Sıvı Hücreli İletim Elektron Mikroskopisi ile Sıcaklığın Nanopartiküllerin Çekirdeklenmesi ve Büyümesi Üzerindeki Etkilerinin Incelenmesi

Özet

Sıvı fazlı elektron mikroskopi deneyleri sırasında sıcaklık kontrolü, nanopartiküllerin oluşumunu veya uygulama ortamlarını taklit eden sıvı ortamlardaki dinamiği incelemenin yeni perspektiflerini açar. Yakın zamanda geliştirilen ısıtma sıvısı hücrelerini kullanarak, sıcaklığın sudaki altın nanopartiküllerin çekirdeklenme ve büyüme süreçleri üzerindeki etkisini doğrudan gözlemledik.

Özet

Sıcaklık kontrolü, sıvı hücre iletim elektron mikroskopisi ile nanokimyayı incelemek için ek bir serbestlik derecesi sağlayan yeni bir gelişmedir. Bu yazıda, sıcaklığın suda radyoliz tarafından yönlendirilen altın nanopartiküllerin oluşumu üzerindeki etkisini incelemek için yerinde bir ısıtma deneyinin nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz. Deneyin protokolü, 100 °C'ye kadar homojen ısıtma yeteneklerine sahip özel bir sıvı hücre, akış yeteneklerine sahip bir sıvı hücre TEM tutucusu ve sıcaklığı kontrol etmek için entegre bir arayüz içeren oldukça basittir. Altın nanopartiküllerin çekirdeklenme ve büyüme mekanizmalarının sıvı hücredeki sıcaklıktan büyük ölçüde etkilendiğini gösteriyoruz. STEM görüntüleme ve nanodiffaction kullanılarak, büyüyen nanopartiküllerin yoğunluğu, boyutu, şekli ve atomik yapısının evrimi gerçek zamanlı olarak ortaya çikar. Otomatik görüntü işleme algoritmaları, nanopartiküllerin çekirdeklenmesi ve büyüme oranları gibi video dizilerinden yararlı nicel veriler çıkarmak için yararlanır. Bu yaklaşım, nanomalzemelerin sıvı faz sentezi sırasında oyundaki karmaşık fiziko-kimyasal süreçleri anlamak için yeni girdiler sağlar.

Giriş

Metal nanopartiküller (NP'ler), optik algılama^1,tıp² veya enerji 3 gibi çeşitli alanlarda kullanılabilecek umut verici fiziko-kimyasal^özellikleresahiptir. Islak-kimyasal sentez, iyi tanımlanmış boyut ve şekle sahip metal NP'leri imal etmek için çok yönlü bir yöntemdir. Son on yılda, NP sentezi üzerinde kontrol sağlamak için birçok strateji geliştirilmiştir: tohum aracılı büyüme⁴, yüz engelleme yöntemi⁵, kinetik kontrollü sentez⁶, seçici gravür⁷ veya sıcaklık kontrollü sentez⁸. Bununla birlikte, sentezi yönlendiren kimyasal reaksiyonlar oldukça basit olsa da, çekirdeklenme ve büyüme mekanizmaları değildir, çünkü birçok parametre oluşum süreçlerinde rol oynar ve bireysel etkilerinin sentezin belirli zaman noktalarında oluşum ortamlarından çıkarılan ortaya çıkan nanomalzemelerin ex situ anlık görüntülerinden alınması zordur. Çekirdeklenme ve büyüme süreçlerini gerçekten anlamak ve onları kontrol etmenin yollarını belirlemek için, ince kontrollü sıvı ortamda gerçek zamanlı gözlemlerine izin veren yerinde araçlar kullanmalıyız.

Bu bağlamda, Sıvı Hücreli İletim Elektron Mikroskopisi (LCTEM), metalik nanopartiküllerin sentezine yeni bir ışık yakmak için çok güçlü bir yöntem olmuştur^{9,10,11,12,13}. Bireysel nanoyapıların dinamiklerini doğrudan sıvı oluşum ortamlarında görüntülenerek, bu teknik çekirdeklenme ve büyüme mekanizmalarının daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır, özellikle kristal kusurlarının, tohum morfolojisinin ve organik ligandların rolü, yönsel büyüme veya gravür işlemlerinin yönlendirildirmesine ve belirli şekillere sahip nanomalzemeler elde (nanorodlar, nanostarlar, nano plakalar, nano kabuklar)^10,11,^12,13^,14,15,16,17, 18^,19. Bir TEM'in elektron ışını sıvılarla etkileşime girdiğinde, radyoliz prosesleri ışınlanmış alandaki çözelti kimyasını değiştiren ve büyüme veya gravür işlemlerini yönlendirmek için kullanılabilen güçlü azaltma ve oksitleyici türler üretir. İlginçtir ki, radyolitik ürünlerin konsantrasyonunun elektron mikroskopunda ince ayarlanabilen bir parametre olan elektron doz oranı ile arttığı bilinmektedir²⁰. Bu nedenle, radyolizin bu doz oranı bağımlılığı reaksiyon hızını kontrol etmek ve nanoyapıların oluşum süreçleri ve son morfolojisi üzerindeki kinetik etkileri ortaya çıkarmak için¹¹,^15,20.

Sıcaklık nanomalzeme sentezinde çok önemli bir parametre olmasına rağmen, etkileri şimdiye kadar LCTEM tarafından dikkatlice araştırılmış değildir, çünkü güvenilir sıcaklık kontrolüne sahip ticari sıvı hücreleri sadece yakın zamanda geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu tür yerinde çalışmalar, sıcaklık değişimlerinin neden olduğu karmaşık kinetiği ve termodinamik etkileri çözmek için vazgeçilmezdir. Gerçekten de, bir yandan sıcaklığın artması, büyüme sırasındaki yönlü süreçler üzerinde büyük etkilere sahiptir, sıvıdaki atomik ve moleküler difüzyonu hızlandırır ve reaksiyon oranlarını değiştirir. Öte yandan, nanoyapıların nano faz diyagramı da sıcaklığa karşı çok hassastır. Bu yazıda, oda sıcaklığı ile 100 °C arasında bir sıcaklık kontrolü ile sudaki altın nanopartiküllerin radyolitik büyümesini takip etmek için yakın zamanda geliştirilen ısıtma sıvısı hücrelerinden yararlanıyoruz. STEM görüntüleme ve kırınımını gerçek sentez koşullarına giderek daha da yakın hale gelen bir ortamda birleştiren bu metodoloji, yerinde TEM gözlemleri ile tezgah ölçeğindeki sentezler arasındaki boşluğu azaltır.

Protokol

1. STEM HAADF görüntüleme için iletim elektron mikroskobu hizalayın

1. Mikroskop hizalaması için üretici yönergelerini izleyin.
2. Mikroskobu hizalamak için geleneksel bir kurutulmuş numune kullanın. Sıvı numune kullanmayın.
3. Büyüme hızını en aza indirmek için, ışın akımını azaltmak için küçük kondenser diyaframı ve küçük nokta boyutu kullanmayı ima eden elektron doz oranını en aza indirin (tartışma bölümüne bakın).

2. E-çip kullanımı

NOT: Ticari sıvı tutucular hemen hemen tüm TEM'e sığar, ancak mikroskop markası ve kutup parçası için özel olarak tasarlanmış tutucuyu kullanır. Sıvı bir hücre, her ikisi de elektron saydam olan 50 nm kalınlığında amorf silikon nitrür (SiN) filmi ile kaplanmış 500 x 50 μm pencereli silikon substratlar olan E-çip adı verilen iki MEMS tabanlı silikon çipden yapılmıştır (Şekil 1A). Bu iki e-çip farklı boyutlara sahiptir. Küçük olan, iki E-çip (150 nm burada) ve sıvı kalınlığı arasındaki mesafeyi sabitleyen altın ara parçaları ile 2 x 2 mm'dir. Büyük olan 4 x 6 mm'dir ve silikon substratın içine gömülü bir dirence sahiptir ve sıvı numunenin düzgün bir şekilde ısıtılmasını sağlar (Şekil 1B). Temiz odalarda üretilirler çünkü, E-çiplerin iki farklı tarafı vardır: biri pencerenin küçük göründüğü (ön taraf olarak adlandırıldıktan sonra burada) ve diğeri pencerenin lavabo şeklinde büyük olduğu (arka taraf olarak adlandırıldıktan sonra).

1. E-çipleri kullanırken, pencereye asla cımbızla dokunmayın ve talaşları yanlardan tutun. Silikon substratın yüzeyinin çizilmesini önlemek için karbon uçlu cımbız kullanın.
2. Bir yüzeye bir E-çip yerleştirirseniz, SiN filmi kırılgan olduğundan ve ön tarafta biriktirilmediğinden arka tarafın yüzeyle temas halinde olduğundan emin olun.

3. Sıvı hücre tutucusunun temizlenmesi (deneyden önce)

1. Tutucunun ucunu kaplayan kapağı çıkarın. Cımbız kullanarak sahte sıvı hücreleri çıkarın. Sahte sıvı hücrelerle kullanılan contayı çıkarın.
   NOT: Sahte sıvı hücreler, SiN penceresi olmayan ve sadece silikon olan sıvı hücrelerdir. Sıvı hücre tutucuyu vakum pompasında saklamak için kullanılırlar. Pirinç vidaların durumuna dikkat edin, çünkü zamanla kolayca ufalanırlar. Özellikle vida kafaları hasar görmüşse vidaların değiştirilmesi gerekir. Aksi takdirde, deneyden sonra sökmek zor olabilir ve küçük döküntüler de örnek yüklemeyi bozabilir.
2. Şırınnalar ve harici PEEK borularını kullanarak tutucunun arkasına 2 mL damıtılmış su enjekte edin.
   NOT: Tutucunun içinde 3 mikroakışkan tünel vardır. Üçü de suyla temizlenmeli. Tutucunun önünden çıkan suya dikkat edin: su daha önceki bir deney nedeniyle renklenmişse, sıvı renklendirilmeyene kadar tutucunun içine su koymaya devam edin.
3. Deney sırasında sıvı hücreye bir çözelti enjekte ediyorsanız (bizim durumumuzda suda 1 mM HAuCl_4), numune tutucunun borusunu bu çözelti ile doldurun.
4. Sıvı hücre tutucunun ucunu bir havalı tabanca kullanarak kurulayın.

4. Sıvı hücrenin hazırlanması (E-çipler)

1. Sıvı hücrelerin temizlenmesi.
   1. Cam petri kabına aseton doldurun.
   2. Cam petri kabına metanol doldurun.
      DİkKAT: Metanol toksisitesi nedeniyle, metanollü Petri kabı bir duman kaputunun altına konulmalıdır. Metanol yeterli koruyucu dişli (eldiven) ile ele alınmalıdır.
   3. Petri kabına asetonlu bir küçük ve bir büyük E-çip koyun ve 2 dakika bekleyin.
      NOT: E-çipler, deneyden önce çıkarılması gereken koruyucu bir tabaka ile kaplanmıştır. Aseton fotoresisti çıkaracak ve enkazın E-çiplerini temizleyecek. Temizliği arttırmak için çözelti hafifçe çalkalanabilir.
   4. Her iki E-cipsi de metanollü Petri kabına koyun ve 2 dakika bekleyin. Metanol, E-çipleri asetondan ve enkazın geri kalanından temizleyecek.
      DİkKAT: E-çiplerin havada kuruması için aseton ve metanol arasında aktarımı mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır.
   5. Sıvı hücreleri bir havalı tabanca kullanarak kurulayın. Havalı tabancayı kullanırken cımbız kullanarak E çipi tutun. Havalı tabanca tetiğine çok fazla basmamaya dikkat edin, aksi takdirde E-çip cımbızdan düşebilir. Bırakırlarsa, temizliği aseton ve metanol ile yeniden başlatın.
   6. Dürbün büyüteci veya optik mikroskop kullanarak silikon nitrür penceresinin bütünlüğünü doğrulayın (Şekil 2).
      NOT: Her iki E-çipin pencerelerinin temiz ve kırık olmadığından emin olun. E-çipler temiz görünmüyorsa, tekrar aseton ve metanol içine geri koymaya çalışın. Kir hala penceredeyse veya pencere kırılmışsa, E-çipler yenileriyle değiştirilmelidir.
   7. Plazma, E-çipleri argon ve oksijen gazı karışımı ile 2 dakika boyunca temizleyin. Plazma temizliği E-çipleri hidrofilik olmalarını sağlar. Plazma temizleme kurulumunun ayrıntıları şunlardır: argon gaz akışı = 35 sccm, oksijen gazı akışı = 11,5 sccm, gaz akışı zaman aşımı = 20 s, İleri RF hedefi = 50 W, İleri RF Aralığı = 5 W, Maksimum yansıyan RF = 5 W.
2. Sıvı hücrelerin TEM tutucusuna yüklenmesi (Şekil 3).
   1. Conta O-halkalarını sıvı hücre tutucusuna yükleyin (Şekil 3B). Kullanılan contanın temiz olduğunu doğrulayın. Değilse, damıtılmış su ile hızla temizleyin. Temiz bir filtre kağıdı kullanarak kurutun. Contadaki kalıntıları ve lifleri gidermek için, iki sayfa parafilm arasına birden çok kez bastırın.
   2. Küçük E-çipi sıvı hücre tutucusuna koyun (Şekil 3C). SiN filmlerinin mikroskop vakuma doğru eğilmelerini azaltmak için sıvı hücrenin pencerelerini çapraz bir konfigürasyona yerleştirin. Bu nedenle, küçük E-çipin penceresi tutucunun uzunluğuna ve ön yüze paralel olmalıdır. Küçük E-çipin contanın içine iyi yerleştirildiğinden emin olun.
   3. Sıvı numuneyi hazırlayın (burada, suda 1 mM HAuCl_4).
   4. Bir mikropipette kullanarak küçük E-çip üzerindeki sıvı numunenin ≈2μL'sinibırakın ( Şekil 3D ). Küçük E-çip düzgün bir şekilde plazma temizlendiyse, sulu sıvı numune çipin yüzeyine eşit olarak yayılır.
   5. Ekstra sıvıyı bir filtre kağıdı ile çıkarın. Keskin bir şekilde kesilmiş bir filtre kağıdı parçasıyla, düz bir kubbe oluşturana kadar küçük E-çip üzerindeki sıvı tabakanın kalınlığını azaltın.
   6. Büyük E-çipi sıvı hücre tutucusuna koyun (Şekil 3E). Büyük E-çipi ön yüzü aşağı bakacak şekilde küçük olanın üzerine yerleştirin (iki çipin ön tarafları birbirine bakmalıdır). Büyük E-çip üzerindeki elektrotlar tutucudaki elektrot pediyle temas halinde olmalıdır.
   7. Kapağı sıvı hücre tutucusuna geri kaydırın. Her vidayı yavaş yavaş sıkın (Şekil 3F).
   8. Küçük kesme filtre kağıdı kullanarak E-çiplerden çıkan nihai sıvıyı kurutun. Sıvı hücre tutucusunu ekseni etrafında döndürerek sıvı hücrelerinin her iki tarafında sıvı çıkmadığını doğrulayın.
3. Sıvı hücrenin vakum sızdırmazlıkını bir pompa istasyonunda test edin. Pompanın vakum seviyesi 5 x 10^-2 Pa'ya ulaşırsa protokole devam edin. Değilse, pencerenin bütünlüğünü kontrol edin (büyük olasılıkla bozuk) ve protokolü baştan yeni bir E-yonga seti ile başlatın.
4. Dürbün büyüteci veya optik mikroskop kullanarak silikon nitrür penceresinin bütünlüğünü son bir kez doğrulayın. Bazen, sıvı hücre, pencere kırılsa bile pompa istasyonunun vakumunun sürdürülmesini sağlayacaktır. Bunun nedeni, pencere kırıldığında ve sıvı dışarı döküldüğünde, pencerenin kırık kısmında tuz agregaları oluşturabilmesi ve böylece deliği kaplamasıdır. Eğer olursa, yeni bir E-çip seti hazırlayın.
5. Sıvı hücre tutucuyu TEM'e yükleyin ve vakum seviyesini kontrol edin. Sıvı hücre pompa istasyonunun vakumlanmasını sağlasa ve pencerede gözle görülür bir sorun olmasa bile, sıvı hücrenin mikro sızıntısı TEM'i çalıştırmak için gereken vakum seviyesine ulaşmasını engelleyebilir. Mikroskop çalışmak için gerekli vakum seviyesine ulaşamazsa (2-5 x 10^-5 Pa), numune tutucuyu çıkarın ve yeni bir E-çip seti hazırlayın.

5. Sıvı tutucuyu akış modunda kullanın

1. Enjekte edilecek çözeltinin birkaç mililitresi ile 2 şırıngı doldurun (bizim durumumuzda suda 1 mM HAuCl_4).
2. Şırındlara 2 harici PEEK tüpü bağlayın. 2 şırınnayı şırınna pompalarına yerleştirin. Harici PEEK tüplerini sıvı hücre tutucusunun 2 girişine yerleştirin. Sıvı hücre tutucusunun çıkışı için bir harici PEEK tüpü daha takın.
3. Çözeltiyi her girişte 5 μL/ dk akış hızı ile enjekte edin.

6. Sıvı ortamın ısıtılması

1. Güç kaynağını tutucuya bağlayın. Güç kaynağını ısıtma yazılımının yüklü olduğu bilgisayara bağlayın.
2. Bilgisayarı açın ve Isıtma yazılımını açın. Güç kaynağını arttır.
3. Cihaz kontrol düğmesine tıklayın. Yazılım "geçti" ise deneme devam edebilir. Aksi takdirde, büyük E-çip bir sorun olabilir (E-çipin yanlış yüklenmesi, kırık elektrotlar...).
4. Deneme sekmesine tıklayın. Manuel ısıtma modunu etkinleştirmek için Manuel'e tıklayın.
5. Hedeflenen sıcaklığı seçin ve sıcaklık oranını buna göre değiştirin. E-çipleri hedeflenen sıcaklığa ısıtmak için uygulayın (Şekil 4).
   NOT: E-çipler 100 °C'ye kadar ısıtılabilir. Deney için sulu bir çözelti kullanılırsa (bizim durumumuzda olduğu gibi), E-çipleri 90 ° C'nin üzerinde ısıtmaktan kaçının. Aksi takdirde, sıvı numune kuruyabilir. Sıvıyı ısıtırken, sıcaklık geçici olarak hedeflenen sıcaklığın üzerine çıkabilir ve daha sonra istenen sıcaklığa geri dönebilir. Bu tür fazla çekimleri en aza indirmek için düşük ısıtma oranı kullanın (1 °C/s iyidir).
6. Ortam sıcaklığına (25 °C) geri dönmek için Ortam'a tıklayın. Isıtmayı aniden durdurmak için Durdur'a tıklayın. Isıtma denemesini sonlandırmak için Oturumu sonlandır sekmesine tıklayın.

7. Nanopartikül büyümesinin STEM görüntülemesi

1. HAADF dedektörünü kullanarak MIKROSkobu STEM modunda kullanın. Numunenin bozulmamış bir bölgesine, sıvı kalınlığının minimum olduğu gözlem penceresinin bir köşesine gidin. Sıvının farklı sıcaklıkları için nanopartikül büyüme videoları alın (Şekil 5).
   NOT: Altın nanopartiküller taranan alanda hemen görünür ve büyür. Saniyede bir görüntü kare hızına sahip video kaydı, iyi sinyal-gürültü oranı ve iyi bir zaman çözünürlüğü ile büyüme süreçlerini gözlemlemek için iyi bir uzlaşmadır.

8. Tek nanopartiküllerin STEM nanodiffaction

1. Birkaç nano nesnenin STEM HAADF görüntüsünü alın. STEMx yazılımını kullanarak görüntüde seçilen tek tek nanopartiküllerin kırınım desenini elde edin (Şekil 6).
   NOT: STEM nanodiffaction, büyüme deneyleri sırasında sıvıdaki tek nanopartiküllerin kırınım deseninin eldesini sağlayan bir tekniktir²².
2. Bir STEM HAADF görüntüsü elde edildikten sonra, görüntüdeki birkaç nano nesneyi seçin ve STEMx yazılımı, probun her konumunda kırınım desenini elde etmek için probun ve CCD kameranın konumunu otomatik olarak senkronize eder. Kırınım noktalarının üst üste bindirmesini önlemek için, küçük kondenser diyaframı (bizim durumumuzda 10 μm) kullanarak STEM probunun küçük bir yakınsama açısını (bizim durumumuzda 7,4 mrad) kullanın.

9. Sıvı hücre tutucusunun temizlenmesi (deneyden sonra)

NOT: Burada sıvı hücre tutucu için standart bir temizleme prosedürü açıklıyoruz. Bu temizlik yeterince verimli değilse, sıvı hücre tutucusunda nihai nanopartikül agregalarını temizlemek için seyreltilmiş nitrik asit ve metanol kullanmak mümkündür. Sıvı hücre tutucusunun kimyasal uyumluluk belgelerine daha önce başvurulmalıdır. Her durumda, temizliği her zaman damıtılmış su enjeksiyonu ile bitirin.

1. Kapağı çıkarın. Kullanılmış E-çipleri çıkarın. İç contayı çıkarın.
   NOT: Kullanılmış E-çipler uyarlanmış bir kutuda saklanabilir. Daha sonra sıvı hücre^15'iaçtıktan sonra SiN pencerelerine bağlı kalan nano nesnelerin ex situ TEM veya SEM analizlerini yapmak mümkündür. E-çiplerin başka bir yerinde deney için yeniden kullanımı tavsiye edilmez, ancak SiN filmi sıvı hücrenin mülaydi sırasında kırılmamışsa hala mümkündür. Daha sonra farklı bir çözücüde aşırı büyüme deneyleri yapılabilir. ²³
2. Sıvı hücre tutucusunun giriş ve çıkış borusuna 5 mL damıtılmış su enjekte edin.
3. Sıvı hücre tutucunun ucunu ultrasonik bir banyo kullanarak 20 dakika boyunca temizleyin. Temas pedi banyoya daldırılabilir. Sadece kapakla kaplı kısmı daldırın. Havalandırma deliklerini sıvıya batırmayın.
4. Sıvı hücre tutucuyu bir havalı tabanca kullanarak kurulayın.
5. Sahte sıvı hücrelerle kullanılan contayı yerine koyun. Sahte sıvı hücreleri ve kapağı yerine koyun.
6. Numune tutucuyu bir vakum istasyonunda saklayın.

10. Fiji (ImageJ) kullanarak deney sonrası analiz

NOT: Çekilen videonun her karesini tek görüntülere bölmeniz önerilir. Bu deney sonrası analiz adımının amacı, nanopartiküllerin orijinal videolarını Fiji tarafından analiz edilebilen ikili videolara dönüştürmektir. Arka plandaki nanopartiküllerin kontrastını arttırmak için ortanca bir filtre kullanılır (Şekil 7B ve 7E). Bu, videonun binarizasyonunu kolaylaştırmak için gereklidir.

1. Dosya | tıklayarak Fiji'deki videonun görüntülerini içeren dosya dizinini açın | al Görüntü sırası. Sıra seçenekleri penceresi açılır. Uygun başlangıç görüntüsünü seçin (videonun başlangıcı atılacaksa). Görüntü sırası için artış numarasını girin (STEM taramasının görüntünün altına ulaşması için gereken kare sayısına karşılık gelir). 8 bit gri tonlamalı dönüştürme kutusunu işaretleyin. Görüntü sırasını tiff biçiminde kaydedin.
2. Videodaki tüm istenmeyen eserleri kırpın (örneğin ölçek çubuğu veya sıvı hücre penceresinin kenarı).
3. İşlem | tıklayın Filtreler | Tüm görüntülere ortanca filtre uygulamak için ortanca. İşlenen görüntü sırasını tiff biçiminde kaydedin.
   NOT: Ortanca filtre için kullanılan yarıçapı soran bir pencere açılır. 2 piksel yarıçapı kullandık, ancak farklı parametreler kullanmaktan çekinmeyin. Fiji'de görüntü işlemeyi geliştirmek için kullanılabilecek diğer filtreler de mevcuttur. Özellikle, çıkarma arka plan algoritması, tekdüze değilse arka plan yoğunluğunu düz hale getirmek için kullanılabilir. Bunun için İşlem | Alt kanal arka planı. Bizim durumumuzda, bu işlem ilk görüntülerin arka planında yanlış nanopartiküller olarak yorumlanabilecek küçük beyaz yamalar oluşturur. Bu nedenle, bu işlemi kullanmadık, ancak diğer veri kümelerinde denenmelidir, çünkü köşeden sıvı hücrenin ortasına artan sıvı kalınlığı genellikle düşük büyütme LCTEM görüntülerinde homojen olmayan arka plan yoğunluğuna neden olur.
4. Resim | tıklayın | ayarlama Eşik. Yalnızca nanopartiküller kırmızı renklendirilene kadar binarizasyon eşiğinin daha iyi bir duyarlığı için el ile hareket edin. Uygula düğmesine basın. Yığını ikili pencereye dönüştür açılır. Her görüntü için eşiği hesapla seçeneğininişaretini kaldırın. İkili görüntü sırasını tiff biçiminde kaydedin (Şekil 7C ve 7F).
   NOT: Videonun her karesinde eşiğin tatmin edici olup olmadığını kontrol etmeniz önerilir.
5. Bu adımı yalnızca video sırasında nanopartiküllerin kontrast ters çevrilmesi varsa yapın. İşlem | tıklayın İkili | Genişlemek. Gerekirse bir kez daha yap. İşlem | tıklayın İkili | Dolgu Delikleri (Şekil 7G, tartışma bölümüne bakın).
6. Analiz | tıklayın Parçacıkları analiz edin. Deney sırasında gözlemlenen analiz edilen nanopartiküllerin boyut aralığını tanımlayın. Özetle 'yi denetleyin.
   NOT: En azından gözlenen nanopartiküllerin minimum boyutunu tanımlamak çok önemlidir. Bu olmadan, ikili görüntü dizisinde görünen küçük siyah noktalar (gürültü) nanopartiküller olarak kabul edilecektir. İlk deneme olarak, göz tarafından tanımlanan en küçük nanopartiküllerin boyutunu seçin, ancak daha sonra bu parametrenin etkisini anlamak ve otomatik veri analizini optimize etmek için bir deneme yanılma işlemi gereklidir (tartışma bölümüne bakın). Bu adımdan önce, nanopartiküllerin alanını almak için Analiz | Ölçümleri ayarlayın ve Alan 'ıkontrol edin. Diğer ölçümler mevcuttur.
7. Sonuçlar ve Özet pencerelerini kaydedin. Her kare için nanopartikül sayısı Özet veri penceresindedir.

Sonuçlar

Şekil 5, 25 °C ve 85 °C'de 80 saniyeden fazla elde edilen iki STEM HAADF görüntü serisi altın nanopartikül oluşumunu göstermektedir. Tüm bu deneylerde nanopartiküllerin çekirdeklenmesi ve büyümesi suyun radyolizi tarafından yönlendirilir. Bu elektron ışınlı indüklenen fenomenler tarafından üretilen kimyasal türler arasında, güçlü azaltıcı ajanlar (yani sulu elektronlar ve hidrojen radikalleri), SiN pencereleri ile sıvı arasındaki arayüzde altın nanokristal oluşumuna yol açan tetratraroaurik asidi azaltabilir. Aynı elektron doz oranı ile gerçekleştirilen bu iki yerinde gözlem, mevcut yöntemin sıcaklığın sıvı ortamda nanopartiküllerin oluşumu üzerindeki sert etkisini görselleştirmeye izin verdiğini doğrulamamaktadır. Düşük sıcaklıkta, küçük nanopartiküllerin çok yoğun bir montajının büyümesini gözlemlerken, yüksek sıcaklıkta birkaç büyük ve iyi yüzlü nanoyapı elde edilir. STEM HAADF görüntülerinin kontrastı altın nanopartikül kalınlığı ile orantılı olduğundan, bu büyüme deneyleri sırasında iki nesne popülasyonu oluştuğunu görebiliriz: üçgen veya altıgen şekilli ve daha düşük kontrastlı (Şekil 5'tekırmızı oklarla gösterilen) yüksek kontrastlı 3D nanopartiküller ve büyük 2D nanoyapılar.

Bu protokolde açıklanan video analiz yöntemi, gözlemlenen alandaki nanopartikül sayısını ve ortalama yüzey alanlarını zamanla ölçerek çekirdeklenme ve büyüme süreçlerini ölçmeye olanak tanır. Şekil 8'degörüldüğü gibi , düşük sıcaklıkta, gözlemin birkaç on saniye içinde 800'den fazla nanopartikül oluşurken, yüksek sıcaklıkta sadece 30 nanopartikül oluşur. İki üçgen ve altıgen nano plakanın yanı sıra, tüm nanopartiküller yüksek sıcaklık takibinin ilk görüntüsünde zaten mevcuttur. Şekil 9, nanopartiküllerin ortalama yüzey alanının 85 °C'de 25 °C'den 40 kat daha hızlı arttığını göstermektedir.

Şekil 6, tipik bir STEM görüntüsünü ve doğrudan görüntüde seçilen iki altın nanopartiküllerin kırınım desenini temsil eder (Şekil 6A'dakırmızı oklarla gösterilir). Burada, [001] (Şekil 6B) ve [112] ( Şekil 6C ) bölge eksenleri boyunca altın odaklı yüz merkezlikübik(FCC) yapısını tanımlayabiliriz.

Şekil 1: E-çiplerin şeması ve sıvı hücre tutucusunun ucu. (A) Sıvı hücreyi (üstte) ve küçük E-çipi (altta) ısıtmak için kullanılan dirençli büyük e-çip. (B) Her iki E-çip de sıvı hücre tutucusuna yüklenir. Büyük E-çipin elektrotları sıvı hücre tutucusunun elektrot pedleriyle temas halindedir. Büyük E-çipin direnci sıvı hücreyi ısıtabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Şekil 2: E-çiplerin optik mikroskop resimleri: (A) Deney için gerekli olan sağlam bir SiN penceresi. (B) E-Çipin kenarında hasarlı bir silikon gofret. Bu tip E-çipler, sıvı hücre kapatıldıktan sonra hasarlı alan ıslak alanın dışındaysa (yani hasar O-halkaları tarafından tanımlanan alanın dışındaysa) kullanılabilir. (C) E-çip yüzeyinde kalıntılar. Bu tür kalıntılar temizleme işlemlerini tekrar ettikten sonra ayrılmazsa (bkz. bölüm 4.1), E çipini kullanmayın. (D'den F'ye) Hasarlı SiN pencereler (kullanılamaz E-çipler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sıvı hücrenin TEM tutucusuna yüklenmesinin adım adım ilerleyene ait fotoğraflar. (A) Sadece numune tutucu. (B) Conta O-halkasını boşluğa koyun. (C) Küçük E-çipi conta O-halkalarına takın. (D) Küçük E-çiplere bir damla çözelti koyun. (E) Büyük E-çipi küçük olanın üzerine koyun. (F) Kapağı vidalayarak tüm sıvı hücreyi kapatın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sıvı hücrenin sıcaklığını kontrol eden ısıtma yazılımının ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Altın nanopartiküllerin büyümesinin düşük büyütmeLI STEM HAADF görüntü serisi. (A) 25 °C'de (B) 85 °C'de. İlgili saat, her görüntünün sol alt köşesinde gösterilir. 2D nanoyapılar kırmızı oklarla gösterilir. Tüm görüntüler 3.4 elektron·s^-1·nm^-2aynı elektron doz oranı ile elde edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Tek nanopartiküllerin STEM nanodiffaction.. (A) Dağıtıcı nanopartikülleri seçmek için kullanılan STEM görüntüsü (kırınım alımları sırasında probun konumları kırmızı oklarla gösterilir). (B,C) Seçilen iki nanopartiküllerin kırınım deseni. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Fiji kullanılarak STEM HAADF görüntülerinin veri işleme ve analizi. Görüntüler büyümenin başlamasından 40 saniye sonra elde edildi. (A'dan C'ye) Görüntü 25 °C'de elde edildi (D'den G'ye) Görüntü 85 °C'de elde edildi(A,D) Raw STEM görüntüsü. (B,E) İşlenen görüntü (ortanca filtre). (C,F) İkili görüntü. (G) Piksellerin genişlemesi iki kez uygulanır ve daha sonra "Delikleri doldur" işlemi uygulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: 25 °C ve 85 °C'de zamanın bir fonksiyonu olarak altın nanopartikül sayısını temsil eden grafik. 25°C'deki iki eğri, 20 (kırmızı) ve 50 (mavi) piksel 2'lik minimum algılama boyutu (S_dk)ile otomatik olarak^ölçülür. 12 ve 60 saniye sonra ölçülen yeşil noktalar, 25 °C'de elde edilen videoda manuel olarak sayılan nanopartikül sayısını temsil eder.

Şekil 9: 25 °C ve 85 °C için zamanın bir fonksiyonu olarak altın nanopartiküllerin ortalama yüzey alanını temsil eden grafikler. Yeşil noktalar, 85 ° C'de elde edilen videonun belirli zaman noktalarında nanopartiküllerin ortalama alanının manuel ölçümlerini temsil eder.

Şekil 10: 85 °C'de tek altın nanokübenin büyümesinin yüksek büyütme STEM HAADF görüntü serisi. Bu görüntü serisi 83.6 elektron.s^-1.nm^-2elektron doz oranı ile elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Açıklanan protokol, radyoliz tarafından tahrik edilen altın nanopartiküllerin sıcaklık kontrollü bir sıvı ortamda çekirdeklenmesi ve büyümesini sağlar. Otomatik video işleme ile birlikte, sıcaklığın nanopartiküllerin yoğunluğu, boyutu, şekli ve atomik yapısı gibi nanopartikül sentezinin temel parametreleri üzerindeki etkisini ölçmeye izin verir. Bu değerli girdiler, sıcaklığın çekirdeklenme ve büyüme oranları üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine, olası faz geçişlerinin tespit edilmesine ve kolloidal çözümlerin nihai sonucunu belirleyen yönlü süreçlerin görselleştirilmesine olanak sağlar. Reaktif ortamın bileşimini kontrol etme imkanı ile birlikte, sıcaklık kontrollü sıvı hücre TEM, çeşitli nanoyapıların çekirdeklenme ve büyüme süreçlerinin gerçekçi sentez koşullarında doğrudan gözlemlenmesine yönelik bir başka adımdır. Bu makalede sunulan sonuçların yorumlanması ve çekirdeklenme ve büyüme modelleri ile karşılaştırılması başka bir yerde tartışılacaktır. Burada, ilgili yerinde TEM deneylerini yapmak için dikkat edilmesi gereken birkaç metodolojik yönü vurgulamak istiyoruz.

Her şeyden önce, reaksiyon medyasındaki elektron ışını etkilerini tanımlamak çok önemlidir, çünkü deneyin sonuçlarını büyük ölçüde etkileyebilirler. Burada, su radyolizi nanopartikül oluşumunun itici gücü olduğundan, nano nesnelerin son şeklini etkileyecek elektron doz oranı ile büyüme hızı hızla artar^11,15. Bu nedenle, sıcaklığın nanopartiküllerin çekirdeği ve büyümesi üzerindeki etkilerini incelemek için, aynı elektron doz oranı ile elde edilen büyüme deneylerini karşılaştırmak gerekir. STEM modunda, elektron doz oranı görüntü boyutuna bölünen ışın akımına (saniyede elektron olarak) karşılık gelir (nm^2'de). Bu nedenle, sabit bir elektron doz oranı, her deney için aynı ışın akımını (yani aynı kondenser diyaframı ve aynı nokta boyutunu) ve aynı büyütmeyi korumayı ima eder. Bir CCD kamera veya Faraday kabı kullanarak görüntüleme koşullarının ışın akımını ölçmek, verileri yorumlamak ve çoğaltmak için önemlidir. Büyütme ve elde edilen doz oranı, büyüme kinetiği üzerinde istatistiksel olarak ilgili sonuçlar çıkarmak için büyük bir nanopartikül montajının büyümesini görselleştirmek isteyip istemediğine göre seçilmelidir (Şekil 5) veya nanopartikül yüzeylerindeki tercihli adsorpsiyon bölgelerini tanımlamak için tek nanopartikül ölçeğindeki büyüme mekanizmaları (Şekil 10). Çekirdeklenme ve büyüme süreçleri çok hızlıysa, özellikle yüksek büyütmede, doz oranını en aza indirmek için küçük kondenser diyaframı ve küçük nokta boyutu seçilmelidir. Nanopartiküllerin çekirdeklenmesi ve büyümesi, analiz edilen çözeltideki metal öncüsü konsantrasyonunu azaltarak da yavaşlayabilir, ancak radyolitik ürünlerin konsantrasyonunun sıcaklıkla birlikte artacağına dikkat edin. Genel olarak, tüm numunenin elektron ışınlama geçmişini de dikkate almak önemlidir. Burada, örneğin, birbirine yakın bölgelerde birkaç büyüme deneyi hızla yapılırsa, çalışılan alandaki altın öncüllerin konsantrasyonu azaldığı için nanopartiküllerin yoğunluğu zamanla azalacaktır. Bu etki, hem uzay ve zamandaki büyüme deneylerini ayırarak hem de sıvı tutucu akış modunda kullanılarak en aza indirilebilir.

Arayüz izleme algoritmaları, videoların analizini otomatikleştirmek ve büyük nanopartikül montajlarının çekirdeklenmesi ve büyümesi hakkında nicel sonuçlar çıkarmak için son derece yararlıdır. Bununla birlikte, görüntü binarizasyon adımının her zaman veriye özgü olduğunu belirtmek gerekir, yani nanopartikül / sıvı arayüzünün algılanmasını optimize etmek için görüntülere uygulanması gereken filtreler ve veri işleme bir denemeden diğerine değişecektir. Ayrıca, görüntü işleme iş akışını optimize etmek ve sınırlamalarını bilmek için bu otomatik analizlerin sonuçlarını birkaç görüntüde gerçekleştirilen manuel ölçümlerle karşılaştırmak önemlidir. Burada, örneğin, yüksek sıcaklıkta oluşan giderek daha kalın hale gelen 3D nanopartiküllerdeki birden fazla saçılma olayı, 30 saniyelik gözlemden sonra çekirdeklerinin kontrast tersine çevrilmesine neden olur, çünkü dağınık elektronların açısal genişlemesi, toplanan sinyalin açısal aralığında bir azalmaya neden olur. Bu nanopartiküllerin gerçek yüzey alanını ölçmeye devam etmek için, halka şekli kontrastlarının iç dairesini dolduran görüntünün binarizasyonu sonrasında bir "dolgu delikleri" veri işlemi kullandık (Şekil 7F,G). Ancak, bu halka şekli kontrastlarının her zaman tamamen bağlı olduğundan emin olmak için nesnelerin küçük bir genişlemesini kullanmak zorunda kaldık. Bu ikinci adım, otomatik ölçümlerde nanopartiküllerin ortalama yüzey alanının hafifçe aşırı değerlenmesine yol açar (Şekil 9). Benzer şekilde, nanopartiküllerin tespiti için, gürültüyü algılamamak için tespit edilen nesnelerin (S_mim)minimum boyutunu tanımlamamız gerekir, ancak bu parametre ölçülen çekirdeklenme oranını etkiler. Şekil 8'degörüldüğü gibi, tespit edilen nanopartiküllerin sayısı bir platoya ulaşmak için deneyin başında artar. S_min büyük olduğunda (50 piksel² 1543 nm^2'yekarşılık gelen), otomatik ve manuel ölçümler bu platonun seviyesi üzerinde anlaştı (60 saniye sonra 835 nanopartikül) ancak nanopartiküllerin tespiti otomatik analizde gecikir, çünkü 835 nanopartikül sadece 12 s'den sonra manuel olarak sayılır, ancak daha sonra otomatik olarak algılanmaz. Bu uzun algılama süresi çekirdeklenme oranının düşük değerlenmesine yol açar. S_min'i 20 piksel^2'ye (yani 617 nm^2)'yedüşürmek nanopartikül montajının çekirdeklenme süresindeki hatayı azaltır, ancak özellikle deneylerin erken aşamasında nanopartikül yoğunluğunun aşırı değerlenmesine yol açar (Şekil 8) bu da çekirdeklenme oranını etkiler. Çok dinamik bir davranışa ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip nano nesnelerin tespiti ve boyut ve şekil ölçümleri, sıvı fazLı TEM'de diğer segmentasyon ve denoising yöntemleri²⁴ veya makine öğrenimi yaklaşımları²⁵kullanılarak daha da geliştirilebilen yaygın bir zorluktur.

Son olarak, reaksiyon ortamlarının kirlenmesini önlemek için sıvı hücrenin hazırlanması ve sıvı tutucunun temizlenmesi çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

Genel olarak, LCTEM analizleri sırasında numunenin sıcaklığını kontrol etmek, katı maddeler ve sıvılar arasındaki arayüzde meydana gelen kimyasal reaksiyonlar üzerindeki termal etkileri araştırma fırsatı sağlar. Bu nedenle, mevcut yöntemin, sıcaklık kontrollü sıvı ortamda sert, yumuşak veya biyolojik malzemelerin dinamiklerini ortaya çıkarmak için tasarlanmış diğer yerinde TEM deneylerine yol açmasını umuyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Plus electron microscope	Jeol
Acetone	Merck
Air pistol
ARM 200F electron microscope	Jeol
Binoculars or optical microscope
Carbon tipped tweezers
Computer with heating software	Software by Protochips
Distlilled water
Dummy e-chips	Protochips
Gasket/O-rings	Protochips
Gold aqueous solution	Merck		1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand
Large liquid heating E-chip	Protochips
Methanol	Merck
One View camera	Gatan
Petri dish			Number : 2
Plasma cleaner	Gatan
Poseidon Select	Protochips		Liquid cell holder
Power supply Keithley 2450
Protective gloves
Red PEEK tubing			Number : 3
Screwdriver with torque
Small liquid E-chip	Protochips		150 nm spacers
STEM HAADF detector	Jeol
STEMx software	Gatan
Syringe			Number : 2
Syringe pump	Harvard apparatus		Number : 2
Vacuum pump	Gatan