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摘要

该方案将 原位 杂交与免疫荧光相结合，以鉴定小鼠体内化学刺激激活后在嗅觉感觉神经元中表达的嗅觉和犁鼻受体基因。

摘要

动物依靠化学通讯来传递和感知相关的环境信息，从食品质量评估到检测可用的交配伙伴或威胁。在小鼠中，这项任务主要由嗅觉系统及其底层子系统执行，包括主要和辅助嗅觉系统。两者都有外周器官，由表达 G 蛋白偶联受体的感觉神经元填充，这些受体能够结合到达鼻腔的化学线索。尽管这些受体的分子特性已广为人知，但对其同源特异性配体知之甚少。这里描述的方法将嗅觉或犁鼻受体的 原位 杂交检测与磷酸化核糖体蛋白 S6 （pS6） 的免疫检测相结合 - 神经元激活的标志物。该方案旨在识别在暴露于嗅觉器官检测到的纯化或复杂化学刺激的单次事件后激活的神经元。重要的是，该技术允许研究在生物学相关环境中触发的神经元。理想情况下，这种方法应该用于探测嗅觉系统的分子生物学并研究嗅觉行为。

引言

化学信号传导是动物中最广泛的通信形式。在哺乳动物中，化学线索的检测主要通过嗅觉介导，对于寻找食物、定位可能的交配伙伴和避开潜在的捕食者至关重要 1,2,3。小鼠嗅觉系统进一步分为不同的子系统，每个子系统都有自己的解剖学、生理学和分子特性4。其中，主要嗅觉系统 （MOS） 和辅助嗅觉系统 （AOS） 是研究最广泛且特征最明确的。

MOS 主要负责检测到达鼻腔的挥发性化学分子。这是通过嗅觉感觉神经元 （OSN） 完成的，OSN 填充了系统的感觉界面 - 主要嗅觉上皮 （MOE）。每个 OSN 以单基因和单等位基因方式表达数千个嗅觉受体 （OR） 中的一个5。此外，ORs 往往是广义调谐的 6，单个气味剂可能与多个 OR 结合，从而生成气味7 的组合密码。

反过来，AOS 主要负责信息素和凯洛酮的检测。这些配体激活犁鼻器官 （VNO） 中的犁鼻感觉神经 （VSN）。VNO顶端区的VSN表达犁鼻受体1家族（V1Rs）8，而基底区的神经元表达犁鼻受体2家族（V2Rs）9。重要的是，已经表明一些 VSN 共表达不止一种犁鼻受体 10,11,12。

尽管关于 OR 和 VR 的分子特征的所有可用信息，但关于它们的同源配体的知识仍然非常有限。识别负责检测分子或复杂刺激的特定嗅觉神经元对于研究嗅觉、嗅觉驱动行为和生理反应的人来说是一项重要任务。已经尝试了几种策略来使嗅觉受体去孤儿化，包括钙成像7、单细胞 RNA 测序13,14、异源受体表达15 和基于即刻早期基因 （IEG） 的策略16。最近，已经采用了一些技术来评估气味剂在感觉神经元中的调节作用，使用体内钙成像17,18 和荧光蛋白标记的单细胞 RNA 测序策略19。这些技术中的大多数都需要人工设置或在解离的神经元上执行，因此无法同时评估所用气味触发的行为。

此处描述的方案允许通过将检测特定 ORs 或 VR 的核糖探针与磷酸化 S6 核糖体蛋白 （pS6）（神经元激活的代理）的免疫检测相结合，识别在单个气味暴露事件后激活的感觉神经元。这种方法是在生物学相关背景下研究由不同化学信号激活的感觉神经元身份的可靠方法。

研究方案

动物程序根据动物协议 #1883-1 进行，该协议由坎皮纳斯大学（生物研究所机构动物护理和使用委员会 - 动物使用研究伦理委员会）批准，该协议遵循联邦国家动物实验控制委员会 （CONCEA） 制定的指导方针。

1. 材料准备

  1. 在 1x PBS 中制备 1 L 3% H2O2 （v/v）。在 500 mL 超纯水中稀释 100 mL 10× PBS 和 100 mL 30% H2O2 。用超纯水完成体积。使用前立即准备此溶液。
  2. 准备一个加湿室，里面装有用 5× SSC 溶液湿润的无绒实验室湿巾。
  3. 制备杂交洗涤液：5× SSC（55 °C）、2× SSC （55 °C）、0.2× SSC （55 °C） 和 0.1× SSC（55 °C 和室温）。将适当体积的 20× SSC 储备液溶解在不含 RNase 的超纯水中。在每次实验开始前准备新鲜的稀释溶液。
  4. 制备免疫组化封闭溶液：1× PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100。对于 100 mL，在 70 mL 超纯水中稀释 10 mL 10× PBS、10 mL 10% BSA 和 3.33 mL 3% Triton X-100。用超纯水完成体积。在每次实验开始前准备新鲜的稀释溶液。
  5. 准备 PTw 溶液：1× PBS/0.1% Tween-20。对于 100 mL，在 70 mL 超纯水中稀释 1 mL 10% Tween-20 和 10 mL 10× PBS。用超纯水完成体积。在每次实验开始之前，请新鲜制备此溶液。
  6. 制备不含 RNase 的 0.1 M 三乙醇胺溶液。对于 250 mL，在搅拌下用 200 mL 不含 RNase 的超纯水中稀释 3.33 mL 试剂级三乙醇胺（制备此溶液时使用不含 RNase 的玻璃器皿和磁力搅拌器）。用 HCl 将 pH 值调节至 8.0。用不含 RNase 的超纯水完成体积，并避光储存直至使用。在每次实验开始之前，请新鲜制备此溶液。
  7. 在 1× PBS 中制备不含 RNase 的 0.1% H2O2 （v/v）。对于 1 L，在 500 mL 不含 RNase 的超纯水中稀释 100 mL 10× PBS 和 3.3 mL 30% H2O2 。用不含 RNase 的超纯水完成体积。使用前立即准备此溶液。
  8. 制备以下不含 RNase 的溶液：0.2 M HCl;1 M Tris-HCl pH 8.0;10 mg/mL 酵母 tRNA;10% SDS;10× PBS;100× Denhardt 解;20× SSC;50% 硫酸葡聚糖;6 M 盐酸
  9. 制备不含 RNase 的 4% 多聚甲醛固定液。对于 100 mL，将 4 g 多聚甲醛溶解在 80 mL 1× PBS 中。用 10 M NaOH 将 pH 调节至 7.4。用 1× PBS 完成体积。该溶液必须在每次实验开始前新鲜制备。
    谨慎： 多聚甲醛是一种有害物质，吸入可能会造成伤害。在通风橱下制备溶液，并戴上防护手套、口罩和安全护目镜。
  10. 制备不含 RNase 的解剖溶液：30% 蔗糖/0.45 M EDTA，pH 8.0/1× PBS。对于 100 mL，将 30 g 蔗糖溶解在 60 mL 不含 RNase 的 0.5 M EDTA pH 8.0 中。加入 10 mL 的 10× PBS。用不含 RNase 的 0.5 M EDTA（pH 值 8.0）完成体积。
  11. 准备不含 RNase 的玻璃或塑料量筒和烧杯。
  12. 制备不含 RNase 的预杂交和杂交溶液：50% 去离子甲酰胺 （v/v）/600 mM NaCl/200 μg/mL 酵母 tRNA/0.25% SDS （w/v）/10 mM Tris-HCl pH 8.0/1× Denhardt 溶液/1 mM EDTA pH 8.0/10% 葡聚糖硫酸盐 （w/v）。对于量筒中的 10 mL，加入 5 mL 去离子甲酰胺、1.2 mL 5 M NaCl、200 μL 10 mg/mL 酵母 tRNA、250 μL 10% SDS、100 μL 1 M Tris-HCl pH 8.0、200 μL 50× Denhardt 溶液、20 μL 500 mM EDTA pH 8.0 和 2 mL 50% 葡聚糖硫酸盐 （MW 500,000）。用不含 RNase 的超纯水完成体积。在每次实验开始之前，请新鲜制备此溶液。
    注：硫酸葡聚糖非常粘稠。建议额外准备 20% 的杂交/预杂交溶液总体积，以解决移液错误。如果需要，可以从预杂交溶液中省略酵母 tRNA。
  13. 准备热塑性实验室薄膜盖玻片。切割比显微镜载玻片的长度和宽度短 1-2 毫米的矩形热塑性实验室薄膜片。
  14. 准备 TN 缓冲液：100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl。对于 100 mL，在 70 mL 超纯水中稀释 10 mL 1 M Tris-HCl pH 7.5 和 3 mL 5 M NaCl。用超纯水完成体积。在每次实验开始之前，请新鲜制备此溶液。
  15. 准备 TNB 封闭缓冲液：在 TN 缓冲液中加入 0.5% 封闭试剂 A （w/v）。对于 200 mL，将 1 g 封闭试剂 A 溶解在 200 mL TN 缓冲液中（有关封闭试剂 A 的商业来源，请参见 材料表 ）。
  16. 准备 TNT 缓冲液：在 TN 缓冲液中加入 0.05% Tween-20。对于 1 L，在 950 mL TN 缓冲液中稀释 5 mL 10% Tween-20。用 TN 缓冲液缓慢完成体积以避免起泡。在每次实验开始之前，请新鲜制备此溶液。
  17. 制备 Tyramide-Alexa 488 工作溶液：1× 扩增缓冲液 A/0.0015% H2O2/1：100 tyramide-Alexa 488。对于 100 μL，在 98 μL 扩增缓冲液 A 中稀释 1 μL 0.15% H2O2 和 1 μL 酪胺-Alexa 488（参见 材料表 ，了解酪胺-Alexa 488 和扩增缓冲液 A 的商业来源）。使用前立即准备此溶液。
  18. 制备 Tyramide-Alexa 555 工作溶液：1× 扩增缓冲液 A/0.0015% H2O2/1：100 tyramide-Alexa 555。对于 100 μL，在 98 μL 扩增缓冲液 A 中稀释 1 μL 0.15% H2O2 和 1 μL 酪胺-Alexa 555（参见 材料表 ，了解酪胺-Alexa 555 和扩增缓冲液 A 的商业来源）。使用前立即准备此溶液。
  19. 制备酪胺-生物素工作溶液：1× 扩增缓冲液 B/0.0015% H2O2/1：50 酪胺-生物素。对于 100 μL，在 97 μL 扩增缓冲液 B 中稀释 1 μL 0.15% H2O2 和 2 μL 酪胺-生物素（参见酪胺-生物素和扩增缓冲液 B 的商业来源材料表）。使用前立即准备此溶液。
  20. 将玻璃器皿在 200 °C 下烘烤至少 4 小时。用 3% H2O2 处理非一次性塑料器皿（包括载玻片架、Coplin 罐和注射器）15-30 分钟，然后在不含 RNase 的水中彻底清洗。用 3% H2O2 处理不锈钢金属器械，如解剖工具、镊子和低温恒温器标本架 15 分钟，然后在不含 RNase 的水中彻底清洗。使用 RNase 清洁液清洁工作台表面、加热板和干块。

2. 核糖探针合成

注：以下通过体外转录合成 1 kb 地高辛标记的 cRNA 探针用于原位杂交的程序基于先前发表的方案 20,21,22,23。

  1. 使用适当的寡核苷酸引物对从目标基因（例如嗅觉受体基因）扩增 1 kb DNA 片段。选择可扩增待检测成熟 mRNA 中存在的区域（例如，基因的编码序列）的引物对。材料表中提供了针对不同嗅觉受体的引物选择。有关检测其他犁鼻嗅觉受体的探针的详细信息，请查看以前的出版物16,21。
  2. 在 0.8% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产物，并去除所需的 1 kb 条带。
  3. 根据制造商的方案，使用合适的基于迷你柱的凝胶纯化试剂盒纯化 DNA 片段。
  4. 定量纯化的 DNA 片段，并根据制造商的方案将其克隆到合适的 PCR 克隆载体中。建议使用含有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶启动子的克隆载体，这些启动子位于克隆扩增子的两侧。
  5. 根据制造商的方案，通过化学转化或电穿孔将重组质粒转化为感受态无重组细菌。
  6. 将分离的转化细菌菌落接种到丰富的培养基中，并根据制造商的方案通过 DNA 小量制备分离质粒。
  7. 根据制造商的方案，使用合适的限制性内切酶和/或 Sanger 测序进行限制性酶切分析，以检查插入的 DNA 片段的身份和方向。
  8. 进行限制性酶切，使用适当的限制性内切酶将 10 μg 质粒线性化。为了在 体外 转录后产生反义核糖探针，使用限制性内切酶消化插入片段末端的质粒 DNA，该插入片段与位于基因编码序列下游的 RNA 聚合酶启动子相对。为了在 体外 转录后产生正义核糖探针，使用限制性内切酶消化插入片段末端的质粒 DNA，该插入片段与位于基因编码序列上游的 RNA 聚合酶启动子相对。
  9. 在 0.8% 琼脂糖凝胶上运行等分试样的质粒线性化反应产物，以确认消化的完全性。确认完全线性化后，根据制造商的方案，使用基于柱的 PCR 纯化试剂盒纯化反应的剩余部分。
  10. 使用 1-2 μg 线性化质粒作为模板、适当的酶（例如，T7 或 SP6 RNA 聚合酶）和适当的地高辛 （DIG） 标记试剂盒，通过 体外 转录合成地高辛标记的 cRNA 探针。
  11. 通过在 37 °C 下用 DNase I 消化 30 分钟，从反应中去除 DNA 模板。
  12. 使用基于迷你柱的 RNA 纯化试剂盒或基于凝胶过滤的纯化试剂盒纯化 cRNA 探针。在 50 μL 不含 RNase 的水中洗脱所得探针。
  13. 定量所得的核糖探针，最好使用荧光法。通常，预期产量高于 100 ng/μL。
  14. 在自动电泳系统或不含 RNase 的 0.8% 琼脂糖凝胶上运行核糖探针，以检查探针质量和降解。
  15. 将合成的探针储存在 -80 °C 直至需要。

3. 小鼠暴露于嗅觉刺激

  1. 在暴露前，将每只动物单独饲养在干净的笼子中至少 24 小时。在暴露前至少 2 小时去除食物网格。本研究中使用的所有动物均为 8-12 周龄雄性 C57BL/6 小鼠 （平均体重： 20 g）。
  2. 准备适当的嗅觉刺激。不同的刺激可用于激活 MOE（主要嗅觉上皮）或 VNO（犁鼻器官）中的嗅觉神经元。有关嗅觉刺激的完整列表，请查阅其他出版物3、16、22、23、24。液体刺激物，如化学溶液、尿液或重组蛋白溶液，可以沉积在医用纱布或棉球上。
  3. 将嗅觉刺入笼子中，让动物不受干扰 1 小时。
  4. 对小鼠受试者实施安乐死，并使用无 RNase 的解剖工具快速解剖 MOE 或 VNO。

4. 组织解剖和冷冻

  1. 使用解剖溶液在立体显微镜下解剖 MOE 或 VNO。
    1. 对于 VNO，去除较厚的鼻中隔骨，留下较软的软骨壳围绕器官。
  2. 准备用于冷冻切片的标本。
    1. 在一张印迹纸上吸干标本，然后将其放入含有包埋培养基的组织学塑料模具中。
    2. 对于 VNO，垂直排列每个器官，并在 1 mL 注射器的帮助下将其拉到塑料模具的底部（图 1A）。
    3. 对于 MOE，将其放在塑料模具的底部，使筛板朝下。
    4. 去除标本周围多余的气泡，因为这些气泡会干扰切片。
    5. 将标本冷冻在干冰上。
    6. 将标本块储存在 -80 °C。
      注意：冷冻标本在切片前可存放数月。
  3. 进行冷冻切片。
    1. 使用前至少 4 小时打开低温恒温器并将温度设置为 -23 °C。
    2. 从组织学塑料模具中取出冷冻块，并用剃须刀片修剪。
    3. 在标本周围留出 5 毫米，因为这使得切片处理更容易（图 1B）。
    4. 使用包埋介质将模块连接到低温恒温器的样品架上。
    5. 将 16 μm 切片收集到带正电荷的显微镜载玻片上。
    6. 将载玻片储存在 -80 °C。
      注：载玻片可在 原位 杂交前在 -80 °C 下储存数月。

5. 分步 原位 杂交方案

  1. 使用吹风机将载玻片擦干 10 分钟。使用温射流解冻载玻片，然后切换到室温射流，直到包埋介质不透明。
  2. 每张载玻片加入 500 μL 不含 RNase 的 4% 多聚甲醛固定液，并在 23-26 °C 下孵育 15 分钟以固定组织学切片。
  3. 在不含 RNase 的 1× PBS 中洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。
  4. 每张玻片添加 500 μL 不含 RNase 的 0.2 M HCl，并在 23-26 °C 下孵育 10 分钟。
  5. 在不含 RNase 的 1× PBS 中洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。
  6. 每张载玻片加入 500 μL 不含 RNase 的 0.1% H2O2/1× PBS，并在 23-26 °C 下孵育 30 分钟。 在黑暗中执行此步骤，以防止光诱导过氧化氢降解。
  7. 在不含 RNase 的 1× PBS 中洗涤玻片两次，每次 5 分钟。
  8. 将玻片转移到通风橱中，将玻片转移到装有 250 mL 不含 RNase 的三乙醇胺 0.1 M pH 8.0 和磁力搅拌棒的罐子中，进行乙酰化。在不断搅拌下加入 625 μL 乙酐。降低搅拌速度，再逐滴加入 625 μL 到载玻片上，然后关闭搅拌并孵育 10 分钟。
  9. 在不含 RNase 的 1× PBS 中洗涤玻片两次，每次 5 分钟。
  10. 在 60 °C 下在不含 RNase 的 1× PBS 中洗涤玻片一次，持续 5 分钟。
  11. 通过一次从 1× PBS 中取出一张载玻片并使用无绒实验室薄纸吸干每张载玻片来进行预杂交。将 400 μL 预杂交溶液吸取到每张载玻片上，并将其放入水浴或加热烘箱中预热至 60 °C 的加湿室中。在 60 °C 孵育 1 小时。
  12. 将足够的杂交溶液加热至 60 °C，在微量离心管中每个载玻片分装 200 μL，然后将它们加热至 85 °C 10 分钟。
  13. 将适当的 cRNA 探针添加到杂交溶液管中（每个探针 1 μg/mL），并在 85 °C 下变性 5 分钟。
  14. 对于杂交，从加湿室中一次取一张载玻片，吸干并将其放在 60 °C 加热板上。加入 200 μL 含核糖探针的杂交溶液，并用玻璃盖玻片盖住载玻片。在 60 °C 的加湿室中孵育 12-16 小时。
    注意：预杂交后不要让玻片冷却。必须根据经验确定每个探针的杂交温度。建议以 60 摄氏度为起点，因为它通常适用于 1 kb 探针。
  15. 在单独的罐子中将 SSC 洗涤溶液加热至 55 °C，并将其置于适当温度的水浴中。
  16. 杂交完成后，使用含有 55 °C 5× SSC 溶液的浴从每个载玻片上取下盖玻片。 将每张玻片水平放在温热的 SSC 溶液中。当盖玻片脱落时，倾斜载玻片，让盖玻片落到底部。
  17. 在 55 °C 下用 2× SSC 在载玻片罐中洗涤 30 分钟。
  18. 在 55 °C 下用 0.2× SSC 在载玻片罐中洗涤 20 分钟。
  19. 在 55 °C 下用 0.1× SSC 在载玻片罐中洗涤 20 分钟。
  20. 在 23-26 °C 下转移至 0.1× SSC，并在载玻片罐中孵育 3 分钟。
  21. 在载玻片罐中用 PTw 洗涤 10 分钟。
  22. 在 TN 缓冲液中洗涤两次，每次 5 分钟，在载玻片罐中。
  23. 将 600 μL TNB 封闭缓冲液吸到每张载玻片上，并在 23-26 °C 下孵育 3 小时。
  24. 将 500 μL 一抗溶液（过氧化物酶偶联的抗 DIG 抗体在 TNB 溶液中以 1：400 稀释）移液到每张载玻片上。小心地将一块热塑性实验室薄膜覆盖在每个载玻片上，并在 4 °C 下孵育 12-16 小时。
  25. 用 TNT 缓冲液洗涤玻片 6 次，每次 5 分钟，在玻片罐中轻轻搅拌。
  26. 将 100 μL 酪胺-生物素工作溶液吸取到每张载玻片上。用热塑性实验室薄膜盖玻片盖上，并在 23-26 °C 下孵育 12 分钟。
    注意：以交错方式执行此孵育步骤，每批 2 或 3 张玻片，以便更好地控制孵育时间。酪胺孵育的持续时间可能需要优化，具体取决于 cRNA 探针的灵敏度和浓度。
  27. 用 TNT 缓冲液洗涤玻片 6 次，每次 5 分钟，在玻片罐中轻轻搅拌。
  28. 将 200 μL 含有过氧化物酶偶联链霉亲和素（SA-HRP，在 TNB 缓冲液中以 1：100 稀释）的溶液吸到每个载玻片上，并用热塑性实验室薄膜盖玻片盖住。在 23-26 °C 孵育 1 小时。
  29. 用 TNT 缓冲液洗涤玻片 6 次，每次 5 分钟，在玻片罐中轻轻搅拌。
  30. 将 100 μL 酪胺-Alexa 488 工作溶液吸到每张载玻片上，用热塑性实验室薄膜盖玻片覆盖，并在 23-26 °C 下在黑暗中孵育 12 分钟。
  31. 用 TNT 缓冲液洗涤玻片 6 次，每次 5 分钟，在玻片罐中轻轻搅拌。
  32. 在载玻片罐中用 3% H2O2/1× PBS 孵育 1 小时，以灭活前面步骤中的过氧化物酶。
  33. 用 TNT 缓冲液洗涤玻片 6 次，每次 5 分钟，在玻片罐中轻轻搅拌。

6. pS6 免疫染色

  1. 将 500 μL 4% 多聚甲醛/1× PBS 溶液移液到每张载玻片上，并在 23-26 °C 下孵育 15 分钟以固定切片。
  2. 将 500 μL 1× PBS/0.1% Triton X-100 移液到每张载玻片上，孵育 5 分钟以透化切片。
  3. 在载玻片罐中用 1× PBS 洗涤两次。
  4. 每段市售酪胺信号放大阻断液 B（材料表）吸取 2-3 滴，并在 23-26 °C 下孵育 1 小时。
  5. 将 400 μL 免疫组织化学封闭溶液吸取到每张载玻片上，并在 23-26 °C 下孵育 30 分钟以封闭切片。
  6. 将 200 μL 兔抗 pS6 一抗溶液（在免疫组织化学封闭溶液中以 1：200 稀释;终浓度：1 μg/mL）移液到每个载玻片上，用热塑性实验室薄膜盖玻片覆盖，并在 4 °C 下孵育 12-16 小时。
  7. 用 1× PBS/0.1% Triton X-100 在载玻片罐中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  8. 每张载玻片吸取 2-3 滴市售过氧化物酶偶联的抗兔二抗溶液（材料表），并在 23-26 °C 下孵育 1.5 小时。
  9. 用 1× PBS/0.1% Triton X-100 在载玻片罐中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  10. 将载玻片吸干并吸取 100 至 200 μL 酪胺-Alexa 555 工作溶液到每张载玻片上，覆盖一块热塑性实验室薄膜盖玻片，并在黑暗中孵育 7 分钟。
  11. 在载玻片罐中用 1× PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
  12. 将 500 μL 稀释的核染色剂（在 1× PBS 中）移液到每张载玻片上，并在 23-26 °C 下孵育 30 分钟。
  13. 在载玻片罐中用 1× PBS 在 23-26 °C 下洗涤两次，每次 5 分钟。
  14. 使用防褪色封固剂封片剂，让封片剂在黑暗中固化 24 小时。
  15. 将玻片储存在适当的温度下直至成像，以避免荧光褪色。

7. 显微镜成像

  1. 使用落射荧光或共聚焦显微镜对载玻片进行成像，该显微镜配备适合所用荧光团的滤光片。

结果

目前的方案旨在获得显微镜图像，其中实验者的目标基因和神经元活性标记物 pS6 被荧光标记。所描述的方法涉及酪胺信号放大，它产生清晰而强大的标记，几乎没有背景。pS6 免疫染色表现为细胞质荧光信号，通常充满整个神经元细胞体，而嗅觉受体神经元的 原位 杂交信号表现为细胞质染色。pS6 是嗅觉神经元激活的瞬时标志物，因此相关的免疫染色信号在感觉器...

讨论

这里描述的方案通过将 OR 或 VR 受体的 原位 检测与 pS6（神经元活动的间接标志物）的免疫检测相结合，可靠地识别了嗅觉系统中化学线索激活的感觉神经元。实验者必须格外小心，以保持组织学完整性，并在无 RNase 条件下杂交前执行所有步骤。否则可能会导致 mRNA 降解并损害核糖探针标记。解剖嗅觉器官时必须小心，因为未固定的组织特别脆弱，很容易损坏。

披露声明

作者声明他们没有任何形式的竞争利益。

致谢

我们感谢 GAG Pereira 和 JA Yunes 提供的资源，感谢 APF Ferreira 和 WO Bragança 提供的管理和技术帮助，以及生命科学核心设施 （LaCTAD-UNICAMP） 工作人员在共聚焦显微镜方面的帮助。这项工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP;资助号 2009/00473-0 和 2015/50371-0 到 FP）、PRP/UNICAMP（资助号 2969/16、725/15、348/14 和 315/12 到 FP）、V.M.A.C. 的 FAPESP 奖学金（2014/25594-3、2012/21786-0、2012/01689-0）、TSN（2012/04026-1）和 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior （CAPES） 奖学金到 TSN 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10x phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x amplification diluent (reaction buffer from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922refered to as Amplification Buffer A in working solutions for tyramide-Alexa 488 or tyramide-Alexa 555 signal amplification
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% Bovine Serum Albumin (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
30% hydrogen peroxyde (H2O2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
Acetic anhydrideMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgaroseMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Amplification diluent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EArefered to as Amplification Buffer B in working solution for tyramide-biotin signal amplification
Anti-pS6 (Ser 244/247) rabbit polyclonal antibodyThermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
Blocking buffer 1x (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923 or B40922refered to as blocking solution B in the tyramide signal development step
Blocking reagent (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EArefered to as blocking reagent A in the formulation for TNB buffer
DAPI nuclear stainThermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt's solution (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Deoinized formamideMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Dextran sulfate solution (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 nuclear stainThermo Fisher ScientificH1399n/a
Hydrochloric acid (HCl)Merck (Sigma-Aldrich)320331n/a
Olfactory stimulin/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
ParaformaldehydeMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody (Fab fragments)Merck (Roche)11207733910; RRID:AB_514500refered to as peroxidase-conjugated anti-DIG antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit secondary antibody (polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold antifade mountantThermo Fisher ScientificP36934refered to as anti-fading mounting medium
RNase-free ultrapure waterThermo Fisher Scientific10977015n/a
Sodium chloride (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Sodium hydroxide (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
SucroseMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TriethanolamineMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma hydrochloride (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Yeast tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagents (buffer, ladder, and tape)Agilent5067-5580, 5067-5581, and 5067-5579refered to as automated electrophoresis system
Mouse: C57BL/6J inbred strainJackson LaboratoriesStock No: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Micro ColumnsCytiva Biosciences28903408refered to as gel filtration-based purification kit
QIAquick gel extraction kitQiagen28506refered to as mini column-based gel-purification kit
RNeasy MinElute cleanup kitQiagen74204refered to as mini column-based RNA purification kit
TSA Biotin kitAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotides
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy vectorPromegaA1360reccommended PCR cloning vector
Other materials
1mL syringesFisher Scientific14-829-10Fn/a
Conical tubes (15 mL and 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Coplin jarsFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Dissecting tools and forcepsRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
Dry bathn/an/an/a
Electrophoresis equipmentFisher Scientific09-528-110Bn/a
Fine point paintbrushesWinsor & Newton10269097n/a
Fluorescence or confocal microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
Heated plateFisher ScientificHP88850200n/a
Humidified chamber (if used at higher temperatures, it will need to be sealed inside a plastic Tupperware container)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Lint-free laboratory KimwipesKimberly-Clark34120refered to as lint-free laboratory tissue paper
MicrocentrifugeEppendorf5401000013n/a
Mouse cagesInnoViveM-BTM, MVX1n/a
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4375786n/a
Pipette p1000, p200, and p20 disposable tipsFisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Plastic histology embedding moldThermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238refered to as highly sensitive fluorometric method
Razor blades or scalpelsFisher Scientific12-640n/a
RNA tapestation or BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System or 2100 Bioanalyzer Instrumentn/a
RNase-free glass or plastic graduated cylinders and beakersFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
StereomicroscopeLeica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus microscope slidesThermo Fisher Scientific12-550-15referred to as positively charged microscope slides
ParafilmBemis CompanyPM999refered to as thermoplastic laboratory film
Water bathThermo Fisher ScientificTSCIR19n/a

参考文献

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