Étude des effets de la température sur la nucléation et la croissance des nanoparticules par microscopie électronique à transmission à cellules liquides

Résumé

Le contrôle de la température lors d’expériences de microscopie électronique en phase liquide ouvre de nouvelles perspectives d’étude de la dynamique des nanoparticules dans des environnements liquides imitant leur formation ou leur milieu d’application. En utilisant des cellules liquides chauffantes récemment développées, nous avons directement observé l’influence de la température sur les processus de nucléation et de croissance des nanoparticules d’or dans l’eau.

Résumé

Le contrôle de la température est un développement récent qui offre un degré supplémentaire de liberté pour étudier la nanochimie par microscopie électronique à transmission de cellules liquides. Dans cet article, nous décrivons comment préparer une expérience de chauffage in situ pour étudier l’effet de la température sur la formation de nanoparticules d’or entraînées par radiolyse dans l’eau. Le protocole de l’expérience est assez simple impliquant une cellule liquide spéciale avec des capacités de chauffage uniformes jusqu’à 100 ° C, un support TEM à cellule liquide avec des capacités d’écoulement et une interface intégrée pour contrôler la température. Nous montrons que les mécanismes de nucléation et de croissance des nanoparticules d’or sont considérablement impactés par la température dans les cellules liquides. Grâce à l’imagerie STEM et à la nanodiffraction, l’évolution de la densité, de la taille, de la forme et de la structure atomique des nanoparticules en croissance est révélée en temps réel. Les algorithmes de traitement automatisé d’images sont exploités pour extraire des données quantitatives utiles de séquences vidéo, telles que la nucléation et les taux de croissance des nanoparticules. Cette approche fournit de nouvelles entrées pour comprendre les processus physico-chimiques complexes en jeu lors de la synthèse en phase liquide des nanomatériaux.

Introduction

Les nanoparticules métalliques (NPs) ont des propriétés physico-chimiques prometteuses qui peuvent être utilisées dans divers domaines tels que la détection optique^1,la médecine² ou l’énergie^3. La synthèse chimique humide est une méthode très polyvalente pour fabriquer des IP métalliques avec une taille et une forme bien définies. Au cours des dernières décennies, de nombreuses stratégies ont été développées pour prendre le contrôle de la synthèse des IP : croissance médiée par les graines^4,méthode de blocage de face^5,synthèse à commande^{cinétique 6,}gravure sélective⁷ ou synthèse à température contrôlée^8. Cependant, alors que les réactions chimiques à l’origine de la synthèse sont assez simples, les mécanismes de nucléation et de croissance ne le sont pas, car de nombreux paramètres jouent un rôle dans les processus de formation et leur influence individuelle est difficile à récupérer à partir d’instantanés ex situ des nanomatériaux résultants extraits de leur milieu de formation à des points de temps donnés de la synthèse. Pour vraiment comprendre les processus de nucléation et de croissance et établir des moyens de les contrôler, nous devons utiliser des outils in situ qui permettent leur observation en temps réel dans un environnement liquide finement contrôlé.

À cet égard, la microscopie électronique à transmission à cellules liquides (LCTEM) a été une méthode très puissante pour jetant un nouvel éclairage sur la synthèse de nanoparticules métalliques^{9,10,11,12,13.} Enimageant la dynamique des nanostructures individuelles directement dans leurs milieux de formation liquide, cette technique a permis une compréhension plus approfondie des mécanismes de nucléation et de croissance, notamment le rôle des défauts cristallins, de la morphologie des graines et des ligands organiques qui permettent de piloter des processus de croissance directionnelle ou de gravure et d’obtenir des nanomatériaux de formes spécifiques (nanotiges, nanostars, nanoplaques, nanocoques, nanocoques)^{10,11, 12,13, 14,15,16,17,18,19.} Lorsque le faisceau d’électrons d’un TEM interagit avec des liquides, les processus de radiolyse produisent de fortes espèces réductrices et oxydantes qui modifient la chimie de la solution dans la zone irradiée et peuvent être utilisées pour stimuler les processus de croissance ou de gravure. Fait intéressant, la concentration de produits radiolytiques est connue pour augmenter avec le débit de dose électronique, un paramètre qui peut être finement réglé dans un microscope électronique²⁰. Par conséquent, cette dépendance du débit de dose de la radiolyse a été exploitée pour contrôler la vitesse de réaction et révéler des effets cinétiques sur les processus de formation et la morphologie finale des nanostructures^11,15,20.

Bien que la température soit un paramètre crucial dans la synthèse des nanomatériaux, ses effets n’ont jusqu’à présent pas été soigneusement étudiés par LCTEM, car les cellules liquides commerciales avec un contrôle fiable de la température n’ont été développées que récemment. Pourtant, de telles études in situ sont indispensables pour démêler les effets cinétiques et thermodynamiques complexes induits par les changements de température. En effet, d’une part, l’augmentation de la température a des impacts drastiques sur les processus de facettage au cours de la croissance, accélère la diffusion atomique et moléculaire dans le liquide et modifie les vitesses de réaction. D’autre part, le diagramme en nanophases des nanostructures est également très sensible à la température. Dans cet article, nous exploitons les cellules liquides chauffantes récemment développées pour suivre la croissance radiolytique des nanoparticules d’or dans l’eau avec un contrôle de température entre la température ambiante et 100 °C. Cette méthodologie combinant l’imagerie STEM et la diffraction dans un environnement de plus en plus proche des conditions réelles de synthèse réduit l’écart entre les observations TEM in situ et les synthèses à l’échelle du banc d’essai.

Protocole

1. Aligner le microscope électronique à transmission pour l’imagerie STEM HAADF

1. Suivez les instructions du fabricant pour l’alignement du microscope.
2. Utilisez un échantillon séché conventionnel pour aligner le microscope. N’utilisez pas d’échantillon liquide.
3. Pour minimiser la vitesse de croissance, minimisez le débit de dose électronique (voir la section discussion), ce qui implique d’utiliser une petite ouverture de condensateur et une petite taille de point pour réduire le courant du faisceau.

2. Manipulation des puces électroniques

REMARQUE: Les supports de liquide commerciaux s’adaptent à presque tous les TEM, mais utilisent le support qui est spécifiquement conçu pour la marque de microscope et la pièce de pôle. Une cellule liquide est constituée de deux puces de silicium à base de MEMS appelées puces électroniques, qui sont toutes deux des substrats de silicium avec une fenêtre de 500 x 50 μm recouverte d’un film de nitrure de silicium amorphe (SiN) de 50 nm d’épaisseur transparent par électrons(Figure 1A). Ces deux puces électroniques ont des tailles différentes. Le petit est de 2 x 2 mm avec des entretoises en or qui fixent la distance entre les deux puces E (150 nm ici) et l’épaisseur du liquide. Le grand mesure 4 x 6 mm et présente une résistance intégrée à l’intérieur du substrat de silicium qui permet un chauffage uniforme de l’échantillon liquide(figure 1B). En raison de la façon dont ils sont fabriqués dans les salles blanches, les puces électroniques ont deux côtés différents: l’un où la fenêtre semble petite (ici après appelé la face avant) et l’autre où la fenêtre est grande avec une forme d’évier (ici après appelé la face arrière).

1. Lorsque vous manipulez les puces électroniques, ne touchez jamais la fenêtre avec une pince à épiler et saisissez les puces par les côtés. Pour éviter de gratter la surface du substrat de silicium, utilisez une pince à épiler à pointe de carbone.
2. Si vous placez une puce électronique sur une surface, assurez-vous que la face arrière est en contact avec la surface car le film SiN est fragile et qu’il est déposé sur la face avant.

3. Nettoyage du support de cellule liquide (avant l’expérience)

1. Retirez le couvercle recouvrant la pointe du support. Retirez les cellules liquides factices à l’aide d’une pince à épiler. Retirez le joint utilisé avec les cellules liquides factices.
   REMARQUE: Les cellules liquides factices sont des cellules liquides sans la fenêtre SiN et uniquement du silicium. Ils sont utilisés pour stocker le support de cellule liquide dans la pompe à vide. Faites attention à l’état des vis en laiton car elles s’effritent facilement au fil du temps. En particulier, si les têtes de vis sont endommagées, les vis doivent être changées. Sinon, il peut être difficile de les dévisser après l’expérience et de petits débris peuvent également perturber le chargement de l’échantillon.
2. Injectez manuellement 2 mL d’eau distillée à l’intérieur du support à l’aide de seringues et du tube PEEK externe pour se connecter à l’arrière du support.
   REMARQUE: Il y a 3 tunnels microfluidiques à l’intérieur du support. Tous les trois doivent être nettoyés avec de l’eau. Faites attention à l’eau qui sort de l’avant du support: si l’eau est colorée en raison d’une expérience précédente, continuez à mettre de l’eau à l’intérieur du support jusqu’à ce que le liquide ne soit pas coloré.
3. Si vous injectez une solution dans la cellule liquide pendant l’expérience (1 mM de HAuCl4 dans l’eau dans notre cas), remplissez le tube du porte-échantillon avec cette solution.
4. Séchez la pointe du support de cellules liquides à l’aide d’un pistolet à air comprimé.

4. Préparation de la cellule liquide (E-chips)

1. Nettoyage des cellules liquides.
   1. Remplissez une boîte de Petri en verre avec de l’acétone.
   2. Remplissez une boîte de Petri en verre avec du méthanol.
      ATTENTION: En raison de la toxicité du méthanol, la boîte de Petri avec du méthanol doit être mise sous une hotte. Le méthanol doit être manipulé avec l’équipement de protection adéquat (gants).
   3. Mettez une petite et une grande puce électronique dans la boîte de Pétri avec de l’acétone et attendez 2 minutes.
      REMARQUE: Les puces électroniques sont recouvertes d’une couche protectrice qui doit être retirée avant l’expérience. L’acétone enlèvera la photorésine et nettoiera les puces électroniques des débris. Pour améliorer le nettoyage, la solution peut être doucement agitée.
   4. Mettez les deux puces électroniques dans la boîte de Pétri avec du méthanol et attendez 2 minutes. Le méthanol nettoiera les puces électroniques de l’acétone et du reste des débris.
      ATTENTION : Le transfert des E-puces entre l’acétone et le méthanol doit se faire le plus rapidement possible afin de ne pas laisser les E-puces se dessécher dans l’air.
   5. Séchez les cellules liquides à l’aide d’un pistolet à air comprimé. Tenez la puce électronique à l’aide d’une pince à épiler tout en utilisant le pistolet à air comprimé. Veillez à ne pas trop appuyer sur la gâchette du pistolet à air comprimé sinon la puce électronique peut tomber de la pince à épiler. S’ils abandonnent, redémarrez le nettoyage avec de l’acétone et du méthanol.
   6. Vérifier l’intégrité de la fenêtre en nitrure de silicium à l’aide d’une loupe binoculaire ou d’un microscope optique(Figure 2).
      Remarque : Assurez-vous que les fenêtres des deux puces électroniques sont propres et non cassées. Si les puces électroniques ne semblent pas propres, essayez de les remettre dans l’acétone et le méthanol. Si la saleté est toujours sur la fenêtre ou si la fenêtre est cassée, les puces électroniques doivent être changées avec de nouvelles.
   7. Le plasma nettoie les puces électroniques avec un mélange d’argon et d’oxygène gazeux pendant 2 minutes. Le nettoyage au plasma des puces électroniques leur permet d’être hydrophiles. Voici les détails de la configuration du nettoyage du plasma: débit d’argon gazeux = 35 sccm, débit d’oxygène gazeux = 11,5 sccm, délai d’expiration du débit de gaz = 20 s, cible RF avant = 50 W, plage RF avant = 5 W, RF réfléchi maximum = 5 W.
2. Chargement des cellules liquides dans le support TEM(figure 3).
   1. Chargez les joints toriques du joint à l’intérieur du support de cellule liquide(Figure 3B). Vérifiez que le joint utilisé est propre. Sinon, nettoyez-le rapidement avec de l’eau distillée. Séchez-le à l’aide d’un papier filtre propre. Pour enlever les débris et les fibres sur le joint, appuyez-le plusieurs fois entre deux feuilles de parafilm.
   2. Placez la petite puce électronique à l’intérieur du support de cellule liquide(Figure 3C). Pour réduire l’arc des films sin vers le vide du microscope, placez les fenêtres de la cellule liquide dans une configuration croisée. Par conséquent, la fenêtre de la petite puce électronique doit être parallèle à la longueur du support et de la face avant vers le haut. Assurez-vous que la petite puce électronique est bien insérée à l’intérieur du joint.
   3. Préparer l’échantillon liquide (ici, 1 mM de HAuCl4 dans l’eau).
   4. Déposez ≈2 μL de l’échantillon liquide sur la petite puce électronique à l’aide d’une micropipette(figure 3D). Si la petite puce électronique a été correctement nettoyée au plasma, l’échantillon liquide aqueux se répartira uniformément à la surface de la puce.
   5. Retirez le liquide supplémentaire avec un papier filtre. Avec un morceau de papier filtre fortement coupé, réduisez l’épaisseur de la couche liquide sur la petite puce électronique jusqu’à ce qu’elle forme un dôme plat.
   6. Placez la grosse puce électronique à l’intérieur du support de cellule liquide(Figure 3E). Placez la grande puce électronique sur la petite avec sa face avant vers le bas (les côtés avant des deux puces doivent se faire face). Les électrodes de la grande puce électronique doivent être en contact avec le tampon d’électrodes sur le support.
   7. Faites glisser le couvercle vers l’arrière sur le support de la cellule liquide. Serrez progressivement chaque vis(Figure 3F).
   8. Séchez le liquide éventuel sortant des puces électroniques à l’aide de petit papier filtre découpé. Vérifiez qu’il n’y a pas de liquide qui sort des deux côtés des cellules liquides en faisant pivoter le support de la cellule liquide autour de son axe.
3. Tester l’étanchéité sous vide de la cellule liquide dans une station de pompage. Si le niveau de vide de la pompe atteint 5 x 10^-2 Pa, continuez le protocole. Sinon, vérifiez l’intégrité de la fenêtre (elle est probablement cassée) et démarrez le protocole depuis le début avec un nouvel ensemble de puces électroniques.
4. Vérifiez une dernière fois l’intégrité de la fenêtre en nitrure de silicium à l’aide d’une loupe binoculaire ou d’un microscope optique. Parfois, la cellule liquide sera capable de supporter le vide de la station de pompage même si la fenêtre est cassée. En effet, lorsque la fenêtre se brise et que le liquide se déverse, il peut former des agrégats de sel sur la partie cassée de la fenêtre, couvrant ainsi le trou. Si cela se produit, préparez un nouvel ensemble de puces électroniques.
5. Chargez le porte-cellule liquide dans le TEM et vérifiez le niveau de vide. Même si la cellule liquide a subi le vide de la station de pompage et qu’il n’y a pas de problème visible avec la fenêtre, une micro-fuite de la cellule liquide peut empêcher d’atteindre le niveau de vide requis pour faire fonctionner la TEM. Si le microscope ne peut pas atteindre le niveau de vide requis pour fonctionner (2-5 x 10^-5 Pa), retirez le porte-échantillon et préparez un nouvel ensemble de puces électroniques.

5. Utilisez le support de liquide en mode d’écoulement

1. Remplissez 2 seringues avec quelques millilitres de la solution à injecter (1 mM de HAuCl₄ dans l’eau dans notre cas).
2. Connectez 2 tubes PEEK externes aux seringues. Placez les 2 seringues sur les pompes à seringues. Insérez les tubes PEEK externes dans les 2 entrées du support de cellule liquide. Insérez un tube PEEK externe supplémentaire pour la sortie du support de cellule liquide.
3. Injecter la solution avec un débit de 5 μL/min dans chaque entrée.

6. Chauffage de l’environnement liquide

1. Connectez le bloc d’alimentation au support. Connectez l’alimentation électrique à l’ordinateur sur lequel le logiciel de chauffage est installé.
2. Mettez l’ordinateur sous tension et ouvrez le logiciel de chauffage. Mettez le bloc d’alimentation sous tension.
3. Cliquez sur le bouton de vérification de l’appareil. Si le logiciel indique « réussi », l’expérience peut continuer. Sinon, la grosse puce E pourrait avoir un problème (chargement incorrect de la puce E, électrodes cassées...).
4. Cliquez sur l’onglet Expérience. Cliquez sur Manuel pour activer le mode manuel de chauffage.
5. Sélectionnez la température ciblée et modifiez en conséquence le taux de température. Appuyez sur appliquer pour chauffer les puces électroniques à la température ciblée(Figure 4).
   REMARQUE: Les puces électroniques peuvent être chauffées jusqu’à 100 ° C. Si une solution aqueuse est utilisée pour l’expérience (comme dans notre cas), évitez de chauffer les puces électroniques au-dessus de 90 °C. Sinon, l’échantillon liquide peut se dessécher. Lors du chauffage du liquide, la température peut temporairement dépasser la température ciblée, puis retomber à la température souhaitée. Utilisez un faible taux de chauffage pour minimiser ces dépassements (1 °C/s, c’est bien).
6. Cliquez sur Ambiant pour revenir à la température ambiante (25 °C). Cliquez sur Arrêter pour arrêter brusquement le chauffage. Cliquez sur l’onglet Fin de session pour mettre fin à l’expérience de chauffage.

7. Imagerie STEM de la croissance des nanoparticules

1. Utilisez le microscope en mode STEM à l’aide du détecteur HAADF. Accédez à une zone vierge de l’échantillon, près d’un coin de la fenêtre d’observation où l’épaisseur du liquide est minimale. Acquérir des vidéos de la croissance des nanoparticules pour différentes températures du liquide (Figure 5).
   REMARQUE: Les nanoparticules d’or apparaissent immédiatement et se développent dans la zone numérisée. L’enregistrement vidéo avec une fréquence d’images d’une image par seconde est un bon compromis pour observer les processus de croissance avec un bon rapport signal/bruit et une bonne résolution temporelle.

8. Nanodiffraction STEM de nanoparticules uniques

1. Acquérir une image STEM HAADF de plusieurs nano-objets. Acquérir le motif de diffraction des nanoparticules individuelles sélectionnées sur l’image à l’aide du logiciel STEMx (Figure 6).
   NOTE: La nanodiffraction STEM est une technique qui permet d’acquérir le modèle de diffraction de nanoparticules uniques dans un liquide lors d’expériences de croissance^22.
2. Après l’acquisition d’une image STEM HAADF, sélectionnez plusieurs nano-objets sur l’image et le logiciel STEMx synchronise automatiquement la position de la sonde et de la caméra CCD pour acquérir le motif de diffraction à chaque position de la sonde. Pour éviter le chevauchement des taches de diffraction, utilisez un petit angle de convergence de la sonde STEM (7,4 mrad dans notre cas) en utilisant une petite ouverture de condensateur (10 μm dans notre cas).

9. Nettoyage du support de cellule liquide (après l’expérience)

REMARQUE: Nous décrivons ici une procédure de nettoyage standard pour le support de cellule liquide. Si ce nettoyage n’est pas assez efficace, il est possible d’utiliser de l’acide nitrique dilué et du méthanol pour éliminer les éventuels agrégats de nanoparticules dans le support de la cellule liquide. La documentation sur la compatibilité chimique du support de cellule liquide doit être consultée avant. Dans tous les cas, terminez toujours le nettoyage avec l’injection d’eau distillée.

1. Retirez le couvercle. Retirez les puces électroniques usagées. Retirez le joint interne.
   REMARQUE: Les puces électroniques utilisées peuvent être stockées dans une boîte adaptée. Il est alors possible d’effectuer des analyses TEM ou MEB ex situ des nano-objets qui sont restés attachés aux fenêtres du SiN après le descellement de la cellule liquide^15. Il n’est pas conseillé de réutiliser les puces électroniques pour une autre expérience in situ, mais cela est toujours possible si le film SiN n’a pas été cassé lors du descellement de la cellule liquide. Des expériences de surcroissance dans un solvant différent peuvent alors être effectuées. ^{23 ans}
2. Injecter 5 mL d’eau distillée dans le tube d’entrée et de sortie du support de cellule liquide.
3. Nettoyez la pointe du support de cellule liquide à l’aide d’un bain à ultrasons pendant 20 minutes. Le tampon de contact peut être immergé dans le bain. N’immerger que la partie recouverte du couvercle. Ne pas immerger les trous d’aération dans le liquide.
4. Séchez le support de cellule liquide à l’aide d’un pistolet à air comprimé.
5. Remettez le joint utilisé avec les cellules liquides factices. Remettez les cellules liquides factices et le couvercle.
6. Entreposer le porte-échantillon dans une station de vide.

10. Analyse post-expérience à l’aide de Fidji (ImageJ)

REMARQUE: Il est recommandé de diviser chaque image de la vidéo prise en images uniques. Le but de cette étape d’analyse post-expérience est de transformer les vidéos originales des nanoparticules en vidéos binaires qui peuvent être analysées par Fidji. Un filtre médian est utilisé afin d’améliorer le contraste des nanoparticules sur le fond(figures 7B &7E). Ceci est essentiel pour faciliter la binarisation de la vidéo.

1. Ouvrez le répertoire de fichiers contenant les images de la vidéo sur Fidji en cliquant sur Fichier | Importer des | Séquence d’images. La fenêtre des options de séquence s’affiche. Sélectionnez l’image de départ appropriée (si le début de la vidéo doit être ignoré). Entrez le numéro d’incrément de la séquence d’images (il correspond au nombre d’images qu’il faut pour que l’analyse STEM atteigne le bas de l’image). Cochez la case Convertir en niveaux de gris 8 bits. Enregistrez la séquence d’images au format tiff.
2. Recadrez tous les artefacts indésirables de la vidéo (par exemple, la barre d’échelle ou le bord de la fenêtre de cellule liquide).
3. Cliquez sur traiter | Filtres | Médiane pour appliquer un filtre médian sur toutes les images. Enregistrez la séquence d’images traitées au format tiff.
   Remarque : une fenêtre apparaîtra demandant le rayon utilisé pour le filtre médian. Nous avons utilisé un rayon de 2 pixels mais n’hésitez pas à utiliser différents paramètres. D’autres filtres sont également disponibles aux Fidji qui pourraient être utilisés pour améliorer le traitement de l’image. En particulier, l’algorithme de soustraction d’arrière-plan peut être utilisé pour rendre l’intensité d’arrière-plan plate si elle n’est pas uniforme. Pour cela, cliquez sur Traiter | Arrière-plan substract. Dans notre cas, ce processus crée de petites taches blanches en arrière-plan des premières images qui peuvent être interprétées comme de fausses nanoparticules. Ainsi, nous n’avons pas utilisé ce processus, mais il devrait être essayé sur d’autres ensembles de données, car l’épaisseur croissante du liquide du coin au centre de la cellule liquide induit généralement une intensité de fond non uniforme sur les images LCTEM à faible grossissement.
4. Cliquez sur Image | Ajuster | Seuil. Déplacez-vous manuellement pour une meilleure précision du seuil de la binarisation jusqu’à ce que seules les nanoparticules soient colorées en rouge. Appuyez sur le bouton Appliquer. La fenêtre Convertir la pile en binaire s’affiche. Décochez la case Calculer le seuil pour chaque image. Enregistrez la séquence d’images binaires au format tiff (Figures 7C &7F).
   REMARQUE: Il est recommandé de vérifier si le seuil est satisfaisant sur chaque image de la vidéo.
5. Effectuez cette étape uniquement s’il y a une inversion de contraste des nanoparticules pendant la vidéo. Cliquez sur traiter | | binaires Dilate. Faites-le une fois de plus si nécessaire. Cliquez sur traiter | | binaires Trous de remplissage (Figure 7G, voir la section de discussion).
6. Cliquez sur Analyser | Analyser les particules. Définir la gamme de tailles des nanoparticules analysées observées au cours de l’expérience. Cochez l’article Synthétiser.
   REMARQUE: Il est très important de définir au moins la taille minimale des nanoparticules observées. Sans cela, les petits points noirs (bruit) qui apparaissent dans la séquence d’images binaires seront considérés comme des nanoparticules. Dans un premier temps, choisissez la taille des plus petites nanoparticules identifiées par l’œil nu, mais un processus d’essais et d’erreurs est nécessaire pour comprendre l’effet de ce paramètre et optimiser l’analyse automatisée des données (voir la section discussion). Avant cette étape, pour récupérer la zone des nanoparticules, cliquez sur Analyser | Définissez les mesures et cochez la zone. D’autres mesures sont disponibles.
7. Enregistrez les fenêtres Résultats et Résumé. Le nombre de nanoparticules pour chaque image se trouve dans la fenêtre Données récapitulatives.

Résultats

La figure 5 montre deux séries d’images STEM HAADF de formation de nanoparticules d’or acquises en 80 secondes à 25 °C et 85 °C. Dans toutes ces expériences, la nucléation et la croissance des nanoparticules sont entraînées par la radiolyse de l’eau. Parmi les espèces chimiques générées par ce phénomène induit par faisceau d’électrons, de puissants agents réducteurs (c’est-à-dire des électrons aqueux et des radicaux hydrogène) peuvent réduire l’acide tétrachloroaurique conduisant à la formation de nanocristaux d’or à l’interface entre les fenêtres du SiN et le liquide. Ces deux observations in situ réalisées avec le même débit de dose électronique confirment que la présente méthode permet de visualiser l’impact drastique de la température sur la formation de nanoparticules en milieux liquides. À basse température, nous observons la croissance d’un assemblage très dense de petites nanoparticules, tandis qu’à haute température, quelques nanostructures grandes et bien facettes sont obtenues. Comme le contraste des images STEM HAADF est proportionnel à l’épaisseur des nanoparticules d’or, nous pouvons voir que deux populations d’objets se forment au cours de ces expériences de croissance: des nanoparticules 3D fortement contrastées et de grandes nanostructures 2D de forme triangulaire ou hexagonale et un contraste inférieur (indiqué par des flèches rouges dans la figure 5).

La méthode d’analyse vidéo décrite dans ce protocole permet de quantifier les processus de nucléation et de croissance en mesurant au fil du temps le nombre de nanoparticules et leur surface moyenne dans la zone observée. Comme le voit la figure 8,à basse température, plus de 800 nanoparticules se forment en quelques dizaines de secondes d’observation, tandis que seulement 30 nanoparticules se forment à haute température. Mis à part deux nanoplaques triangulaires et hexagonales, toutes les nanoparticules sont déjà présentes sur la toute première image du suivi à haute température. La figure 9 montre que la surface moyenne des nanoparticules augmente 40 fois plus rapidement à 85 °C qu’à 25 °C.

La figure 6 représente une image STEM typique et le motif de diffraction de deux nanoparticules d’or qui ont été sélectionnées directement sur l’image (indiquées par des flèches rouges sur la figure 6A). Ici, nous pouvons identifier la structure cubique centrée sur la face (FCC) de l’or orientée le long des axes de zone [001] (Figure 6B) et [112] (Figure 6C).

Figure 1: Schéma des puces électroniques et de l’extrémité du support de cellule liquide. (A) La grande puce électronique avec la résistance utilisée pour chauffer la cellule liquide (en haut) et la petite puce électronique (en bas). (B) Les deux puces électroniques sont chargées dans le support de la cellule liquide. Les électrodes de la grande puce électronique sont en contact avec les électrodes du porte-cellule liquide. La résistance de la grande puce électronique peut chauffer la cellule liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 

Figure 2: Images au microscope optique de puces électroniques illustrant : (A) une fenêtre sin intacte qui est nécessaire à l’expérience. (B) Une plaquette de silicium endommagée au bord de la puce électronique. Ce type de puces électroniques peut être utilisé si la zone endommagée se trouve à l’extérieur de la zone humide une fois que la cellule liquide est scellée (c’est-à-dire si les dommages sont à l’extérieur de la zone définie par les joints toriques). (C) Résidus sur la surface de la puce électronique. Si ces résidus ne partent pas après avoir répété les processus de nettoyage (voir la section 4.1), n’utilisez pas la puce électronique. (D à F) Fenêtres SiN endommagées (puces électroniques inutilisables). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Photos du processus étape par étape du chargement de la cellule liquide dans le support TEM. (A) Porte-échantillon seul. (B) Mettre le joint torique dans la cavité. (C) Insérer la petite puce électronique dans les joints toriques du joint. (D) Mettre une goutte de solution sur les petites puces électroniques. (E) Placez la grande puce électronique sur la petite. (F) Sceller toute la cellule liquide en vissant le couvercle. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Capture d’écran du logiciel de chauffage contrôlant la température de la cellule liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Série d’images STEM HAADF à faible grossissement de la croissance des nanoparticules d’or. a) à 25 °C. (b) à 85 °C. L’heure correspondante est indiquée dans le coin inférieur gauche de chaque image. Les nanostructures 2D sont indiquées par des flèches rouges. Toutes les images sont acquises avec le même débit de dose d’électrons de 3,4 électron·s^-1·nm^-2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: Nanodiffraction STEM de nanoparticules simples. (A) Image STEM utilisée pour sélectionner les nanoparticules diffracting (les positions de la sonde lors des acquisitions de diffraction sont indiquées par des flèches rouges). (B,C) Diffraction pattern of the two selected nanoparticles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7: Traitement des données et analyse des images STEM HAADF à l’aide de Fidji. Les images ont été acquises 40 secondes après le début de la croissance. (A à C) Image acquise à 25 °C. (D à G) Image acquise à 85 °C. (A,D) Image STEM brute. (B,E) Image traitée (filtre médian). (C,F) Image binaire. (G) Une dilatation des pixels est appliquée deux fois et le processus « Trous de remplissage » est ensuite appliqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8: Graphique représentant le nombre de nanoparticules d’or en fonction du temps à 25 °C et 85 °C. Les deux courbes à 25°C sont automatiquement mesurées avec une taille de détection minimale (S_min)de 20 (rouge) et 50 (bleu) pixels^2. Les points verts mesurés après 12 et 60 secondes d’acquisition représentent le nombre de nanoparticules comptées manuellement sur la vidéo acquise à 25 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9: Graphiques représentant la surface moyenne des nanoparticules d’or en fonction du temps à 25 °C et 85 °C. Les points verts représentent des mesures manuelles de la surface moyenne des nanoparticules à des moments donnés de la vidéo acquise à 85 ° C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10: Série d’images STEM HAADF à fort grossissement de la croissance d’un nanocube d’or unique à 85 °C. Cette série d’images a été acquise avec un débit de dose d’électrons de 83,6^{électrons -1}.nm^-2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit permet de suivre la nucléation et la croissance de nanoparticules d’or entraînées par radiolyse dans un milieu liquide à température contrôlée. Combiné avec un traitement vidéo automatisé, il permet de mesurer l’effet de la température sur les paramètres clés de la synthèse des nanoparticules tels que la densité, la taille, la forme et la structure atomique des nanoparticules. Ces apports précieux permettent d’évaluer l’effet de la température sur les taux de nucléation et de croissance, de détecter les transitions de phase possibles et de visualiser les processus de facettage qui dictent le résultat final des solutions colloïdales. Avec la possibilité de contrôler la composition du milieu réactif, la TEM à cellule liquide à température contrôlée est une autre étape vers l’observation directe des processus de nucléation et de croissance de diverses nanostructures dans des conditions de synthèse réalistes. L’interprétation des résultats présentés dans cet article et leur comparaison avec les modèles de nucléation et de croissance seront discutées ailleurs. Ici, nous voulons mettre en évidence plusieurs aspects méthodologiques qui doivent être pris en compte pour mener des expériences TEM in situ pertinentes.

Tout d’abord, il est crucial d’identifier les effets du faisceau d’électrons dans le média de réaction car ils peuvent influencer considérablement les résultats de l’expérience. Ici, comme la radiolyse de l’eau est la force motrice de la formation de nanoparticules, la vitesse de croissance augmente rapidement avec le débit de dose électronique qui aura un impact sur la forme finale des nano-objets^11,15. Par conséquent, pour étudier les effets de la température sur la nucléation et la croissance des nanoparticules, il est nécessaire de comparer les expériences de croissance acquises avec le même débit de dose d’électrons. En mode STEM, le débit de dose électronique correspond au courant de faisceau (en électron par seconde) divisé par la taille de l’image (en^nm2). Par conséquent, un débit de dose d’électrons constant implique de maintenir le même courant de faisceau (c’est-à-dire la même ouverture du condenseur et la même taille de point) et le même grossissement pour chaque expérience. La quantification du courant de faisceau des conditions d’imagerie à l’aide d’une caméra CCD ou d’une tasse de Faraday est importante pour interpréter et reproduire les données. Le grossissement et le débit de dose qui en résulte doivent être choisis selon que l’on souhaite visualiser la croissance d’un grand ensemble de nanoparticules pour extraire des résultats statistiquement pertinents sur la cinétique de croissance(figure 5)ou les mécanismes de croissance à l’échelle d’une seule nanoparticule pour identifier les sites d’adsorption préférentiels sur les surfaces des nanoparticules(figure 10). Si les processus de nucléation et de croissance sont trop rapides, en particulier à fort grossissement, une petite ouverture de condenseur et une petite taille de point doivent être choisies pour minimiser le débit de dose. La nucléation et la croissance des nanoparticules peuvent également ralentir en réduisant la concentration de précurseur métallique dans la solution analysée, mais notez que la concentration de produits radiolytiques augmentera avec la température. D’une manière générale, il est également important de prendre en compte l’historique de l’irradiation électronique de l’ensemble de l’échantillon. Ici, par exemple, si plusieurs expériences de croissance sont rapidement réalisées dans des zones proches les unes des autres, la densité des nanoparticules diminuera au fil du temps car la concentration de précurseurs d’or dans la zone étudiée diminue. Cet effet peut être minimisé en séparant les expériences de croissance à la fois dans l’espace et dans le temps et en utilisant le porte-liquide en mode d’écoulement.

Les algorithmes de suivi d’interface sont extrêmement utiles pour automatiser l’analyse des vidéos et extraire des résultats quantitatifs sur la nucléation et la croissance de grands assemblages de nanoparticules. Cependant, il convient de noter que l’étape de binarisation de l’image est toujours spécifique aux données, ce qui signifie que les filtres et le traitement des données qui doivent être appliqués sur les images pour optimiser la détection de l’interface nanoparticule / liquide varieront d’une expérience à l’autre. De plus, il est essentiel de comparer les résultats de ces analyses automatisées avec des mesures manuelles effectuées sur quelques images afin d’optimiser le flux de travail de traitement d’images et de connaître ses limites. Ici, par exemple, de multiples événements de diffusion dans les nanoparticules 3D de plus en plus épaisses formées à haute température induisent une inversion de contraste de leur cœur après 30 secondes d’observation car l’élargissement angulaire des électrons diffusés entraîne une diminution du signal collecté dans la plage angulaire du détecteur annulaire. Pour continuer à mesurer la surface réelle de ces nanoparticules, nous avons utilisé un processus de données de « trous de remplissage » après la binarisation de l’image qui remplit le cercle intérieur des contrastes de forme d’anneau (Figure 7F, G). Cependant, nous avons dû utiliser une petite dilatation des objets pour nous assurer que ces contrastes de forme d’anneau sont toujours entièrement connectés. Cette dernière étape conduit à une légère surévaluation de la surface moyenne des nanoparticules dans les mesures automatisées (Figure 9). De même, pour la détection des nanoparticules, nous devons définir une taille minimale d’objets détectés (S_mim)pour éviter de détecter le bruit, mais ce paramètre affecte le taux de nucléation mesuré. Comme le voit la figure 8,le nombre de nanoparticules détectées augmente au début de l’expérience pour atteindre un plateau. Lorsque S_min est grand (50 pixels² correspondant à 1543^nm2),des mesures automatiques et manuelles se sont mises d’accord au niveau de ce plateau (835 nanoparticules après 60 secondes) mais la détection des nanoparticules est retardée dans l’analyse automatique puisque 835 nanoparticules sont comptées manuellement après seulement 12 s, mais pas automatiquement détectées jusqu’à plus tard. Ce temps de détection prolongé conduit à une sous-évaluation du taux de nucléation. La réduction de S_min à 20 pixels² (c’est-à-dire 617^nm2)réduit l’erreur sur le temps de nucléation de l’assemblage de nanoparticules, mais elle conduit à une surévaluation de la densité des nanoparticules, en particulier au début des expériences (Figure 8) qui affecte également le taux de nucléation. La détection et les mesures de taille et de forme de nano-objets avec un comportement très dynamique et un faible rapport signal/bruit est un défi courant en TEM en phase liquide qui peut être encore amélioré en utilisant d’autres méthodes de segmentation et de débruitage²⁴ ou des approches d’apprentissage automatique^25.

Enfin, la préparation de la cellule liquide et le nettoyage du support liquide doivent être effectués très soigneusement pour éviter les contaminations du média de réaction.

En général, le contrôle de la température de l’échantillon pendant les analyses LCTEM offre la possibilité d’étudier les effets thermiques sur les réactions chimiques qui se produisent à l’interface entre les solides et les liquides. Par conséquent, nous espérons que la méthode actuelle ouvre la voie à d’autres expériences TEM in situ conçues pour révéler la dynamique des matériaux durs, mous ou biologiques dans des milieux liquides à température contrôlée.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Plus electron microscope	Jeol
Acetone	Merck
Air pistol
ARM 200F electron microscope	Jeol
Binoculars or optical microscope
Carbon tipped tweezers
Computer with heating software	Software by Protochips
Distlilled water
Dummy e-chips	Protochips
Gasket/O-rings	Protochips
Gold aqueous solution	Merck		1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand
Large liquid heating E-chip	Protochips
Methanol	Merck
One View camera	Gatan
Petri dish			Number : 2
Plasma cleaner	Gatan
Poseidon Select	Protochips		Liquid cell holder
Power supply Keithley 2450
Protective gloves
Red PEEK tubing			Number : 3
Screwdriver with torque
Small liquid E-chip	Protochips		150 nm spacers
STEM HAADF detector	Jeol
STEMx software	Gatan
Syringe			Number : 2
Syringe pump	Harvard apparatus		Number : 2
Vacuum pump	Gatan