دراسة آثار درجة الحرارة على نواة ونمو الجسيمات النانوية عن طريق المجهر الإلكتروني انتقال الخلايا السائلة

Summary

إن التحكم في درجة الحرارة أثناء تجارب المجهر الإلكتروني في المرحلة السائلة يفتح آفاقا جديدة لدراسة ديناميكية الجسيمات النانوية في البيئات السائلة التي تحاكي تكوينها أو وسائط التطبيق. باستخدام الخلايا السائلة التدفئة وضعت مؤخرا، لاحظنا مباشرة تأثير درجة الحرارة على عمليات النوى والنمو من الجسيمات النانوية الذهب في الماء.

Abstract

التحكم في درجة الحرارة هو تطور حديث يوفر درجة إضافية من الحرية لدراسة الكيمياء النانوية عن طريق المجهر الإلكتروني انتقال الخلايا السائلة. في هذه الورقة، ونحن نصف كيفية إعداد تجربة التدفئة في الموقع لدراسة تأثير درجة الحرارة على تشكيل الجسيمات النانوية الذهب مدفوعة بالتحلل الإشعاعي في الماء. بروتوكول التجربة بسيط إلى حد ما يتضمن خلية سائلة خاصة مع قدرات تسخين موحدة تصل إلى 100 درجة مئوية ، وحامل TEM ذو خلية سائلة مع قدرات تدفق وواجهة متكاملة للتحكم في درجة الحرارة. نظهر أن آليات النوى والنمو للجسيمات النانوية الذهبية تتأثر بشكل كبير بدرجة الحرارة في الخلايا السائلة. باستخدام التصوير STEM و nanodiffraction ، يتم الكشف عن تطور الكثافة والحجم والشكل والهيكل الذري للجسيمات النانوية المتنامية في الوقت الحقيقي. يتم استغلال خوارزميات معالجة الصور الآلية لاستخراج بيانات كمية مفيدة من تسلسل الفيديو ، مثل معدلات النوى والنمو للجسيمات النانوية. ويوفر هذا النهج مدخلات جديدة لفهم العمليات الفيزيائية الكيميائية المعقدة التي تلعب دورا أثناء تركيب المواد النانوية في المرحلة السائلة.

Introduction

الجسيمات النانوية المعدنية (NPs) لها خصائص فيزيائية كيميائية واعدة يمكن استخدامها في مجالات مختلفة مثل الاستشعار البصري¹أو الطب² أو الطاقة³. التوليف الرطب الكيميائي هو وسيلة متعددة جدا لتصنيع NPs المعدنية مع حجم وشكل محددة جيدا. على مدى العقود الماضية، وقد وضعت العديد من الاستراتيجيات للسيطرة على توليف NPs: النمو بوساطة البذور^4،طريقة حجب الوجه^5،توليف حركيا تسيطر عليها^6،النقش الانتقائي⁷ أو التوليف درجة الحرارة التي تسيطر عليها⁸. ومع ذلك ، في حين أن التفاعلات الكيميائية التي تقود التوليف بسيطة إلى حد ما ، فإن آليات النوى والنمو ليست كذلك ، لأن العديد من المعلمات تلعب دورا في عمليات التكوين وتأثيرها الفردي يصعب استردادها من لقطات خارج الموقع للمواد النانوية الناتجة المستخرجة من وسيط تشكيلها في نقاط زمنية معينة من التوليف. لفهم عمليات النوى والنمو وتحديد طرق للسيطرة عليها، يجب علينا استخدام أدوات في الموقع تسمح بمراقبتها في الوقت الحقيقي في بيئة سائلة يتم التحكم فيها بدقة.

في هذا الصدد، السائل الخلية انتقال المجهر الإلكترون (LCTEM) كان وسيلة قوية جدا لتسليط الضوء على تركيب الجسيمات النانوية المعدنية^{9،10،11،12،13}. من خلال تصوير ديناميات الهياكل النانوية الفردية مباشرة في وسائل الإعلام تشكيل السائل ، وقد وفرت هذه التقنية فهم أعمق للنوى وآليات النمو ، لا سيما دور العيوب البلورية، مورفولوجيا البذور و ligands العضوية التي تسمح قيادة النمو الاتجاهي أو عمليات النقش والحصول على المواد النانوية مع أشكال محددة (nanorods، نانوستارز، نانوبلاتس، nanoshells)^{10،11،12،13،14،15،16،17،18،19}. عندما يتفاعل شعاع الإلكترون في TEM مع السوائل ، تنتج عمليات التحلل الإشعاعي أنواعا قوية للحد من الأنواع وتأكسدها تعدل كيمياء الحل في المنطقة المشععة ويمكن استخدامها لدفع عمليات النمو أو النقش. ومن المثير للاهتمام، ومن المعروف أن تركيز المنتجات التحليلية الإشعاعية لزيادة مع معدل جرعة الإلكترون، وهي المعلمة التي يمكن ضبطها بدقة في المجهر الإلكتروني²⁰. لذلك، تم استغلال هذا الاعتماد على معدل الجرعة من التحلل الإشعاعي للسيطرة على سرعة التفاعل والكشف عن الآثار الحركية على عمليات التكوين ومورفولوجيا النهائي للهياكل النانوية^11،15،20.

على الرغم من أن درجة الحرارة هي معلمة حاسمة في تخليق المواد النانوية ، إلا أن آثارها لم يتم التحقيق فيها بعناية من قبل LCTEM ، لأن الخلايا السائلة التجارية مع التحكم في درجة الحرارة الموثوق بها لم يتم تطويرها إلا مؤخرا. ومع ذلك، فإن مثل هذه الدراسات في الموقع لا غنى عنها لكشف الحركية المعقدة والآثار الدينامية الحرارية الناجمة عن التغيرات في درجة الحرارة. في الواقع ، من ناحية زيادة درجة الحرارة له آثار جذرية على عمليات الأوجه أثناء النمو ، ويسرع الانتشار الذري والجزيئي في السائل ويعدل معدلات التفاعل. من ناحية أخرى ، فإن الرسم التخطيطي لمرحلة النانو للهياكل النانوية حساس جدا لدرجة الحرارة. في هذه المقالة، ونحن استغلال الخلايا السائلة التدفئة وضعت مؤخرا لمتابعة النمو الإشعاعي للجسيمات النانوية الذهب في الماء مع التحكم في درجة الحرارة بين درجة حرارة الغرفة و 100 درجة مئوية. هذه المنهجية التي تجمع بين التصوير STEM والحيود في بيئة تقترب أكثر فأكثر من ظروف التوليف الحقيقية يقلل من الفجوة بين الملاحظات في الموقع TEM وsynses على نطاق مقاعد البدلاء.

Protocol

1. محاذاة المجهر الإلكتروني انتقال للتصوير STEM HAADF

1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لمحاذاة المجهر.
2. استخدم عينة مجففة تقليدية لمحاذاة المجهر. لا تستخدم عينة سائلة.
3. لتقليل سرعة النمو، قلل من معدل جرعة الإلكترون (راجع قسم المناقشة) مما يعني استخدام فتحة مكثف صغيرة وحجم بقعة صغير لتقليل تيار الحزمة.

2. التعامل مع رقاقة الإلكترونية

ملاحظة: أصحاب السائل التجاري تناسب على TEM تقريبا جميع ولكن استخدام حامل الذي هو تصميم خصيصا لماركة المجهر وقطعة القطب. تتكون الخلية السائلة من رقاقتي سيليكون تعتمدان على MEMS تسمى رقائق E، وكلاهما ركائز السيليكون مع نافذة 500 × 50 ميكرومتر مغطاة بشريحة نيتريد السيليكون غير المتبلور (SiN) سميكة 50 نانومتر شفافة الإلكترون(الشكل 1A). هذه الرقائق الإلكترونية اثنين لها أحجام مختلفة. الصغيرة هي 2 × 2 ملم مع الفواصل الذهبية التي تحدد المسافة بين اثنين من رقائق E (150 نانومتر هنا) وسماكة السائل. الكبير هو 4 × 6 ملم ولها مقاومة جزءا لا يتجزأ من داخل ركيزة السيليكون التي تسمح للتدفئة موحدة للعينة السائلة(الشكل 1B). بسبب الطريقة التي يتم تصنيعها في غرف نظيفة، ورقائق E لها جانبين مختلفين: واحد حيث النافذة تبدو صغيرة (هنا بعد يسمى الجانب الأمامي) والآخر حيث النافذة كبيرة مع شكل بالوعة (هنا بعد دعا الجانب الخلفي).

1. عند التعامل مع رقائق E، لا تلمس النافذة مع ملاقط وقبضة رقائق من الجانبين. لتجنب خدش سطح ركيزة السيليكون استخدم ملاقط ذات رؤوس كربونية.
2. إذا وضع رقاقة E على سطح، تأكد من أن الجانب الخلفي على اتصال مع السطح لأن الفيلم SiN هشة ويتم إيداعه على الجانب الأمامي.

3. تنظيف حامل الخلية السائلة (قبل التجربة)

1. قم بإزالة الغطاء الذي يغطي طرف الحامل. إزالة الخلايا السائلة وهمية باستخدام ملاقط. إزالة طوقا المستخدم مع الخلايا السائلة وهمية.
   ملاحظة: الخلايا السائلة وهمية هي خلايا سائلة دون نافذة SiN والسيليكون فقط. وهي تستخدم لتخزين حامل الخلية السائلة في مضخة فراغ. إيلاء الاهتمام لحالة مسامير النحاس لأنها تنهار بسهولة مع مرور الوقت. خاصة، إذا تضررت رؤوس المسمار، يجب تغيير مسامير. وإلا، قد يكون من الصعب فكها بعد التجربة، كما أن الحطام الصغير قد يعطل تحميل العينات.
2. حقن يدويا 2 مل من الماء المقطر داخل حامل باستخدام المحاقن وأنابيب PEEK الخارجية للاتصال الجزء الخلفي من حامل.
   ملاحظة: هناك 3 أنفاق microfluidic داخل حامل. يجب تنظيف الثلاثة بالماء. انتبه إلى المياه التي تخرج من أمام الحامل: إذا كان الماء ملونا بسبب تجربة سابقة ، استمر في وضع الماء داخل الحامل حتى لا يتم تلوين السائل.
3. إذا حقن محلول في الخلية السائلة أثناء التجربة (1 mM من HAuCl₄ في الماء في حالتنا)، ملء أنابيب حامل العينة مع هذا الحل.
4. جفف طرف حامل الخلية السائلة باستخدام مسدس هوائي.

4. إعداد الخلية السائلة (رقائق E)

1. تنظيف الخلايا السائلة.
   1. ملء طبق بيتري الزجاج مع الأسيتون.
   2. ملء طبق بيتري الزجاج مع الميثانول.
      تنبيه: نظرا لسمية الميثانول ، يجب وضع طبق بيتري مع الميثانول تحت غطاء الدخان. وينبغي التعامل مع الميثانول مع معدات واقية كافية (قفازات).
   3. ضعي رقاقة صغيرة وكبيرة في طبق بيتري مع الأسيتون وانتظري لمدة دقيقتين.
      ملاحظة: يتم المغلفة الرقائق الإلكترونية مع طبقة واقية التي تحتاج إلى إزالتها قبل التجربة. سوف الأسيتون إزالة والتنظيف الضوئي رقائق E من الحطام. لتعزيز التنظيف، يمكن أن يكون المحلول مهتاجا بلطف.
   4. ضعي كلا الرقائق الإلكترونية في طبق بيتري مع الميثانول وانتظري لمدة دقيقتين. الميثانول سينظف الرقائق الإلكترونية من الأسيتون وبقية الحطام.
      تنبيه: يجب نقل الرقائق الإلكترونية بين الأسيتون والميثانول في أسرع وقت ممكن من أجل عدم السماح للرقائق الإلكترونية بالجفاف في الهواء.
   5. جفف الخلايا السائلة باستخدام مسدس هوائي. عقد E-رقاقة باستخدام ملاقط أثناء استخدام مسدس الهواء. كن حذرا لعدم الضغط كثيرا على الزناد مسدس الهواء وإلا فإن E-رقاقة يمكن أن تسقط من ملاقط. إذا تسربوا، إعادة تشغيل التنظيف مع الأسيتون والميثانول.
   6. تحقق من سلامة نافذة نيتريد السيليكون باستخدام مكبر مناظير أو مجهر بصري(الشكل 2).
      ملاحظة: تأكد من أن الإطارات من كل من رقائق E نظيفة ولا مكسورة. إذا كانت رقائق E لا تبدو نظيفة، في محاولة لوضعها مرة أخرى في الأسيتون والميثانول مرة أخرى. إذا كان لا يزال التراب على النافذة أو إذا تم كسر الإطار، يجب تغيير رقائق E مع أخرى جديدة.
   7. البلازما تنظيف رقائق E مع خليط من غاز الأرجون والأوكسجين لمدة 2 دقيقة. البلازما تنظيف رقائق E يسمح لهم أن تكون هيدروفيليك. وفيما يلي تفاصيل تنظيف البلازما إعداد: تدفق غاز الأرجون = 35 sccm، تدفق غاز الأكسجين = 11.5 sccm، مهلة تدفق الغاز = 20 s، الهدف RF إلى الأمام = 50 واط، إلى الأمام نطاق RF = 5 W، الحد الأقصى ينعكس RF = 5 W.
2. تحميل الخلايا السائلة في حامل TEM (الشكل 3).
   1. تحميل طوقا O-حلقات داخل حامل الخلية السائلة (الشكل 3B). تحقق من أن طوقا المستخدم نظيف. إذا لم يكن كذلك، وتنظيفه بسرعة مع الماء المقطر. قم بتجفيفه باستخدام ورقة تصفية نظيفة. لإزالة الحطام والألياف على طوقا، اضغط عليه بين ورقتين من البارافيلم عدة مرات.
   2. وضع صغيرة E-رقاقة داخل حامل الخلية السائلة (الشكل 3C). للحد من الانحناء من أفلام SiN نحو فراغ المجهر، ضع نوافذ الخلية السائلة في تكوين عبرت. لذلك، يجب أن تكون نافذة الشريحة E الصغيرة موازية لطول الحامل والوجه الأمامي لأعلى. تأكد من أن الشريحة الإلكترونية الصغيرة يتم إدخالها بشكل جيد داخل طوقا.
   3. إعداد العينة السائلة (هنا، 1 mM من HAuCl₄ في الماء).
   4. إسقاط ≈2 ميكرولتر من العينة السائلة على رقاقة E الصغيرة باستخدام micropipette (الشكل 3D). إذا تم تنظيف الشريحة الإلكترونية الصغيرة بشكل صحيح البلازما، فإن عينة السائل المائي تنتشر بالتساوي عبر سطح الشريحة.
   5. قم بإزالة السائل الإضافي بورق فلتر. مع قطعة حادة من ورق التصفية، والحد من سمك طبقة السائل على رقاقة E الصغيرة حتى يشكل قبة مسطحة.
   6. وضع كبير E-رقاقة داخل حامل الخلية السائلة (الشكل 3E). ضع الشريحة E الكبيرة على الشريحة الصغيرة مع وجهها الأمامي لأسفل (يجب أن تواجه الجوانب الأمامية للرقائق اثنين بعضها البعض). يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية على الشريحة الإلكترونية الكبيرة على اتصال مع لوحة القطب على الحامل.
   7. مرر الغطاء مرة أخرى على حامل الخلية السائلة. تشديد تدريجيا كل المسمار(الشكل 3F).
   8. جفف السائل النهائي الذي يخرج من الرقائق الإلكترونية باستخدام ورق فلتر صغير. تحقق من عدم وجود سائل يخرج على جانبي الخلايا السائلة عن طريق تدوير حامل الخلية السائلة حول محورها.
3. اختبار فراغ ختم الخلية السائلة في محطة ضخ. إذا كان مستوى فراغ المضخة تصل إلى 5 × 10^-2 السلطة الفلسطينية ثم مواصلة البروتوكول. إذا لم يكن كذلك، تحقق من سلامة الإطار (هو الأكثر احتمالا كسر) وبدء البروتوكول من البداية مع مجموعة جديدة من رقائق E.
4. تحقق للمرة الأخيرة من سلامة نافذة نيتريد السيليكون باستخدام مكبر مناظير أو مجهر بصري. في بعض الأحيان، سوف تكون الخلية السائلة قادرة على الحفاظ على فراغ محطة الضخ حتى لو تم كسر النافذة. وذلك لأنه عندما ينكسر النافذة وينسكب السائل ، فإنه يمكن أن تشكل مجاميع الملح على الجزء المكسور من النافذة وبالتالي تغطي الحفرة. إذا حدث ذلك، قم بإعداد مجموعة جديدة من الرقائق الإلكترونية.
5. تحميل حامل الخلية السائلة في TEM والتحقق من مستوى الفراغ. حتى لو حافظت الخلية السائلة على فراغ محطة الضخ ولم تكن هناك مشكلة مرئية في النافذة ، فإن التسرب الدقيق للخلية السائلة يمكن أن يمنع الوصول إلى مستوى الفراغ المطلوب لتشغيل TEM. إذا لم يتمكن المجهر من الوصول إلى مستوى الفراغ المطلوب للعمل (2-5 × 10^-5 باسكال)، قم بإزالة حامل العينة وإعداد مجموعة جديدة من الرقائق الإلكترونية.

5. استخدام حامل السائل في وضع التدفق

1. ملء 2 المحاقن مع بضع ملليلترات من الحل ليتم حقنها (1 mM من HAuCl₄ في الماء في حالتنا).
2. قم بتوصيل أنبوبين خارجيين من PEEK بالمحاقن. ضع الحقنتين على مضخات الحقن. أدخل أنابيب PEEK الخارجية في مدخلين لحامل الخلية السائلة. أدخل أنبوب PEEK خارجي إضافي لإخراج حامل الخلية السائلة.
3. حقن الحل مع معدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة في كل مدخل.

6. تسخين البيئة السائلة

1. قم بتوصيل مصدر الطاقة بحاملها. قم بتوصيل مصدر الطاقة بالكمبيوتر الذي تم تثبيت برنامج التدفئة عليه.
2. قم بتشغيل الكمبيوتر وفتح برنامج التدفئة. طاقة تصل امدادات الطاقة.
3. انقر على زر فحص الجهاز. إذا كان البرنامج يشير إلى "مرت" ثم يمكن أن تستمر التجربة. خلاف ذلك، قد يكون كبير E-رقاقة مشكلة (تحميل غير صحيح من E-رقاقة، كسر الأقطاب الكهربائية...).
4. انقر على علامة التبويب التجربة. انقر على دليل لتنشيط الوضع اليدوي للتدفئة.
5. حدد درجة الحرارة المستهدفة وتغيير وفقا لمعدل درجة الحرارة. اضغط على تطبيق لتسخين رقائق E إلى درجة الحرارة المستهدفة (الشكل 4).
   ملاحظة: يمكن تسخين الرقائق الإلكترونية حتى 100 درجة مئوية. إذا تم استخدام محلول مائي للتجربة (كما هو الحال في حالتنا)، تجنب تسخين رقائق E فوق 90 درجة مئوية. خلاف ذلك ، يمكن للعينة السائلة أن تجف. عند تسخين السائل ، يمكن أن ترتفع درجة الحرارة مؤقتا فوق درجة الحرارة المستهدفة ثم تنخفض مرة أخرى إلى درجة الحرارة المطلوبة. استخدام انخفاض معدل التدفئة لتقليل هذه التجاوزات (1 درجة مئوية / ثانية على ما يرام).
6. انقر على المحيط للعودة إلى درجة الحرارة المحيطة (25 درجة مئوية). انقر على إيقاف لوقف التدفئة فجأة. انقر على علامة التبويب إنهاء الجلسة لإنهاء تجربة التدفئة.

7. التصوير STEM لنمو الجسيمات النانوية

1. استخدم المجهر في وضع STEM باستخدام كاشف HAADF. انتقل إلى منطقة البكر من العينة، بالقرب من زاوية من نافذة المراقبة حيث سمك السائل هو الحد الأدنى. الحصول على أشرطة الفيديو لنمو الجسيمات النانوية لدرجات حرارة مختلفة من السائل (الشكل 5).
   ملاحظة: تظهر الجسيمات النانوية الذهبية على الفور وتنمو في المنطقة الممسوحة ضوئيا. تسجيل الفيديو بمعدل إطار من صورة واحدة في الثانية هو حل وسط جيد لمراقبة عمليات النمو مع إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء ودقة الوقت المناسب.

8. STEM نانودراكشن من الجسيمات النانوية واحد

1. الحصول على صورة STEM HAADF من العديد من الأجسام النانوية. الحصول على نمط الحيود من الجسيمات النانوية الفردية التي تم اختيارها على الصورة باستخدام برنامج STEMx (الشكل 6).
   ملاحظة: STEM nanodiffraction هو تقنية تسمح بالحصول على نمط الحيود من الجسيمات النانوية المفردة في السائل أثناء تجارب النمو²².
2. بعد الحصول على صورة STEM HAADF ، حدد العديد من الكائنات النانوية على الصورة ويقوم برنامج STEMx تلقائيا بمزامنة موضع المسبار وكاميرا CCD للحصول على نمط الحيود في كل موضع من موضع المسبار. لتجنب تداخل بقع الحيود، استخدم زاوية تقارب صغيرة من مسبار STEM (7.4 مراد في حالتنا) باستخدام فتحة مكثف صغيرة (10 ميكرومتر في حالتنا).

9. تنظيف حامل الخلية السائلة (بعد التجربة)

ملاحظة: هنا نحن وصف إجراء تنظيف قياسية لحامل الخلية السائلة. إذا لم يكن هذا التنظيف فعالا بما فيه الكفاية ، فمن الممكن استخدام حمض النيتريك المخفف والميثانول لطرد مجاميع الجسيمات النانوية في نهاية المطاف في حامل الخلية السائلة. يجب استشارة وثائق التوافق الكيميائي لحامل الخلية السائلة من قبل. على أي حال، دائما الانتهاء من التنظيف مع حقن الماء المقطر.

1. أزل الغطاء. قم بإزالة الرقائق الإلكترونية المستخدمة. إزالة طوقا الداخلية.
   ملاحظة: يمكن تخزين الرقائق الإلكترونية المستخدمة في مربع مكيف. ومن الممكن بعد ذلك لإجراء تحليلات TEM الموقع الخارجي أو SEM من الأجسام النانوية التي ظلت تعلق على نوافذ SiN بعد فض الاختام الخلية السائلة¹⁵. ليس من المستحسن إعادة استخدام الرقائق الإلكترونية لتجربة أخرى في الموقع ، ولكن لا يزال من الممكن إذا لم يتم كسر فيلم SiN أثناء فك ختم الخلية السائلة. ويمكن بعد ذلك إجراء تجارب فرط النمو في مذيب مختلف. ²³
2. حقن 5 مل من الماء المقطر في مدخل ومنفذ أنابيب حامل الخلية السائلة.
3. تنظيف غيض من حامل الخلية السائلة باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة. يمكن أن تكون منغمسة لوحة الاتصال في الحمام. فقط تزج الجزء الذي هو مغطى مع الغطاء. لا تزج فتحات التهوية في السائل.
4. جفف حامل الخلية السائلة باستخدام مسدس هوائي.
5. ضع طوقا المستخدم مع الخلايا السائلة الوهمية. ضع الخلايا السائلة الوهمية والغطاء مرة أخرى.
6. تخزين حامل العينة في محطة فراغ.

10. تحليل ما بعد التجربة باستخدام فيجي (ImageJ)

ملاحظة: يوصى بتقسيم كل إطار من مقاطع الفيديو التي تم التقاطها إلى صور مفردة. والغرض من هذه الخطوة تحليل ما بعد التجربة هو تحويل أشرطة الفيديو الأصلية للجسيمات النانوية إلى أشرطة الفيديو الثنائية التي يمكن تحليلها من قبل فيجي. يتم استخدام مرشح وسيط من أجل تعزيز التباين بين الجسيمات النانوية على الخلفية (الشكلان 7B و 7E). وهذا أمر ضروري لتسهيل تصغير الفيديو.

1. افتح دليل الملفات الذي يحتوي على صور الفيديو على فيجي بالنقر على ملف | استيراد | تسلسل الصورة. ستظهر نافذة خيارات التسلسل. حدد صورة البدء المناسبة (إذا كان سيتم تجاهل بداية الفيديو). أدخل رقم الزيادة لتسلسل الصورة (يتوافق مع عدد الإطارات التي يتطلبها مسح STEM للوصول إلى أسفل الصورة). حدد المربع لتحويل إلى تدرج رمادي 8 بت. حفظ تسلسل الصورة بتنسيق tiff.
2. اقتصاص كافة القطع الأثرية غير المرغوب فيها من الفيديو (على سبيل المثال شريط المقياس أو حافة نافذة الخلية السائلة).
3. انقر على | العملية | المرشحات وسيط لتطبيق عامل تصفية متوسط على جميع الصور. حفظ تسلسل الصورة المعالجة بتنسيق tiff.
   ملاحظة: إطار منبثق يسأل نصف القطر المستخدم لتصفية الوسيط. استخدمنا نصف قطرها 2 بكسل ولكن لا تتردد في استخدام معلمات مختلفة. كما تتوفر مرشحات أخرى في فيجي يمكن استخدامها لتعزيز معالجة الصور. على وجه الخصوص ، يمكن استخدام خوارزمية الخلفية الطرح لجعل كثافة الخلفية مسطحة إذا كانت غير موحدة. لهذا، انقر على عملية | خلفية فرعية. في حالتنا ، تخلق هذه العملية بقعا بيضاء صغيرة في خلفية الصور الأولى التي يمكن تفسيرها على أنها جسيمات نانوية زائفة. وهكذا، لم نستخدم هذه العملية ولكن ينبغي تجربتها على مجموعات البيانات الأخرى، لأن زيادة سمك السائل من الزاوية إلى مركز الخلية السائلة عادة ما يحفز كثافة الخلفية غير الموحدة على صور LCTEM التكبير منخفضة.
4. انقر على | الصور ضبط | عتبة. تحرك يدويا للحصول على دقة أفضل لعتبات التأويل حتى يتم تلوين الجسيمات النانوية فقط باللون الأحمر. اضغط على زر تطبيق. سيتم تحويل المكدس إلى الإطار الثنائي المنبثقة. إلغاء تحديد حساب العتبة لكل صورة. حفظ تسلسل الصورة الثنائية في شكل tiff (الأشكال 7C و 7F).
   ملاحظة: من المستحسن التحقق مما إذا كانت العتبة مرضية في كل إطار من الفيديو.
5. القيام بهذه الخطوة فقط إذا كان هناك عكس التباين من الجسيمات النانوية أثناء الفيديو. انقر على | العملية | ثنائي تمدد. افعل ذلك مرة أخرى إذا لزم الأمر. انقر على | العملية | ثنائي ملء الثقوب (الشكل 7G، انظر قسم المناقشة).
6. انقر على تحليل | تحليل الجسيمات. تحديد نطاق حجم الجسيمات النانوية التي تم تحليلها التي تمت ملاحظتها أثناء التجربة. تحقق من تلخيص.
   ملاحظة: من المهم جدا على الأقل تحديد الحد الأدنى لحجم الجسيمات النانوية الملاحظة. وبدون ذلك، سيتم اعتبار النقاط السوداء الصغيرة (الضوضاء) التي تظهر في تسلسل الصورة الثنائية كجسيمات نانوية. كمحاولة أولى، اختر حجم أصغر الجسيمات النانوية التي حددتها العين، ولكن بعد ذلك من الضروري إجراء تجربة وعملية خطأ لفهم تأثير هذه المعلمة وتحسين تحليل البيانات الآلي (انظر قسم المناقشة). قبل هذه الخطوة، لاسترداد مساحة الجسيمات النانوية، انقر على تحليل | تعيين القياسات والتحقق من المنطقة. وتتوفر قياسات أخرى.
7. حفظ الإطارات "النتائج" و"الملخص". عدد الجسيمات النانوية لكل إطار موجود في إطار بيانات الملخص.

النتائج

يظهر الشكل 5 سلسلتين من صور STEM HAADF لتشكيل الجسيمات النانوية الذهبية المكتسبة على مدى 80 ثانية عند 25 درجة مئوية و85 درجة مئوية. في كل هذه التجارب، يتم دفع نواة ونمو الجسيمات النانوية من خلال التحلل الإشعاعي للمياه. ومن بين الأنواع الكيميائية التي تولدها هذه الظواهر الناجمة عن شعاع الإلكترون، يمكن لعوامل التخفيض القوية (أي الإلكترونات المائية وجذرات الهيدروجين) أن تقلل من حمض رباعي الكلور يوريك مما يؤدي إلى تكوين بلورة نانوية ذهبية في الواجهة بين نوافذ شبكة الفضاء السويدية والسائل. تؤكد هاتان الملاحظتان في الموقع اللذين أجريتا بنفس معدل جرعة الإلكترون أن الطريقة الحالية تسمح بتصور التأثير الجذري لدرجة الحرارة على تكوين الجسيمات النانوية في الوسائط السائلة. في درجة حرارة منخفضة، نلاحظ نمو تجميع كثيفة جدا من الجسيمات النانوية الصغيرة، في حين يتم الحصول على عدد قليل من الهياكل النانوية الكبيرة والأوجه بشكل جيد في درجة حرارة عالية. وبما أن تباين صور STEM HAADF يتناسب مع سمك الجسيمات النانوية الذهبية ، يمكننا أن نرى أن مجموعتين من الأجسام تتشكل خلال تجارب النمو هذه: جسيمات نانوية ثلاثية الأبعاد عالية التباين وهياكل نانوية كبيرة ثنائية الأبعاد ذات شكل مثلث أو سداسي وتباين أقل (يشار إليها بالسهام الحمراء في الشكل 5).

تسمح طريقة تحليل الفيديو الموصوفة في هذا البروتوكول بتحديد عمليات النوى والنمو من خلال قياس عدد الجسيمات النانوية ومتوسط مساحتها السطحية في المنطقة التي تمت ملاحظتها بمرور الوقت. كما رأينا في الشكل 8، في درجة حرارة منخفضة يتم تشكيل أكثر من 800 نانوية في غضون بضع عشرات من الثواني من المراقبة في حين يتم تشكيل 30 جسيمات نانوية فقط في درجة حرارة عالية. وبصرف النظر عن اثنين من لوحات نانوية مثلثة وخداسية، وجميع الجسيمات النانوية موجودة بالفعل على الصورة الأولى جدا من ارتفاع درجة الحرارة المتابعة. ويبين الشكل 9 أن متوسط مساحة سطح الجسيمات النانوية يزيد 40 مرة أسرع عند 85 درجة مئوية منه عند 25 درجة مئوية.

يمثل الشكل 6 صورة STEM نموذجية ونمط الحيود لاثنين من الجسيمات النانوية الذهبية التي تم اختيارها مباشرة على الصورة (المشار إليها بالأسهم الحمراء على الشكل 6A). هنا، يمكننا تحديد هيكل مكعب (FCC) محوره الوجه من الذهب الموجه على طول [001](الشكل 6B)و [112] (الشكل 6C) محاور المنطقة.

الشكل 1:تخطيطي للرقائق الإلكترونية وطرف حامل الخلية السائلة. (أ) الشريحة الإلكترونية الكبيرة ذات المقاومة المستخدمة لتسخين الخلية السائلة (العلوية) والشريحة الإلكترونية الصغيرة (السفلية). (ب) يتم تحميل كل من رقائق E في حامل الخلية السائلة. الأقطاب الكهربائية للشريحة الإلكترونية الكبيرة على اتصال مع منصات القطب من حامل الخلية السائلة. مقاومة كبيرة E-رقاقة يمكن تسخين الخلية السائلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

الشكل 2:صور المجهر الضوئي للرقائق الإلكترونية التي توضح: (أ) نافذة SiN سليمة ضرورية للتجربة. (ب) رقاقة السيليكون التالفة على حافة رقاقة الإلكترونية. يمكن استخدام هذا النوع من الرقائق الإلكترونية إذا كانت المنطقة المتضررة خارج المنطقة الرطبة بمجرد إغلاق الخلية السائلة (أي إذا كان الضرر خارج المنطقة المحددة بواسطة حلقات O). (ج) المخلفات على سطح الشريحة الإلكترونية. إذا لم تغادر هذه المخلفات بعد تكرار عمليات التنظيف (انظر القسم 4.1)، لا تستخدم الشريحة E. (من D إلى F) نوافذ SiN التالفة (رقائق E غير صالحة للاستعمال). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صور لعملية خطوة بخطوة لتحميل الخلية السائلة في حامل TEM. (أ) حامل العينة وحده. (ب) وضع طوقا O-حلقة في تجويف. (ج) إدراج رقاقة E الصغيرة في طوقا O-الحلقات. (D) وضع قطرة من الحل على رقائق E الصغيرة. (ه) وضع كبيرة E-رقاقة على واحد صغير. (F) ختم كامل الخلية السائلة عن طريق الشد الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: لقطة شاشة لبرنامج التدفئة الذي يتحكم في درجة حرارة الخلية السائلة.

الشكل 5: منخفضة التكبير STEM HAADF صورة سلسلة من نمو الجسيمات النانوية الذهب. (أ) عند 25 درجة مئوية (ب) عند 85 درجة مئوية. يشار إلى الوقت المقابل في الزاوية اليسرى السفلى من كل صورة. ويشار إلى الهياكل النانوية 2D من قبل السهام الحمراء. يتم الحصول على جميع الصور مع نفس معدل جرعة الإلكترون من 3.4 إلكترون · ق^-1· نانومتر^-2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6:STEM نانودراكشن من الجسيمات النانوية واحدة. (أ) صورة STEM المستخدمة في تحديد الجسيمات النانوية المنتشرة (يشار إلى مواقع المسبار أثناء عمليات الاستحواذ على الحيود بواسطة الأسهم الحمراء). (B, C) نمط الحيود من اثنين من الجسيمات النانوية المختارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: معالجة البيانات وتحليلها من الصور STEM HAADF باستخدام فيجي. تم الحصول على الصور بعد 40 ثانية من بداية النمو. (من A إلى C) صورة تم الحصول عليها عند 25 درجة مئوية (D إلى G) صورة تم الحصول عليها عند 85 درجة مئوية (A،D) صورة STEM الخام. (B, E) الصورة المعالجة (عامل تصفية متوسط). (C, F) صورة ثنائية. (G) يتم تطبيق تمدد البكسل مرتين ثم يتم تطبيق عملية "ملء الثقوب". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8:رسم بياني يمثل عدد الجسيمات النانوية الذهبية كدالة للوقت عند 25 درجة مئوية و 85 درجة مئوية. يتم قياس المنحنيين عند 25 درجة مئوية تلقائيا مع الحد الأدنى لحجم الكشف (S_min)من 20 (أحمر) و 50 بكسل (أزرق)². تمثل النقاط الخضراء التي تم قياسها بعد 12 و 60 ثانية من الاستحواذ عدد الجسيمات النانوية التي تم عدها يدويا على الفيديو الذي تم الحصول عليه عند 25 درجة مئوية.

الشكل 9:الرسوم البيانية التي تمثل متوسط مساحة سطح الجسيمات النانوية الذهبية كدالة للوقت ل 25 درجة مئوية و 85 درجة مئوية. تمثل النقاط الخضراء قياسات يدوية لمتوسط مساحة الجسيمات النانوية في نقاط زمنية معينة من الفيديو المكتسب عند 85 درجة مئوية.

الشكل 10: عالية التكبير STEM HAADF صورة سلسلة من نمو nanocube الذهب واحد في 85 درجة مئوية. تم الحصول على هذه السلسلة من الصور بمعدل جرعة إلكترون 83.6 electron.s^-1.nm-2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ويمكن البروتوكول الموصوف من اتباع نواة ونمو الجسيمات النانوية الذهبية التي يحركها التحلل الإشعاعي في وسائط سائلة يتم التحكم في درجة حرارتها. جنبا إلى جنب مع معالجة الفيديو الآلي، فإنه يسمح بقياس تأثير درجة الحرارة على المعلمات الرئيسية لتوليف الجسيمات النانوية مثل الكثافة والحجم والشكل والهيكل الذري للجسيمات النانوية. تسمح هذه المدخلات القيمة بتقييم تأثير درجة الحرارة على معدلات النوى والنمو ، والكشف عن التحولات المرحلية المحتملة وتصور عمليات الأوجه التي تملي النتيجة النهائية للحلول الغروية. جنبا إلى جنب مع إمكانية السيطرة على تكوين وسائل الإعلام التفاعلية، والخلية السائلة التي تسيطر عليها درجة الحرارة TEM هو خطوة أخرى نحو المراقبة المباشرة لعمليات النوى والنمو من مختلف الهياكل النانوية في ظروف توليف واقعية. وسيناقش تفسير النتائج المعروضة في هذه المقالة ومقارنتها بنماذج النوى والنمو في أماكن أخرى. هنا، نريد أن نسلط الضوء على العديد من الجوانب المنهجية التي يجب النظر فيها لإجراء التجارب ذات الصلة في الموقع TEM.

بادئ ذي بدء ، من المهم تحديد تأثيرات شعاع الإلكترون في وسائط التفاعل لأنها يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج التجربة. هنا ، كما التحلل الإشعاعي المياه هي القوة الدافعة لتشكيل الجسيمات النانوية ، وسرعة النمو يزيد بسرعة مع معدل الجرعة الإلكترونية التي سوف تؤثر على الشكل النهائي للأجسام نانو^11،15. لذلك ، لدراسة آثار درجة الحرارة على نواة ونمو الجسيمات النانوية ، من الضروري مقارنة تجارب النمو المكتسبة بنفس معدل جرعة الإلكترون. في وضع STEM، يتوافق معدل جرعة الإلكترون مع تيار الحزمة (بالإلكترونات في الثانية) مقسوما على حجم الصورة (بالنم^2). لذلك، فإن معدل الجرعة الإلكترون الثابت يعني الحفاظ على نفس تيار الحزمة (أي نفس فتحة المكثف ونفس حجم البقعة) ونفس التكبير لكل تجربة. من المهم قياس تيار الحزمة لظروف التصوير باستخدام كاميرا CCD أو كوب فاراداي لتفسير البيانات وإعادة إنتاجها. يجب اختيار معدل التكبير والجرعة الناتجة وفقا لما إذا كان المرء يرغب في تصور نمو مجموعة كبيرة من الجسيمات النانوية لاستخراج النتائج ذات الصلة إحصائيا على حركية النمو(الشكل 5)أو آليات النمو على مقياس الجسيمات النانوية الواحد لتحديد مواقع الامتزاز التفضيلية على أسطح الجسيمات النانوية(الشكل 10). إذا كانت عمليات النوى والنمو سريعة جدا، وخاصة عند التكبير العالي، ينبغي اختيار فتحة مكثف صغيرة وحجم بقعة صغيرة لتقليل معدل الجرعة. كما يمكن أن تبطئ نواة ونمو الجسيمات النانوية عن طريق تقليل تركيز السلائف المعدنية في المحلول المحلل ولكن لاحظ أن تركيز المنتجات التحليلية سيزداد مع ارتفاع درجة الحرارة. بشكل عام ، من المهم أيضا أن تأخذ في الاعتبار تاريخ تشعيع الإلكترون للعينة بأكملها. ففي هذه المنطقة، على سبيل المثال، إذا أجريت عدة تجارب نمو بسرعة في مناطق قريبة من بعضها البعض، فإن كثافة الجسيمات النانوية ستنخفض بمرور الوقت بسبب انخفاض تركيز السلائف الذهبية في المنطقة المدروسة. ويمكن تقليل هذا التأثير عن طريق فصل تجارب النمو في كل من المكان والزمان وباستخدام حامل السائل في وضع التدفق.

خوارزميات تتبع الواجهة مفيدة للغاية لأتمتة تحليل مقاطع الفيديو واستخراج النتائج الكمية على نواة ونمو تجميعات الجسيمات النانوية الكبيرة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن خطوة ثنائية الصورة هي دائما بيانات محددة ، مما يعني أن المرشحات ومعالجة البيانات التي يجب تطبيقها على الصور لتحسين الكشف عن واجهة الجسيمات النانوية / السائلة ستختلف من تجربة إلى أخرى. وعلاوة على ذلك، من الضروري مقارنة نتائج هذه التحليلات الآلية بالقياسات اليدوية التي أجريت على عدد قليل من الصور لتحسين سير عمل معالجة الصور ومعرفة حدوده. هنا، على سبيل المثال، تؤدي أحداث التشتت المتعددة في الجسيمات النانوية ثلاثية الأبعاد السميكة بشكل متزايد التي تتشكل في درجة حرارة عالية إلى عكس التباين في جوهرها بعد 30 ثانية من المراقبة لأن التوسع الزاوي للإلكترونات المتناثرة يؤدي إلى انخفاض الإشارة التي تم جمعها في النطاق الزاوي للكاشف الحلقي. للحفاظ على قياس المساحة السطحية الحقيقية لهذه الجسيمات النانوية ، استخدمنا عملية بيانات "ثقوب التعبئة" بعد ثنائية الصورة التي تملأ الدائرة الداخلية لتناقضات شكل الحلقة(الشكل 7F، G). ومع ذلك ، كان علينا استخدام توالي صغير للكائنات للتأكد من أن تناقضات شكل الحلقة هذه متصلة دائما بشكل كامل. هذه الخطوة الأخيرة تؤدي إلى مبالغة طفيفة في تقدير متوسط مساحة السطح من الجسيمات النانوية في القياسات الآلية(الشكل 9). وبالمثل، للكشف عن الجسيمات النانوية، علينا أن نحدد الحد الأدنى لحجم الأجسام المكتشفة (S_mim)لتجنب الكشف عن الضوضاء، ولكن هذه المعلمة تؤثر على معدل النوى المقاس. كما رأينا في الشكل 8، يزداد عدد الجسيمات النانوية المكتشفة في بداية التجربة للوصول إلى الهضبة. عندما تكون_{S min} كبيرة (50 بكسل² مقابل 1543 نانومتر^2)،يتم الاتفاق على القياسات التلقائية واليدوية على مستوى هذه الهضبة (835 نانوجسيمات بعد 60 ثانية) ولكن يتم تأخير الكشف عن الجسيمات النانوية في التحليل التلقائي حيث يتم حساب 835 جسيمات نانوية يدويا بعد 12 ثانية فقط، ولكن لا يتم الكشف عنها تلقائيا حتى وقت لاحق. هذا الوقت الكشف الموسع يؤدي إلى بخس من معدل التنو. تقليل_{S min} إلى 20 pixel² (أي 617 nm²⁾يقلل من الخطأ في وقت النوى لتجميع الجسيمات النانوية ولكنه يؤدي إلى تقييم مفرط لكثافة الجسيمات النانوية خاصة في المرحلة المبكرة من التجارب(الشكل 8)الذي يؤثر أيضا على معدل النوى. الكشف وحجم وشكل القياسات من نانو الكائنات مع سلوك ديناميكي جدا وإشارة منخفضة إلى نسبة الضوضاء هو التحدي المشترك في المرحلة السائلة TEM التي يمكن تحسينها باستخدام طرق أخرى تجزئة وdenoising²⁴ أو التعلم الآلي النهج²⁵.

وأخيرا وليس آخرا، يجب أن يتم إعداد الخلية السائلة وتنظيف حامل السائل بعناية فائقة لتجنب تلوث وسائل الإعلام رد الفعل.

بشكل عام، يتيح التحكم في درجة حرارة العينة أثناء تحليلات LCTEM الفرصة للتحقيق في الآثار الحرارية على التفاعلات الكيميائية التي تحدث في الواجهة بين المواد الصلبة والسوائل. لذلك، نأمل أن تمهد الطريقة الحالية الطريق لتجارب TEM الموقعية الأخرى المصممة للكشف عن ديناميكيات المواد الصلبة أو الناعمة أو البيولوجية في الوسائط السائلة التي يتم التحكم في درجة حرارتها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Plus electron microscope	Jeol
Acetone	Merck
Air pistol
ARM 200F electron microscope	Jeol
Binoculars or optical microscope
Carbon tipped tweezers
Computer with heating software	Software by Protochips
Distlilled water
Dummy e-chips	Protochips
Gasket/O-rings	Protochips
Gold aqueous solution	Merck		1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand
Large liquid heating E-chip	Protochips
Methanol	Merck
One View camera	Gatan
Petri dish			Number : 2
Plasma cleaner	Gatan
Poseidon Select	Protochips		Liquid cell holder
Power supply Keithley 2450
Protective gloves
Red PEEK tubing			Number : 3
Screwdriver with torque
Small liquid E-chip	Protochips		150 nm spacers
STEM HAADF detector	Jeol
STEMx software	Gatan
Syringe			Number : 2
Syringe pump	Harvard apparatus		Number : 2
Vacuum pump	Gatan