעים של 16 מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובית.
    6. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים לפני הכלאה באתר .

5. פרוטוקול הכלאה שלב אחר שלב באתרו

  1. יבש את המגלשות למשך 10 דקות בעזרת מייבש שיער. השתמש בסילון החם כדי להפשיר את השקופיות, ולאחר מכן עבור לסילון בטמפרטורת החדר עד שמדיום ההטבעה אטום.
  2. הוסף 500 מיקרוליטר לכל שקופית של תמיסת קיבוע פרפורמלדהיד 4% ללא RNase ודגר בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לתקן את החלקים ההיסטולוגיים.
  3. שטפו את השקופיות פעמיים ב-1× PBS ללא RNase למשך 5 דקות כל אחת.
  4. הוסף 500 מיקרוליטר לכל שקופית של 0.2 M HCl ללא RNase ודגירה בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. שטפו את השקופיות פעמיים ב-1× PBS ללא RNase למשך 5 דקות כל אחת.
  6. הוסף 500 מיקרוליטר לכל שקופית של 0.1% H2O2/1× PBS ללא RNase ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס. בצע שלב זה בחושך כדי למנוע פירוק של מי חמצן הנגרמת על ידי אור.
  7. שטפו את המגלשות פעמיים ב-1× PBS ללא RNase למשך 5 דקות כל אחת.
  8. בצע אצטילציה על ידי העברת שקופיות לצנצנת המכילה 250 מ"ל של טריאתנולמין נטול RNase 0.1 M pH 8.0 ומוט ערבוב מגנטי, במכסה אדים. הוסף 625 מיקרוליטר אנהידריד אצטי תוך ערבוב מתמיד. מנמיכים את מהירות הערבוב, מוסיפים עוד טיפה אחר טיפה של 625 מיקרוליטר על המגלשות, ואז מכבים את הערבוב ודוגרים למשך 10 דקות.
  9. שטפו את המגלשות פעמיים ב-1× PBS ללא RNase למשך 5 דקות כל אחת.
  10. שטפו את המגלשות פעם אחת ב-1× PBS ללא RNase ב-60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  11. בצע הכלאה מוקדמת על ידי הסרת שקופיות מ-1× PBS אחת בכל פעם וניקוי כל אחת מהן באמצעות נייר טישו מעבדה נטול מוך. שפכו 400 מיקרוליטר של תמיסת הכלאה מוקדמת על כל שקופית והניחו אותה בתוך תא לח שחומם מראש ב-60 מעלות צלזיוס באמבט מים או בתנור מחומם. דגירה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  12. מחממים מספיק תמיסת הכלאה ל-60 מעלות צלזיוס, מכסים 200 מיקרוליטר לכל שקופית בצינורות מיקרופוגה, ומחממים אותם עד 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  13. הוסף את בדיקת ה-cRNA המתאימה לצינורות תמיסת ההכלאה (1 מיקרוגרם/מ"ל כל בדיקה) ודנאטור ב-85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  14. לצורך הכלאה, קחו שקופית אחת בכל פעם מהתא הלח, ייבשו אותה והניחו אותה על צלחת מחוממת של 60 מעלות צלזיוס. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת הכלאה המכילה ריבופרופרוב וכסה את השקופית בכיסוי זכוכית. דגירה למשך 12-16 שעות בתא הלח בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.
    הערה: אל תאפשר למגלשות להתקרר לאחר הכלאה מוקדמת. יש לקבוע באופן אמפירי את טמפרטורת ההכלאה עבור כל בדיקה. שישים מעלות צלזיוס מוצעות כנקודת התחלה, מכיוון שהיא בדרך כלל עובדת היטב עבור בדיקות של 1 קילו-בייט.
  15. מחממים תמיסות כביסה SSC ל-55 מעלות צלזיוס בצנצנות נפרדות ומניחים אותן באמבט מים בטמפרטורה המתאימה.
  16. לאחר סיום ההכלאה, הסר את הכיסוי מכל מגלשה באמצעות אמבטיה המכילה תמיסת SSC 5× בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. החזק כל שקופית אופקית בתוך תמיסת ה-SSC החמה. כאשר החלקת הכיסוי התנתקה, הטה את המגלשה ותן לכיסוי ליפול לתחתית.
  17. שוטפים עם 2× SSC ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בצנצנת שקופיות.
  18. שוטפים עם 0.2× SSC ב-55 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בצנצנת שקופיות.
  19. שוטפים עם 0.1× SSC ב-55 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בצנצנת שקופיות.
  20. מעבירים ל-0.1× SSC בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך 3 דקות בצנצנת שקופיות.
  21. שוטפים ב-PTw למשך 10 דקות בצנצנת שקופיות.
  22. שוטפים פעמיים ב-TN Buffer, למשך 5 דקות כל אחת, בצנצנת שקופיות.
  23. פיפט 600 מיקרוליטר של מאגר חוסם TNB על כל שקופית ודגירה למשך 3 שעות בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס.
  24. שפכו 500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית (נוגדן אנטי-DIG מצומד פרוקסידאז מדולל 1:400 בתמיסת TNB) על כל שקופית. הניחו בזהירות פיסת סרט מעבדה תרמופלסטי על כל שקופית ודגרו למשך 12-16 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  25. שטפו את השקופיות 6 פעמים עם TNT Buffer למשך 5 דקות כל אחת, תוך ערבוב קל בצנצנת שקופיות.
  26. שפכו 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה טירמיד-ביוטין על כל שקופית. מכסים בכיסויי סרט מעבדה תרמופלסטיים ודוגרים למשך 12 דקות בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס.
    הערה: בצע שלב דגירה זה בצורה מדורגת, עם 2 או 3 שקופיות לכל אצווה, כדי לאפשר שליטה טובה על זמני הדגירה. ייתכן שיהיה צורך לייעל את משך הדגירה של טירמיד, בהתאם לרגישות וריכוז בדיקת ה-cRNA.
  27. שטפו את השקופיות 6 פעמים עם TNT Buffer למשך 5 דקות כל אחת, תוך ערבוב קל בצנצנת שקופיות.
  28. שפכו 200 מיקרוליטר של תמיסה המכילה סטרפטווידין מצומד פרוקסידאז (SA-HRP, מדולל 1:100 במאגר TNB) על כל שקופית וכסו בכיסוי סרט מעבדה תרמופלסטי. דגירה בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  29. שטפו את השקופיות 6 פעמים עם TNT Buffer למשך 5 דקות כל אחת, תוך ערבוב קל בצנצנת שקופיות.
  30. הכניסו 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה טירמיד-אלקסה 488 על כל שקופית, מכסים בכיסוי סרט מעבדה תרמופלסטי ודוגרים בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות בחושך.
  31. שטפו את השקופיות 6 פעמים עם TNT Buffer למשך 5 דקות כל אחת, תוך ערבוב קל בצנצנת שקופיות.
  32. דגירה ב-3% H2O2/1× PBS בצנצנת שקופיות למשך שעה, כדי לנטרל פרוקסידאזות מהשלבים הקודמים.
  33. שטפו את השקופיות 6 פעמים עם TNT Buffer למשך 5 דקות כל אחת, תוך ערבוב קל בצנצנת שקופיות.

6. צביעה חיסונית pS6

  1. שפכו 500 מיקרוליטר של תמיסת 4% פרפורמלדהיד/1× PBS על כל שקופית ודגרו בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לתקן חלקים.
  2. פיפט 500 מיקרוליטר של 1× PBS/0.1% טריטון X-100 על כל שקופית ודגירה למשך 5 דקות כדי לחלחל חלקים.
  3. שוטפים פעמיים עם 1× PBS בצנצנת שקופיות.
  4. פיפט 2-3 טיפות לכל קטע של הגברת אות טירמיד הזמינה מסחרית חסימת פתרון B (טבלת חומרים) ודגירה בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  5. זרקו 400 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת אימונוהיסטוכימיה על כל שקופית ודגרו בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לחסום קטעים.
  6. פיפט 200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית נגד pS6 של ארנב (מדולל 1:200 בתמיסת חסימת אימונוהיסטוכימיה; ריכוז סופי: 1 מיקרוגרם/מ"ל) על כל שקופית, מכסים בכיסוי סרט מעבדה תרמופלסטי ודוגרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
  7. יש לשטוף 3 פעמים עם 1× PBS/0.1% Triton X-100, למשך 5 דקות כל אחת בצנצנת שקופיות.
  8. פיפט 2-3 טיפות לכל שקופית של תמיסת נוגדנים משנית נגד ארנב מצומד פרוקסידאז זמין מסחרית (טבלת חומרים) ודגירה בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך 1.5 שעות.
  9. יש לשטוף 3 פעמים עם 1× PBS/0.1% Triton X-100, למשך 5 דקות כל אחת בצנצנת שקופיות.
  10. כתם מחליק יבש ומזרם 100 עד 200 מיקרוליטר של תמיסת עבודה טירמיד-אלקסה 555 על כל שקופית, מכסה חתיכת כיסוי סרט מעבדה תרמופלסטי, ודוגר במשך 7 דקות בחושך.
  11. שוטפים פעמיים עם 1× PBS למשך 5 דקות כל אחד בצנצנת שקופיות.
  12. שפכו 500 מיקרוליטר של כתם גרעיני מדולל (ב-1× PBS) על כל שקופית ודגרו בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  13. יש לשטוף פעמיים עם 1× PBS בטמפרטורה של 23-26 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כל אחת בצנצנת שקופיות.
  14. הרכיבו מגלשות עם אמצעי הרכבה נגד דהייה ותנו למדיום ההרכבה להתרפא למשך 24 שעות בחושך.
  15. אחסן שקופיות בטמפרטורה המתאימה עד להדמיה, כדי למנוע דהיית הקרינה.

7. הדמיית מיקרוסקופיה

  1. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי המצויד במסננים מתאימים לפלואורופורים המשמשים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי נועד להשיג תמונות מיקרוסקופיות שבהן הגן המעניין של הנסיין וסמן הפעילות העצבית pS6 מסומנים באופן פלואורסצנטי. השיטה המתוארת כוללת הגברת אותות טירמיד, המייצרת תיוג ברור וחזק עם מעט רקע. צביעה חיסונית pS6 מופיעה כאות פלואורסצנטי ציטופלזמי הממלא בדרך כלל את ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מזהה באופן מהימן נוירונים חושיים המופעלים על ידי רמזים כימיים במערכת הריח באמצעות שילוב של זיהוי באתרם של קולטני OR או VR עם זיהוי חיסוני של pS6, סמן עקיף לפעילות עצבית. על הנסיין לנקוט משנה זהירות כדי לשמור על שלמות ההיסטולוגיה ולבצע את כל השלבים ל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים מכל סוג שהוא.

Acknowledgements

אנו מודים ל-GAG Pereira ו-JA Yunes על המשאבים, ל-APF Ferreira ול-WO Bragança על העזרה האדמיניסטרטיבית והטכנית, ולצוות מתקן הליבה למדעי החיים (LaCTAD-UNICAMP) על העזרה במיקרוסקופיה קונפוקלית. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP; מספרי מענקים 2009/00473-0 ו-2015/50371-0 ל-F.P.), על ידי PRP/UNICAMP (מספרי מענק 2969/16, 725/15, 348/14 ו-315/12 ל-F.P.), על ידי מלגות FAPESP ל-V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1), ועל ידי מלגת Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ל-T.S.N.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922refered to as Amplification Buffer A in working solutions for tyramide-Alexa 488 or tyramide-Alexa 555 signal amplification
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% Bovine Serum Albumin (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
30% hydrogen peroxyde (H2O2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
Acetic anhydrideMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgaroseMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Amplification diluent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EArefered to as Amplification Buffer B in working solution for tyramide-biotin signal amplification
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibodyThermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922refered to as blocking solution B in the tyramide signal development step
Blocking reagent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EArefered to as blocking reagent A in the formulation for TNB buffer
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt's solution (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Deoinized formamideMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Dextran sulfate solution (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 nuclear stainThermo Fisher ScientificH1399n/a
Hydrochloric acid (HCl)Merck (Sigma-Aldrich)320331n/a
Olfactory stimulin/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
ParaformaldehydeMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments)Merck (Roche)11207733910; RRID:AB_514500refered to as peroxidase-conjugated anti-DIG antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold antifade mountantThermo Fisher ScientificP36934refered to as anti-fading mounting medium
RNase-free ultrapure waterThermo Fisher Scientific10977015n/a
Sodium chloride (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Sodium hydroxide (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
SucroseMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TriethanolamineMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Yeast tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape)Agilent5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579refered to as automated electrophoresis system
Mouse: C57BL/6J inbred strainJackson LaboratoriesStock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Micro ColumnsCytiva Biosciences28903408refered to as gel filtration-based purification kit
QIAquick gel extraction kitQiagen28506refered to as mini column-based gel-purification kit
RNeasy MinElute cleanup kitQiagen74204refered to as mini column-based RNA purification kit
TSA Biotin kitAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotides
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vectorPromegaA1360reccommended PCR cloning vector
Other materials
1mL syringesFisher Scientific14-829-10Fn/a
Conical tubes (15 mL and 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Coplin jarsFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Dissecting tools and forcepsRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
Dry bathn/an/an/a
Electrophoresis equipmentFisher Scientific09-528-110Bn/a
Fine point paintbrushesWinsor & Newton10269097n/a
Fluorescence or confocal microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
Heated plateFisher ScientificHP88850200n/a
Humidified chamber (if used at higher temperatures, it will need to be sealed inside a plastic Tupperware container)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Lint-free laboratory KimwipesKimberly-Clark34120refered to as lint-free laboratory tissue paper
MicrocentrifugeEppendorf5401000013n/a
Mouse cagesInnoViveM-BTM, MVX1n/a
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4375786n/a
Pipette p1000, p200, and p20 disposable tipsFisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Plastic histology embedding moldThermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238refered to as highly sensitive fluorometric method
Razor blades or scalpelsFisher Scientific12-640n/a
RNA tapestation or BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System or 2100 Bioanalyzer Instrumentn/a
RNase-free glass or plastic graduated cylinders and beakersFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
StereomicroscopeLeica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus microscope slidesThermo Fisher Scientific12-550-15referred to as positively charged microscope slides
ParafilmBemis CompanyPM999refered to as thermoplastic laboratory film
Water bathThermo Fisher ScientificTSCIR19n/a

References

  1. Stowers, L., Holy, T. E., Meister, M., Dulac, C., Koentges, G. Loss of sex discrimination and male-male aggression in mice deficient for TRP2. Science. 295 (5559), 1493-1500 (2002).
  2. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141 (4), 692-703 (2010).
  4. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annual review of physiology. 71, 115-140 (2009).
  5. Chess, A., et al. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell. 78, 823-834 (1994).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature Reviews Neuroscience. 5, 263-278 (2004).
  7. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  8. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83 (2), 195-206 (1995).
  9. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90 (4), 763-773 (1997).
  10. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-Expression of Putative Pheromone Receptors in the Sensory Neurons of the Vomeronasal Organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  11. Silvotti, L., Moiani, A., Gatti, R., Tirindelli, R. Combinatorial co-expression of pheromone receptors, V2Rs. Journal of Neurochemistry. 103 (5), 1753-1763 (2007).
  12. Ishii, T., Mombaerts, P. Expression of nonclassical class I major histocompatibility genes defines a tripartite organization of the mouse vomeronasal system. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2332-2341 (2008).
  13. Saraiva, L. R., et al. Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: From whole mucosa to single-cell RNA-seq. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Hanchate, N. K., et al. Single-cell transcriptomics reveals receptor transformations during olfactory neurogenesis. Science. 350, 1251-1255 (2015).
  15. Matsunami, H. Functional expression of mammalian odorant receptors. Chemical Senses. 30, Suppl 1 95-96 (2005).
  16. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  17. Xu, L., Li, W., Voleti, V., Zou, D. J., Hillman, E. M. C., Firestein, S. Widespread receptor-driven modulation in peripheral olfactory coding. Science. 368 (6487), (2020).
  18. Pfister, P., et al. Article Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding. Current Biology. , 1-14 (2020).
  19. de March, C. A., Titlow, W. B., Sengoku, T., Breheny, P., Matsunami, H., McClintock, T. S. Modulation of the combinatorial code of odorant receptor response patterns in odorant mixtures. Molecular and Cellular Neuroscience. 104, 103469(2020).
  20. Nakahara, T. S., Carvalho, V. M. A., Souza, M. A. A., Trintinalia, G. Z., Papes, F. Detection of Activated Mouse Neurons with Temporal Resolution via Dual c-Fos Staining. STAR Protocols. 1 (3), 100153(2020).
  21. Nakahara, T. S., et al. Detection of pup odors by non-canonical adult vomeronasal neurons expressing an odorant receptor gene is influenced by sex and parenting status. BMC biology. 14 (1), 12(2016).
  22. Carvalho, V. M. A., et al. Lack of spatial segregation in the representation of pheromones and kairomones in the mouse medial amygdala. Frontiers in Neuroscience. 9, 1-19 (2015).
  23. Carvalho, V. M. A., et al. Representation of Olfactory Information in Organized Active Neural Ensembles in the Hypothalamus. Cell Reports. 32 (8), 108061(2020).
  24. Papes, F., Nakahara, T. S., Camargo, A. P. Behavioral assays in the study of olfaction: a practical guide. Methods in Molecular Biology, v1820: Olfactory receptors. , 289-388 (2018).
  25. Jiang, Y., Gong, N. N., Hu, X. S., Ni, M. J., Pasi, R., Matsunami, H. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors responding to odors in vivo. Nature Neuroscience. 18, 1446-1454 (2015).
  26. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Neuroscience. 18 (10), (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

G

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved