طرق المجهر متعددة الوقت لتوصيف الفقاعات الدقيقة ذات العلامات الفلورية لإطلاق المخدرات التي تسببها الموجات فوق الصوتية

Summary

ويمكن استخدام البروتوكولات المقدمة لتوصيف استجابة الفقاعات الدقيقة ذات العلامات الفلورية المصممة لتطبيقات توصيل الأدوية التي تسببها الموجات فوق الصوتية، بما في ذلك آليات تنشيطها وكذلك من حيث النبع الحيوي. تغطي هذه الورقة مجموعة من تقنيات الفحص المجهري في المختبر وفي الجسم الحي التي أجريت لالتقاط الطول والجداول الزمنية ذات الصلة.

Abstract

وكلاء التباين Microbubble عقد وعد كبير لتطبيقات تسليم المخدرات مع الموجات فوق الصوتية. تغليف الأدوية في الجسيمات النانوية يقلل من السمية الجهازية ويزيد من وقت تداول الأدوية. في نهج جديد لتسليم الأدوية بمساعدة microbubble ، يتم دمج الجسيمات النانوية في أو على قذائف الفقاعات الدقيقة ، مما يتيح إطلاق حمولة الجسيمات النانوية المحلية والمثارة بالموجات فوق الصوتية. فهم شامل لآليات الإفراج داخل الفضاء المعلمة الموجات فوق الصوتية واسعة أمر بالغ الأهمية لإطلاق سراح كفاءة والسيطرة عليها. تنطبق هذه المجموعة من البروتوكولات المقدمة على الفقاعات الصغيرة ذات القشرة التي تحتوي على ملصق فلوري. هنا ، يتم التركيز على الفقاعات الدقيقة المحملة بولي (2-إيثيل بوتيل سيانواكريلات) الجسيمات النانوية البوليمرية ، مخدر مع صبغة النيل الحمراء المعدلة. يتم إصلاح الجسيمات داخل قذيفة كاسين مشوهة. يتم إنتاج الفقاعات الدقيقة عن طريق التحريك القوي ، مما يشكل تشتت غاز البيرفلوروبروبان في المرحلة السائلة التي تحتوي على الكزين والجسيمات النانوية ، وبعد ذلك تتجمع قذيفة الميكروبل ذاتيا. هناك حاجة إلى مجموعة متنوعة من تقنيات المجهر لتوصيف الفقاعات الصغيرة المستقرة بالجسيمات النانوية في جميع الجداول الزمنية ذات الصلة لعملية إطلاق الجسيمات النانوية. فلورة الجسيمات النانوية تمكن التصوير الكونفوكليكال من الفقاعات الصغيرة واحدة، والكشف عن توزيع الجسيمات داخل قذيفة. في المختبر التصوير فائق السرعة باستخدام المجهر مشرق الميدان في 10 مليون لقطة في الثانية الواحدة يوفر نظرة ثاقبة ديناميات فقاعة استجابة لطنين الموجات فوق الصوتية. وأخيرا، فإن إطلاق الجسيمات النانوية من قشرة الفقاعة هو أفضل تصور عن طريق المجهر الفلوري، الذي يتم في 500،000 لقطة في الثانية الواحدة. لتوصيف تسليم الدواء في الجسم الحي ، يتم دراسة إطلاق الجسيمات النانوية داخل الأوعية الدموية وإسرافها خارج الطبقة البطانية باستخدام المجهر داخل الجسم في الأورام المزروعة في غرف النوافذ الظهرية ، على مدى مقياس زمني لعدة دقائق. ويوفر الجمع بين تقنيات التوصيف التكميلية هذه نظرة فريدة لسلوك الفقاعات الصغيرة وإطلاق حمولتها في مجموعة من مقاييس الوقت والطول، سواء في المختبر أو في الجسم الحي.

Introduction

الموجات فوق الصوتية هي تقنية التصوير الطبي الأكثر استخداما. فمن غير الغازية وسريعة وآمنة وفعالة من حيث التكلفة، ^{والمحمولة1،2،3}. ومع ذلك ، الدم هو مبعثر الموجات فوق الصوتية الفقراء ، ويمكن تعزيز التباين بين تجمع الدم عن طريق الحقن الوريدي من وكلاء التباين بالموجات فوق ^{الصوتية3}. هذا التباين المعزز في تجمع الدم يمكن من تحديد كمي لتشويش الأعضاء لأغراض التشخيص ، على سبيل المثال ، في الكشف عن مرض الشريان ^{التاجي4} وأمراض الكبد النقيلي5. في الواقع، ثبت أن الأوعية الدموية الورم أن يكون عاملا التكهن ^{الهامة6}. ويوجه الآن جهد بحثي كبير نحو التصوير الجزيئي الموجه بمساعدة الفقاعات الدقيقة وعوامل التباين المصممة خصيصا للاستخدام العلاجي.

وكلاء التباين الموجات فوق الصوتية المتاحة تجاريا تتكون عادة من تعليق microbubbles7^،8 المغلفة مع أقطار تتراوح بين 1 ميكرومتر إلى 10 ^{ميكرومتر9}. منذ الموجات فوق الصوتية وكيل الفقاعات الدقيقة هي أصغر قليلا من خلايا الدم ^{الحمراء7}، يمكن أن تصل بأمان microbubbles حتى أصغر الشعيرات الدموية دون إنشاء ^{انسداد3}. Microbubbles لديها زيادة كبيرة في معامل الموجات فوق الصوتية مقارنة مع ^{الأنسجة10} ، وذلك بسبب ^core11 الغاز المضغوط. وعلاوة على ذلك، فإن صدى الفقاعات الدقيقة غير خطي إلى حد كبير، أي أن طيفه يحتوي على التوافقيات و subharmonics من تردد القيادة. بالإضافة إلى ذلك ، تعتمد قوة الصدى بقوة على الاستجابة الرنانة ^{للفقاعة12}. في حين أن الأنسجة مبعثرة خطيا فقط ، فإن عددا صغيرا من الفقاعات الدقيقة يكفي لتحقيق حساسية عالية للكشف في التصوير ^{التوافقي13،14}. هذا الجيل التباين غير الخطي يمكن أن تكون قوية بما يكفي لتتبع فقاعات واحدة في ^body15.

قذيفة من عامل التباين بالموجات فوق الصوتية يستقر فقاعات ضد الانحلال والتلاحم، وبالتالي زيادة وقت الدورة الدموية في بركة ^الدم16. يمكن أن تتكون القشرة من الدهون أو البوليمرات أو البروتينات ^{المشوهة3,8}. فإنه يقلل من التوتر بين البينية، وبالتالي الحد من تأثير لابلاس الضغط يحركها ^حل17 ويخلق حاجزا مقاوما ضد انتشار ^الغاز18. لزيادة الاستقرار ، تمتلئ الفقاعات الدقيقة التباين عادة بغاز عالي الوزن الجزيئي مع قابلية منخفضة للذوبان في ^الدم11. قذيفة microbubble يغير بشكل كبير استجابة الفقاعات الدقيقة ل ^insonation11 الموجات فوق الصوتية. فقاعات الغاز غير المصقول لها تردد الرنين المميزة التي تتناسب عكسيا مع حجمها وإضافة طلاء الدهون يزيد من تردد الرنين فيما يتعلق أن من بوبل غير المصقول بسبب صلابة الجوهرية ^للshell3. وعلاوة على ذلك، تبدد قذيفة الطاقة من خلال اللزوجة التمددية، والتي تشكل المصدر المهيمن للتخميد لفقاعات ^{المغلفة3}. قذيفة استقرار لديه ميزة إضافية أنه يمكن أن تعمل، على سبيل المثال، عن طريق ربط استهداف ليغاندس إلى سطح الفقاعات الصغيرة. هذا الاستهداف يتيح العديد من التطبيقات لهذه الفقاعات، وعلى وجه الخصوص، التصوير الجزيئي مع ^{ultrasound14،19}.

وكلاء التباين Microbubble عقد وعد كبير لتطبيقات تسليم المخدرات مع الموجات فوق الصوتية. يمكن أن تتسبب الفقاعات الدقيقة المتذبذبة في حبس الأوعية الدموية في حدوث تيار مجهري بالإضافة إلى ضغوط طبيعية وقص محلية على الجدار ^{الشعري3}. في الضغوط الصوتية العالية ، قد تؤدي تذبذبات السعة الكبيرة إلى انهيار الفقاعات الدقيقة في عملية عنيفة يطلق عليها التجويف القصور الذاتي ، والتي بدورها قد تؤدي إلى تمزق أو تجويف الأوعية ^{الدموية20}. يمكن أن تحفز هذه الظواهر العنيفة على إحداث عمليات بيولوجية مثل sonopermeation21 ، مما يعزز إسراف الأدوية العلاجية في الإنترستيتيوم عبر الجدار البطاني ، إما بشكل شبه خلوي أو عبر الخلايا. كما أنه قد يحسن اختراق العوامل العلاجية من خلال مصفوفة خارج الخلية من الأورام الغنية ^{بالستروما21,22} وbiofilms23,24 ، على الرغم من أن هذه الآلية لا تزال غير مفهومة بشكل ^جيد26.

وقد أظهرت الموجات فوق الصوتية بوساطة تسليم المخدرات نتائج واعدة على حد سواء preclinically27,28 وفي التجارب ^{السريرية22}. وعلاوة على ذلك، عند استخدامها مع الموجات فوق الصوتية منخفضة التردد نسبيا (~ 1 ميغاهرتز)، تم الإبلاغ عن الفقاعات الدقيقة لزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ محليا وعابرة، وبالتالي تمكين الأدوية من دخول بارنشيما الدماغ، سواء في الدراسات قبل السريرية والسريرية29،^{30،31،32،33،34}.

هناك عموما نهجين لتسليم المخدرات بوساطة الموجات فوق الصوتية: يمكن أن تشارك في إدارة المواد العلاجية مع فقاعات، أو يمكن أن تعلق على أو تحميلها في قذيفة ^{فقاعة28،35،36}. وقد تبين أن النهج الثاني أكثر كفاءة من حيث تسليم ^{المخدرات37}. يمكن تحميل الفقاعات الدقيقة بالأدوية أو المواد الوراثية المغلفة في الجسيمات النانوية (الليبوسومات أو البنى النانوية البوليمرية) المرفقة بالقشرة أو دمجها مباشرة في القشرة الدقيقة ^35,36. يمكن تنشيط الفقاعات الدقيقة المحملة بالجسيمات النانوية عن طريق الموجات فوق الصوتية (المركزة) لإطلاق حمولة الجسيمات النانوية محليا28,33,38,39,40. إذا كان مثل هذا الفقاعات الدقيقة على اتصال مباشر مع خلية ، فقد ثبت في المختبر أنه يمكن حتى إيداع الحمولة على الغشاء السيتوبلازمي الخلوي في عملية تسمى sonoprinting34^،35.

مساحة المعلمة بالموجات فوق الصوتية ل insonation microbubble واسعة النطاق ، والظروف البيولوجية في الجسم الحي إضافة المزيد من التعقيد. وهكذا، فإن الجمع بين الموجات فوق الصوتية المركزة والفقاعات الدقيقة المحملة بالجسيمات النانوية يشكل تحديا في مجال العلاجات المستهدفة.

والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكولات يمكن استخدامها لتصوير، بالتفصيل، استجابة الفقاعات الدقيقة كدالة لمعلمات الموجات فوق الصوتية ودراسة الآليات المؤدية إلى تمزق القشرة وإطلاق المواد القشرية ذات العلامات الفلورية. هذه المجموعة من البروتوكولات تنطبق على الفقاعات الصغيرة ذات الأصداف التي تحتوي على صبغة فلورية. ويبين الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا للفقاعات الدقيقة المثبتة بالجسيمات النانوية البوليمرية والبروتين التي تم تطويرها في SINTEF (تروندهايم، النرويج). تمتلئ هذه الفقاعات بغاز البيرفلوروبروبان (_C3F8) والجسيمات النانوية التي تستقر في القشرة تحتوي على NR668 ، وهو مشتق ليبوفيلي من صبغة الفلورسنت الحمراء ^{النيلية3843}. تتكون الجسيمات النانوية من بولي (2-إيثيل-بوتيل سيانواكريلات) (PEBCA) وهي PEGylated. الوظيفية مع جليكول البولي ايثيلين (PEG) يقلل من opsonization وphagocytosis من قبل نظام phagocyte أحادية النووية، وبالتالي تمديد وقت الدورة ^{الدموية14،44}. ونتيجة لذلك ، يزيد PEGylation من كمية الجسيمات النانوية التي تصل إلى الموقع المستهدف ، وبالتالي تحسين فعالية ^{العلاج16}. يوضح الشكل 2 كيف أن استخدام أربع طرق للفحص المجهري يسمح للباحثين بتغطية جميع جداول الوقت والطول ذات الصلة. وتجدر الإشارة إلى أن الاستبانة المكانية التي يمكن تحقيقها في المجهر البصري تحددها حدود الحيود، التي تعتمد على الطول الموجي للفتحة الضوئية والعددية (NA) للهدف والمصدر الإضاءة ^للجسم45. بالنسبة للأنظمة قيد التشغيل، يكون الحد الأقصى للدقة البصرية عادة 200 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المجهر داخل الفيتية للصورة على المستوى دون ^{الخلوي46}. بالنسبة للفقاعات الدقيقة المستقرة بالجسيمات النانوية والبروتين المستخدمة في هذا العمل ، فإن الحد الأدنى لحجم الطول ذي الصلة بالفحص المجهري داخل الأمعاء هو حجم الشعيرات الدموية الصغيرة (≥10 ميكرومتر). في المختبر التصوير البصري عالي السرعة (10 مليون لقطة في الثانية) والتصوير الفلوري عالي السرعة (500،000 لقطة في الثانية) يتم وصف التجارب لفقاعات صغيرة واحدة. التصوير عالي السرعة في المجال الساطع في الجداول الزمنية نانو ثانية مناسبة لدراسة الديناميات الشعاعية التي تم حلها زمنيا للفقاعات المهتزة. وعلى النقيض من ذلك، يسمح المجهر الفلوري عالي السرعة بالتصور المباشر لإطلاق الجسيمات النانوية ذات العلامات الفلورية. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقيق في هيكل قذيفة الفقاعات الدقيقة باستخدام المجهر confocal Z-المكدس ثلاثي الأبعاد (3D)، ومسح المجهر الإلكتروني (البروتوكول لهذا الأخير غير مدرج في العمل الحالي). يتكون الفحص المجهري داخل الجسم من استخدام المجهر متعدد الفوتون لتصوير الأورام المتنامية في غرف النوافذ الظهرية لتوفير معلومات في الوقت الحقيقي عن تدفق الدم المحلي ومصير الجسيمات النانوية المسماة بالفلورسنت في vivo47. مزيج من هذه الأساليب المجهرية يوفر في نهاية المطاف نظرة مفصلة في سلوك وكلاء microbubble العلاجية ردا على الموجات فوق الصوتية، سواء في المختبر وفي الجسم الحي.

Protocol

ملاحظة: وافقت السلطات النرويجية لبحوث الحيوان على جميع الإجراءات التجريبية. يمكن العثور على تفاصيل المواد المستخدمة في البروتوكول في جدول المواد.

1. إنتاج الفقاعات الصغيرة

ملاحظة: في هذا العمل، الفقاعات الصغيرة ذات الأهمية هي فقاعات صغيرة مثبتة بالبروتين والجسيمات النانوية، والتي وصف لها بروتوكول الإنتاج سابقا28,33,48. ولذلك، تم تلخيص بروتوكول التصنيع بإيجاز هنا.

1. أولا، باستخدام ماصة، مزيج المياه فائقة البور مع 0.5 wt٪ من الكازين في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) و 1 طن٪ من الجسيمات النانوية المسماة مع 0.21 wt٪ من صبغة الفلورسنت، NR668 (تعديل النيل الأحمر)، في قارورة العقص الزجاج العقيم الأعلى (10 مل، قطرها 2 سم). يتم إعداد الجسيمات النانوية البوليمرية باستخدام طريقة البلمرة المستحلب المصغرة كما وصفها Mørch وآخرون. ^{38- ال 38- الأرباح التي ي}
   ملاحظة: هنا، يعمل الصبغة كدواء نموذجي لتمكين التصور من إطلاق الجسيمات النانوية. عند العمل مع محلول الجسيمات النانوية، ارتدي معطف المختبر والنظارات الواقية والقفازات. مسح أي انسكابات من محلول الجسيمات النانوية على الفور مع الأسيتون 100٪.
2. قم بسقف القارورة مع الغطاء المطاطي ، واخلط قليلا ، وضع القارورة في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للقضاء على المجاميع المحتملة. ضع أداة تشتت مع طرف الستيرر ~ 0.5 سم من أسفل القارورة الزجاجية. باستخدام ماصة زجاجية متصلة بحاوية الغاز ، أضف غاز البيرفلوروبروبان إلى مساحة رأس القارورة التي تحتوي على المحلول حتى يبدأ الحل في الفقاعات قليلا.
   ملاحظة: التفاف فيلم الختم الذاتي حول قاعدة أداة التشتت لمنع الانزلاق من قارورة الزجاج أثناء التحريك.
3. حرك المحلول بقوة في 1935 × غرام (24000 دورة في الدقيقة مع دائرة نصف قطرها دوران 3 ملم) لمدة 4 دقائق باستخدام أداة التشتت. أغلق القارورة مع الغطاء المطاطي، وختم القارورة لمزيد من الاستخدام.
   ملاحظة: التحريك يحاصر الغاز في السائل. وmicrobubble قذيفة في وقت لاحق الذاتي يتجمع دون الحاجة إلى أي خطوة نشطة.
4. تخزين محلول كازين والجسيمات النانوية الزائدة في 4 درجة مئوية، وتنظيف أداة التشتت مع الأسيتون 100٪.

2. تصوير فقاعات واحدة

1. المجهر الكونفوجكال
   1. إعداد العينة
      1. تمييع حل الفقاعة لصورة الفقاعات الصغيرة الفردية على النحو التالي. ضع إبرة تنفيس (19 G-21 G) في قارورة علوية زجاجية تحتوي على الفقاعات الدقيقة الناتجة باتباع الإجراء الموضح في القسم 1. بدوره قارورة رأسا على عقب للسماح فقاعات كبيرة للابتعاد عن ختم القارورة.
      2. أدخل طرف إبرة آخر (19 جم) من حقنة صغيرة (~1 مل) في القارورة، بينما القارورة لا تزال مقلوبة رأسا على عقب. إزالة كمية صغيرة من تعليق فقاعة، ونقل محتويات المحاقن في أنبوب صغير لتسهيل pipetting في الخطوة التالية.
         ملاحظة: يعتمد حجم التعليق لاستخراج مباشرة على نوع وتركيز تعليق فقاعة. في هذه الحالة، تم استخراج 0.2 مل.
      3. باستخدام ماصة، تمييع تعليق microbubble (من القسم 1) في PBS المصفاة لتحقيق تركيز ما يقرب من 2 × ¹⁰⁵ إلى 6 × ¹⁰⁵ microbubbles / مل لتمكين التصوير فقاعة واحدة.
         ملاحظة: اعتمادا على نوع الفقاعة، فمن المستحسن لغسل تعليق فقاعة لإزالة صبغة الفلورسنت الحرة. هذا مهم بشكل خاص مع الفقاعات التي يتم غرس صبغة الفلورسنت في القشرة. لغسل الفقاعات، تمييع تعليق الفقاعة (على سبيل المثال، عن طريق أخذ 100 ميكرولتر من محلول الفقاعة في 10 مل من PBS)، والطرد المركزي (عادة بسرعة 100 × غرام). وأخيرا، قم بإزالة الناتورات التي تحتوي على الفقاعات الدقيقة مع ماصة لمزيد من التحليل. يحتوي المحلول المتبقي على جزيئات فلورية حرة ويمكن التخلص منها. يجب تكرار خطوة الغسيل حسب الضرورة.
      4. إضافة الجلسرين إلى الخليط لزيادة لزوجة المتوسط والقضاء على الحركة الناجمة عن الحركة براوني التي من شأنها أن تتداخل مع التصوير Z-كومة confocal بطيئة نوعا ما.
         ملاحظة: كمية الجلسرين يعتمد على نوع الفقاعة التي يتم تصويرها (هنا، ~ 50٪). بالنسبة لبعض أنواع الفقاعات، قد يكون للجلسرين تأثير سلبي على ^{الاستقرار49}. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي تغيير ملحوظ في الفقاعات على مدى 30 دقيقة تقريبا تحت التصوير confocal. وعلاوة على ذلك، قد الجلسرين تغيير الاستجابة الصوتية من microbubbles، وبالتالي لا يمكن استخدامها إلا مع أساليب التصوير حيث لا يتم إجراء الفقاعات الدقيقة.
      5. ضع تعليق الفقاعات الصغيرة في غرفة ذات جدران رقيقة للتصوير الأمثل مثل شريحة القناة.
   2. بروتوكول التصوير
      1. قم بتشغيل المجهر البؤري، وحدد هدفا مناسبا والليزر والماسح الضوئي المطلوبين لاستخدامه أثناء الفحص المجهري البؤري.
         ملاحظة: هنا، استخدم هدف غمر الماء 60x للحصول على دقة 0.08 ميكرومتر/بكسل، ورهنا بحجم الفقاعة، قم بتصوير منطقة 256 × 256 بكسل أو 128 × 128 بكسل. في هذه التجارب المحددة، استخدم ليزر 488 نانومتر وماسح ضوئي غالفانو. يعتمد الطول الموجي للانبعاثات على صبغة الفلورسنت وعادة ما يكون واسع النطاق.
      2. العثور على microbubble في مجال مشرق ، والتحول إلى المجهر confocal. تعيين المستويات العلوية والسفلية المطلوبة التي سيتم مسح المجهر confocal بينهما. الحصول على Z-المكدس لمراقبة بنية ثلاثية الأبعاد; استخدام حجم خطوة من 100 نانومتر في الاتجاه Z.
2. المجهر ذو المجال الساطع
   1. تجميع النظام البصري
      ملاحظة: يظهر تمثيل تخطيطي لإعداد المجهر ذو المجال الساطع في الشكل 3A. لضمان انتشار الموجات فوق الصوتية دون عائق، يحتوي حمام الماء على فتحتين: واحدة لمصدر الضوء وواحدة لمحول الموجات فوق الصوتية. يتكون النظام البصري من مجهر (وحدات) وكاميرا عالية السرعة وبصريات مطابقة. وبما أن فترة تذبذبات الفقاعات الدقيقة عادة ما تكون من أجل 1 ميكرومتر (باستخدام الموجات فوق الصوتية 1 ميغاهرتز)، ينبغي تعيين الكاميرا لتسجيل بمعدل إطارات لا يقل عن 5 ملايين إطار في الثانية. هنا، سيتم تعيين الكاميرا لتسجيل 10 مليون لقطة في الثانية (256 × 400 بكسل) ل256 إطارا (25.6 ميكروثانية) لالتقاط جميع تفاصيل ديناميات الفقاعة بما في ذلك التوافقيات العالية.
      1. إرفاق هدف الغمر بالماء مع التكبير المناسب ، ومسافة العمل ، وNA إلى المجهر.
         ملاحظة: تم استخدام هدف الغمر في الماء لتوفير مسافة عمل مستقرة على الرغم من التبخر التدريجي للمياه. هنا، تم اختيار هدف الغمر بالماء مع تكبير 60x، ومسافة عمل من 2 مم، وNA من 1.
      2. استخدم ضوءا قويا مع ذروة إنتاج الطاقة لا تقل عن 1 كيلو واط للإضاءة وعدسة أنبوبية بين المجهر والكاميرا لضمان وصول أقل قدر ممكن من الضوء المحيط إلى مستشعر الكاميرا عالية السرعة.
      3. استخدم مصدر ضوء الهالوجين القابل للتعتيم للتركيز على الفقاعات الصغيرة المفردة ومحاذاة النظام البصري والصوتي للتصوير في الوقت الفعلي.
   2. تجميع النظام الصوتي
      1. استخدم مولدا موجي إجباريا قابلا للبرمجة ومضخم طاقة (56 ديسيبل) لدفع المحول بجسم مجسم وموج ناعم. قم بتوصيل منظار الذبذبات بمولد الشكل الموجي التعسفي للتحقق من الإشارة. قم بتوصيل جهاز كمبيوتر شخصي بمولد الشكل الموجي التعسفي برمجة موجة الضغط الصوتي الواردة، وذلك باستخدام سيناريو مكتوب في المنزل.
      2. استخدام مولد نبض / تأخير كمشغل رئيسي لمزامنة النظم البصرية والصوتية. تعيين تأخير الزناد على مولد النبض / تأخير وبرنامج الكاميرا بحيث يبدأ التسجيل 16 ميكروس بعد انتقال الموجات فوق الصوتية للسماح للموجة الموجات فوق الصوتية للوصول إلى الفقاعات. قم بتشغيل مصدر الضوء 1.5 ميكرو قبل بدء التسجيل لضمان الإضاءة المناسبة أثناء تذبذبات الفقاعة (انظر الشكل 3B للاطلاع على الرسم التخطيطي للتوقيت).
      3. اختر محولا مناسبا مع تردد مركز مناسب. وضعه في فتحة من حمام الماء، بحيث يكون في زاوية فيما يتعلق بالمحور البصري لتقليل الانعكاسات من أغشية حامل العينة والحد من تشكيل الموجة الدائمة.
         ملاحظة: هنا، تم وضع محول الغمر المركز أحادي العنصر مع تردد مركزي قدره 2.25 ميغاهرتز، ومسافة بؤرية تبلغ 1 بوصة وقطر عنصر 0.75 بوصة بزاوية 35 درجة فيما يتعلق بالمحور البصري. يجب إجراء معايرة وظيفة النقل باستخدام نفس مكبر الصوت المستخدم في النظام الصوتي. معايرة وظيفة نقل من الجهد السعة للضغط على اتساع محول باستخدام هيدروفون الألياف البصرية كدالة تردد نقل الموجات فوق الصوتية.
   3. اختيار حامل العينة
      1. استخدم حامل عينة مع أغشية شفافة بصريا وصوتيا وحجما كبيرا بما يكفي للسماح بتصوير العديد من الفقاعات الصغيرة المفردة داخل العينة نفسها.
         ملاحظة: هنا، تم استخدام كاسيت ثقافة الخلية بحجم 10 مل، ومناطق غشاء من 25 ^سم2، وسماكة غشاء 175 ميكرومتر. بسبب الانعكاسات الصوتية على الغشاء السفلي ، والتدخل من الموجات التي يعكسها هدف المجهر والغشاء العلوي ، قد يختلف الضغط الصوتي في الموقع عن الضغط المبرمج على مولد الشكل الموجي التعسفي. وضع محول في زاوية فيما يتعلق الأغشية حامل العينة يقلل من تشكيل الموجة الدائمة، ولكن يمكن أن تزيد من انعكاسات من الأغشية.
      2. تأكد من أن العينة يمكن أن تكون مغمورة بالكامل وإحضارها ضمن تركيز كل من محول ومجهر الهدف. استخدم دعم الألمنيوم المرفق بمرحلة وضع الميكروستيشن ثلاثي الأبعاد لتحريك حامل العينة بشكل مستقل.
   4. محاذاة الأنظمة البصرية والصوتية
      1. للترجمة ثلاثية الأبعاد لمحاذاة الإعداد، قم بتوصيل حمام الماء بمرحلة ترجمة XY، وأرفق المرحلة بجدول بصري لضمان عدم تحركه أثناء التجارب. ثم، ملء حمام الماء بالماء، والتبديل على مصدر ضوء الهالوجين باهتة. أثناء المحاذاة، قم بتحريك هدف المجهر إلى الجانب لمنع انعكاسات الموجات فوق الصوتية.
      2. إرفاق هيدروفون إبرة (0.2 ملم) إلى ذراع حامل العينة، ووضع هيدروفون إبرة في حمام الماء، مع غيض في مجال الرؤية من الهدف. تشغيل مكبر للصوت ومولد الموجي التعسفي؛ استخدام نبضات واحدة من 5 إلى 10 دورات الموجات فوق الصوتية وتردد تكرار النبض من 15 هرتز. حرك الخزان في اتجاه XY والإبرة في اتجاه Z حتى يتم الوصول إلى أقصى قدر من سعة الضغط.
      3. ضبط تركيز المجهر لإعادة التركيز على غيض من الهيدروفون.
         ملاحظة: يضمن هذا البروتوكول المحاذاة بين تركيز المجهر وتركيز محول. لا تغير موضع المجهر والمحول بعد المحاذاة.
   5. إعداد العينة
      1. كرر الخطوات 2.1.1.1 إلى 2.1.1.3 لإعداد الحل عينة. تمييع حل الفقاعة لتمكين التصوير أحادي الفقاعة واستبعاد التفاعلات الصوتية للفقاعات المجاورة.
      2. افتح منفذ حامل العينة. باستخدام حقنة، قم بحقن محلول العينة في الفتحة الأخرى لحامل العينة حتى يتم ملؤها بالكامل. تأكد من عدم وجود فقاعات هوائية داخل حامل العينة لمنع التفاعلات غير المرغوب فيها مع مجال الموجات فوق الصوتية.
      3. أغلق كلا صمامي حامل العينة، وضع حامل العينة عموديا على المحور البصري.
         ملاحظة: حافظ على مستوى حامل العينة المملوء لمنع نقل الفقاعات إلى جانب واحد من حامل العينة أثناء النقل.
   6. بروتوكول التصوير
      1. برنامج تردد القيادة بالموجات فوق الصوتية المطلوب والضغط الصوتي في مولد الموجي التعسفي من خلال السيناريو المكتوب في المنزل المذكورة أعلاه.
         ملاحظة: هنا، كانت موجة الضغط الصوتي انفجار واحد من 40 دورة، مع نبض غاوسي مدبب من 8 دورات. وكانت ترددات الموجات فوق الصوتية المستخدمة في هذه التجارب هي MHz 1 أو MHz 2 أو MHz 3، مع سعة ضغط صوتي تتراوح بين 81 كيلو باسكال إلى 1200 كيلو باسكال.
      2. حرك حامل العينة الذي يحتوي على محلول العينة باستخدام مرحلة XYZ لتحديد موقع الفقاعات الصغيرة المفردة في تركيز المجهر. ابدأ بمجال رؤية في زاوية من حامل العينة، وتأكد من أن حافة الفقاعات الدقيقة مرئية بوضوح وفي بؤرة التركيز (انظر الشكل 3C للحصول على عرض مثالي للكاميرا).
      3. إرفاق نهاية الألياف البصرية التي كانت متصلة سابقا إلى ضوء الهالوجين إلى ضوء القوية، بحيث لا يزال متصلا الطرف الآخر إلى حمام الماء. تشغيل التسجيل.
      4. كرر الخطوات 2.2.6.2 إلى 2.2.6.3 مرات كما هو مطلوب في إعداد الموجات فوق الصوتية (التردد والضغط الصوتي)، وتحريك كاسيت ثقافة الخلية التي تحتوي على الفقاعات الدقيقة على الأقل 2 مم (في المستوى البؤري) من الموقع السابق لضمان عدم تكرار الفقاعات الدقيقة في مجال الرؤية في التجارب السابقة.
         ملاحظة: هنا، تم تكرار كل تجربة ~ 20 مرة. عندما يتم إجراء التكسون على حامل العينة بالكامل، قم بإفراغ حامل العينة، ثم أعد ملئه بمحلول عينة جديد للتجارب اللاحقة.
   7. تحليل البيانات
      1. اعتماد بيئة برمجة لإجراء تحليل البيانات وفقا للسؤال البحثي، وإجراء الكشف عن الحافة بعد معالجة الصور. باستخدام وظيفة تقيس خصائص مناطق الصورة ، ابحث عن السنترويد للفقاعة ومشتق ملف تعريف الكثافة حول كل فقاعة للكشف عن محيط الفقاعة (وبالتالي ، نصف قطر الفقاعة R). استخراج المعلمات ذات الصلة من نصف قطرها مع مرور الوقت لفقاعات صغيرة واحدة.
         ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام بيئة برمجة لمعالجة الصور لتصغير تسجيلات الفقاعات الصغيرة المفردة وتصفيتها. تم استخدام سيناريو داخلي للعثور على مشتق ملف تعريف الكثافة حول كل فقاعة.
3. المجهر الفلوري
   1. تجميع النظام البصري
      1. قم ببناء الإعداد للفحص المجهري الفلوري (الشكل 4A)، مع نفس القاعدة المستخدمة في المجهر ذو المجال الساطع الموضح في القسم 2.2.
         ملاحظة: يمكن دمج الإعداد الموضح في القسم 2.3 مع الإعداد الموضح للفحص المجهري ذو المجال الساطع في القسم 2.2. الجمع بين كل من المجهر الفلوري والمجهر مشرق الميدان تمكن التصور من جوهر الغاز microbubble أثناء تصوير إطلاق الجسيمات النانوية.
      2. ضبط الكاميرا عالية السرعة لتسجيل 500،000 لقطة في الثانية (400 × 250 بكسل) ل 128 لقطة (256 ميكروثانية).
         ملاحظة: وقت التصوير أطول مما هو عليه في تجارب المجال الساطع حيث أن شدة الضوء محدودة في الفلورسينس، ولأن النطاق الزمني الذي يحدث فيه تسليم الجسيمات أطول من مقياس ديناميكيات الفقاعة.
      3. حدد ليزر مع قوة عالية بما يكفي لتوفير الضوء الكافي والتي لديها الطول الموجي الإثارة مناسبة، وضمان أن يقترن مع المغير acousto البصرية لتجنب تبييض العينة.
         ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام ليزر موجة مستمرة 5 W مع الطول الموجي الإثارة من 532 نانومتر لإثارة مضان الجسيمات النانوية.
      4. ضع مقسم شعاع ومرآة ديكثرية وفلتر درجة بين الليزر وهدف المجهر لتوجيه ضوء الإثارة نحو العينة مع السماح لانبعاث الفلورسينس بالوصول إلى الكاميرا.
   2. تجميع النظام الصوتي
      1. 2- لتجسيد الفقاعات الدقيقة، استخدم نفس الإعداد الصوتي كما في القسم 2-2-2. تغيير محول في هذه التجارب المحددة إلى عنصر واحد، محول الغمر مركزة مع تردد مركز من 2.25 ميغاهرتز، مسافة محورية من 1.88"،" وقطر عنصر من 1". وضعه في زاوية 35 درجة فيما يتعلق المحور البصري لتقليل الانعكاسات من أغشية حامل العينة والحد من تشكيلات الموجة الدائمة.
   3. محاذاة الأنظمة البصرية والصوتية
      1. كرر الخطوات الموضحة في القسم 2.2.4.
   4. إعداد العينة
      1. إعداد الحل عينة كما هو موضح في المقطع 2.2.5.
   5. بروتوكول التصوير
      1. تعيين تردد القيادة بالموجات فوق الصوتية المطلوبة وسعة الضغط الصوتي على مولد الموجي التعسفي من خلال السيناريو المكتوب في المنزل المذكورة أعلاه.
         ملاحظة: هنا، تمت برمجة موجة الضغط الصوتي لتكون دفعة واحدة من الموجات فوق الصوتية من 140 دورة، مع نبض غاوسي مدبب من 10 دورات. عادة ما تكون فترات النبض الأطول مطلوبة للحث على التأثيرات الحيوية مقارنة بتلك المطلوبة لدراسة ديناميكيات الفقاعات. وكانت ترددات الموجات فوق الصوتية المستخدمة في هذه التجارب هي MHz 1 أو MHz 2 أو MHz 3، مع سعة ضغط صوتي تتراوح بين 81 كيلو باسكال إلى 1200 كيلو باسكال.
      2. على مولد النبض / التأخير ، قم بتعيين تأخير الزناد لليزر لإثارة الفلورسنت للجسيمات النانوية من الفقاعات الدقيقة أثناء التسجيل.
         ملاحظة: بالنسبة لهذه التجارب المحددة، كان تأخير المشغل يتراوح بين 20 ميكرون و170 ميكروس لمدة إجمالية قدرها 150 ميكروس. يظهر الرسم التخطيطي للتوقيت في الشكل 4B.
      3. حرك حامل العينة الذي يحتوي على محلول العينة باستخدام مرحلة XYZ لتحديد موقع الفقاعات الصغيرة المفردة في تركيز المجهر. ابدأ بحقل رؤية لزاوية من حامل العينة؛ انظر الشكل 4C للحصول على عرض الكاميرا المثالي الذي واجهة microbubbles واضحة للعيان والتركيز. تشغيل التسجيل.
      4. كرر الخطوة 2.3.5.3 عدة مرات كما هو مطلوب لكل إعداد الموجات فوق الصوتية (التردد والضغط الصوتي)، وتحريك كاسيت ثقافة الخلية التي تحتوي على microbubbles ما لا يقل عن 2 ملم (في المستوى البصري) من الموقع السابق لضمان عدم سونيكاتيد microbubbles في مجال الرؤية في التجارب السابقة.
         ملاحظة: في هذه الدراسة، تكررت كل تجربة ~ 10-20x. عندما يتم إجراء التكسون على حامل العينة بالكامل، قم بإفراغ حامل العينة، ثم أعد ملئه بمحلول عينة جديد للتجارب اللاحقة. تعتمد المسافة التي يجب نقل حامل العينة بين التجارب على حجم الحزمة الصوتية.
   6. تحليل البيانات
      1. تحليل تسجيلات المجهر الفلوري وفقا لسؤال البحث. لكل فقاعات صغيرة، حدد بصريا ما إذا كان تسليم الجسيمات النانوية في تجارب المجهر الفلوري حدث. إذا لوحظ انفصال وترسب الجسيمات النانوية من قلب الغاز إلى غشاء حامل العينة لثقب صغير واحد ، أدخل يدويا أن التسليم حدث في بيئة البرمجة.

3. المجهر داخل الفيتال

1. جراحة غرفة النافذة الظهرية (الموصوفة سابقا26,47,50)
   1. تأقلم الحيوانات لمدة أسبوع واحد قبل وضع غرف النافذة. على الرغم من أنه يمكن استخدام الفئران الأنثوية والذكور على حد سواء ، والعمر غير مهم ، تأكد من أن وزن الفئران لا يقل عن 22-24 غرام بحيث يكون الجلد مرنا بما فيه الكفاية.
   2. إجراء الجراحة تحت التخدير العام مع العلاج المسكن أثناء الجراحة وبعد العملية الجراحية. تخدير الحيوان عن طريق حقن تحت الجلد من الفنتانيل (0.05 ملغم/كغ)/ميدتوميدين (0.5 ملغم/كغ)/ميدازولام (5 ملغم/كغ)/ماء (2:1:2:5) بجرعة 0.1 مل لكل 10 غرام من الوزن. استخدام وسادة التدفئة أو مصباح التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم من الحيوان.
   3. سحب بلطف على طبقة مزدوجة من الجلد على الجزء الخلفي من الحيوان بحيث يقع الجلد بين اثنين من إطارات البوليوكسيمثيلين متماثل من غرفة النافذة. إصلاح الغرفة عن طريق وضع اثنين من مسامير تمتد من خلال طبقة الجلد المزدوج وخياطة على طول الحافة العليا للغرفة.
   4. إزالة الجلد داخل الإطار الدائري للغرفة على جانب واحد من طية الجلد. ضع زجاج غطاء قطره 11.8 مم داخل الإطار حيث تتم إزالة الجلد لتشكيل نافذة في الأنسجة.
   5. استخدم حقنة تحت الجلد من الأتيبمازول (2.5 ملغم/كجم)، فلومازينيل (0.5 ملغم/كجم)، والماء (1:1:8) بجرعة 0.1 مل لكل 10 جرام كترياق لإنهاء التخدير. ضع الحيوان في رف استرداد ساخن بين عشية وضحاها. تكملة المياه للحيوانات مع 25 ملغ / مل من enrofloxacin لمنع العدوى في موقع الجراحة.
2. إنشاء نموذج الورم
   1. الحفاظ على الخلايا السرطانية عند 37 درجة مئوية وفي جو _CO2 5٪ في وسط الثقافة المناسبة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني و 100 U/mL البنسلين و 100 ملغم / مل ستريبتومايسين.
      ملاحظة: تم استخدام خط الخلية (OHS) البشري في هذا البروتوكول، ولكن يمكن أيضا استخدام خطوط الخلايا الأخرى.
   2. في اليوم التالي للخطوة 3.1.5 ، تخدير الحيوان عن طريق isoflurane (5٪ أثناء الحث و 1-2٪ أثناء الصيانة) لبضع دقائق. إزالة الزجاج الغطاء، وتطبيق 5 × ¹⁰⁶ الخلايا السرطانية في 30 ميكرولتر من الخلايا ثقافة المتوسطة، واستبدال الزجاج الغطاء.
   3. السماح للأورام بالنمو لمدة أسبوعين قبل التصوير، ومراقبة وزن الحيوانات وحالتها الصحية 3 مرات على الأقل في الأسبوع خلال هذه الفترة.
3. تجميع النظام البصري
   1. إجراء التصوير داخل الفيتية أثناء العلاج بالموجات فوق الصوتية (كما هو موضح في العمل ^{السابق26}) مع المجهر المناسب والهدف اعتمادا على مسألة البحث على المحك. راجع الشكل 5A للحصول على تمثيل تخطيطي للإعداد التجريبي.
      ملاحظة: لهذه التجربة المحددة، تم استخدام مجهر متعدد الفوتون، مجهز بهدف غمس الماء 20x (NA من 1.0 ومسافة عمل 2 مم) وليزر نبضي. تم الحصول على الصور في وضع المسح الرنانة بمعدل 31 إطارا في الثانية (512 × 512 بكسل) مع مجال رؤية 400 × 400 ^{ميكرومتر2}. وكان الطول الموجي للإثارة 790 نانومتر. وكانت المرشحات أمام اثنين من كاشفات الفوسفيد أرسينيد الغاليوم تمريرة طويلة 590 نانومتر والفرقة تمرير 525/50 نانومتر للكشف عن الفلورية.
4. تجميع النظام الصوتي
   1. تركيب محول الموجات فوق الصوتية مناسبة في موجه موجي (مخصص) وضعه تحت الهدف بزاوية 45 درجة فيما يتعلق بالمحور البصري لتقليل الانعكاسات من الزجاج غطاء غرفة النافذة الظهرية مطوية والحد من تشكيلات الموجة الدائمة. ملء الموجي مع الماء المقطر وdgassed. تطبيق هلام اقتران بالموجات فوق الصوتية على رأس waveguide.
5. محاذاة الأنظمة البصرية والصوتية
   1. محاذاة المحور البصري مع التركيز من الموجات فوق الصوتية. وضع هيدروفون الألياف البصرية في التركيز على الهدف. ثم قم بتشغيل مكبر الصوت ومولد الموجي التعسفي لإثارة محول مع رشقات نارية قصيرة (5-10 دورات) مع تردد تكرار نبض 100 هرتز، ونقل محول الموجات فوق الصوتية إلى الموقف حيث يتم الكشف عن أعلى ضغط مع إشارة الهيدروفون على المنظار.
      ملاحظة: لا تقم بتغيير موضع محول بعد المحاذاة.
6. بروتوكول التصوير
   1. ضع حامل الحيوان الساخن (المصمم خصيصا) متصلا بمرحلة تحديد المواقع XY بين موجه الموجة والهدف ، وأضف المزيد من هلام الاقتران. تخدير الحيوان، ووضع القسطرة الوريد الذيل. ضع الماوس في حامل ساخن، وإصلاح غرفة النافذة في حامل. إضافة قطرة ماء على رأس الغطاء زلة في غرفة النافذة، وتحريك الهدف في مكان لتصوير أنسجة الورم.
   2. يوضح الشكل 5B الرسم التخطيطي لتوقيت التجارب التي تصور ترتيب الأحداث. حقن الفلورسنت المسمى 2 MDa dextran عن طريق الوريد (30 ميكرولتر، 4 ملغ / مل مخففة في المالحة) لتصور الأوعية الدموية، وتحريك الماوس باستخدام مرحلة الترجمة XY للعثور على موقف مع الأوعية الدموية المناسبة. تسجيل صور خط الأساس قبل العلاج بالموجات فوق الصوتية. ضبط معدل الإطار ومجال الرؤية وطول التسجيل اعتمادا على سؤال البحث وتفاصيل المجهر والأصباغ التي سيتم تصويرها.
      ملاحظة: في هذه التجارب، تم تسجيل 31 إطارا في الثانية مع مجال رؤية 400 × 400 ^{ميكرومتر2}، وتم التصوير بشكل مستمر لمدة 5 دقائق.
   3. تعيين تردد القيادة بالموجات فوق الصوتية المطلوبة، وطول النبض، وسعة الضغط الصوتي على مولد الموجي التعسفي.
      ملاحظة: بالنسبة لهذه التجارب، استخدم تردد 1 ميغاهرتز بطول نبضي قدره 10 مللي ثانية واتساع ذروة الضغط السلبي بين 0.2 ميجا باسكال و0.8 ميجا باسكال. واستخدم تردد تكرار النبض 0.5 هرتز أو 0.1 هرتز للسماح للفقاعات الصغيرة الجديدة بالتشويش في المنطقة المعالجة بين نبضات الموجات فوق الصوتية.
   4. حقن 50 ميكروبول ميكروبل (2 × ¹⁰⁸ إلى 5 × ¹⁰⁸ ميكروبوبل / مل) عن طريق الوريد، وتطبيق الموجات فوق الصوتية أثناء التصوير، كما هو موضح ^في26.
7. تحليل البيانات
   1. اعتمادا على سؤال البحث ، وتحليل الصور مع (المصدر المفتوح) برامج معالجة الصور وبيئة البرمجة ، كما هو موضح في ²⁶ ، لتحديد معلمات الأوعية الدموية (القطر ، والمتفرعة ، وسرعة التدفق ، والاتجاه) ، وتراكم الجسيمات النانوية في الأوعية ، والحركية وعمق الاختراق من البذخ من الجسيمات النانوية والكستران في أنسجة الورم.

النتائج

تم تحليل الفقاعات الدقيقة، التي تم إنتاجها كما هو موضح في البروتوكول، باستخدام طرق المجهر المختلفة وعلى جداول زمنية مختلفة.

يشير تفلور الجسيمات النانوية في المجهر البؤري (الشكل 6A) إلى أن القشرة لها توزيع جسيمات غير موحد. ويمكن استخدام طرق أخرى للفحص المجهري لتحديد خصائص الفقاعات. على سبيل المثال، يظهر الشكل 6B الهيكل العام للفقاعات الدقيقة باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي، كما هو معروض في العمل ^{السابق34}.

يمكن دراسة الديناميكيات الإشعاعية وسلوك الفقاعة الفينونومينية باستخدام طريقة المجهر في المختبر ذات المجال الساطع الموصوفة حيث تم تصوير الفقاعات الدقيقة بمعدل 10 ملايين إطار في الثانية. تم استخراج نصف قطر الفقاعات الصغيرة المفردة بمرور الوقت باستخدام سيناريو مكتوب داخليا. ويظهر مثال على هذه الاستجابة الشعاعية في الشكل 7.

يظهر في الشكل 8 ألف تسلسل صور للتسليم الناجح النموذجي للجسيمات النانوية، كما هو موضح في القسم 2-3-6. يمكن رؤية الجسيمات النانوية المضمنة في قشرة الفقاعات الدقيقة تضيء بسبب الفلورسينس عندما يصل ضوء الليزر إلى الفقاعة. مدفوعة بالموجات فوق الصوتية ، تنفصل الجسيمات النانوية الفلورية عن جوهر الغاز في الفقاعات الدقيقة وتترسب على غشاء حامل العينة. وأخيرا، يتم إيقاف تشغيل الليزر، والجسيمات النانوية الفلورية لم تعد متحمسة. يبدو التسليم غير الناجح للحمولة المسماة بالفلورسنت للفقاعات الدقيقة عادة مثل تسلسل الصورة الموضح في الشكل 8B ، حيث تضيء الجسيمات النانوية الفلورية على قشرة الفقاعات الدقيقة التي تبقى سليمة أثناء التعرض للموجات فوق الصوتية.

في الوقت الحقيقي تم استخدام المجهر متعدد الفوتون أثناء الموجات فوق الصوتية للتحقيق في آثار الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة على سلوك الجسيمات النانوية في الدم ، وتعزيز نفاذية الأوعية الدموية الورم ، وتحسين تسليم الجسيمات النانوية. يمكن وصف مدى وحركية الاختراق في المصفوفة خارج الخلية كدالة للضغط الصوتي والتردد وأطوال النبض. قد يختلف تأثير العلاج بالموجات فوق الصوتية فيما يتعلق بحجم الأوعية ومورفولوجياها وما ينتج عنها من حبس للفقاعة. كيف يؤثر العلاج بالموجات فوق الصوتية على تدفق الدم واتجاهه. وتظهر تجربة مثال تبين إسراف الجسيمات النانوية مع مرور الوقت في الشكل 9 في مؤشر ميكانيكي (MI) قدره 0.826. توضح نتائج المجهر متعدد الفوتونات داخل الجسيمات النانوية أثناء التعرض بالموجات فوق الصوتية البذخ المكاني والزمني ، وهو أمر مفيد للغاية للفهم الكامل للآليات الكامنة وراء تسليم الجسيمات النانوية بوساطة الموجات فوق الصوتية وتحسين هذه ^{التقنيات26}.

الشكل 1: تمثيل تخطيطي لفقاعات صغيرة مع قشرة من الجسيمات النانوية البوليمرية ذات العلامات الفلورية في الكازين المشوه. الفقاعات الدقيقة عادة ما تكون بين 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر في القطر. الجسيمات النانوية لديها قطر في الغالب بين 100 نانومتر و 200 ^nm38. اختصار: _C3F8 = غاز البيرفلوروبروبان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نظرة عامة تخطيطية تبين الوقت ومقياس الطول ذات الصلة للمجال الساطع والفلورسينس والمنظار المجهري داخل الحتمية.

الشكل 3: التمثيل التخطيطي لتجارب المجهر ذات المجال الساطع. (أ) الإعداد التجريبي، (ب) الرسم التخطيطي للتوقيت، و (C) إطار مسجل نموذجي. شريط المقياس في (C) = 10 ميكرومتر. اختصار: FPS = إطارات في الثانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التمثيل التخطيطي لتجارب المجهر الفلوري. (أ) الإعداد التجريبي، (ب) الرسم التخطيطي لتوقيت، و (ج) إطار مسجل نموذجي. شريط المقياس في (C) = 10 ميكرومتر. اختصار: FPS = إطارات في الثانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التمثيل التخطيطي لتجارب المجهر داخل الفيتية. (أ) الإعداد التجريبي، (ب) الرسم التخطيطي للتوقيت، و (C) إطار مسجل نموذجي. شريط المقياس في (C) = 50 ميكرومتر. الأخضر يتوافق مع dextran-FITC والأحمر إلى الجسيمات النانوية. اختصار: GaAsP = فوسفيد أرسينيد الغاليوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: بنية ثلاثية الأبعاد لجسيمات نانوية واحدة وفقاعات صغيرة مثبتة بالبروتين. (أ) باستخدام المجهر البؤري لإظهار الجسيمات النانوية، و (ب) باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي لإظهار الهيكل ثلاثي الأبعاد. (ب) تم استنساخها بإذن من ³⁴. شريط المقياس في (A) = 5 ميكرومتر؛ شريط المقياس في (B) = 2 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: تذبذبات كروية نموذجية من نصف قطر 2.89 ميكرومتر من الجسيمات النانوية والبروتين استقرت الفقاعات الدقيقة المتقنة في تردد الموجات فوق الصوتية من 1 ميغاهرتز وسعة الضغط الصوتي من 142 كيلو باسكال (A-D) صور من تسجيل عالية السرعة ونصف قطر فقاعة المقابلة مع مرور الوقت منحنى (أسفل). أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر، والخط الأحمر يشير إلى نصف القطر الأولي. ويشار إلى ملف الإضاءة (وحدات التعسفي) باللون الأصفر. التكبير هو 120x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: تسلسل الصور من المجهر الفلوري عالي السرعة. (أ) التسليم الناجح للجسيمات النانوية ذات العلامات الفلورية لقنينة صغيرة استقرت بالجسيمات النانوية والبروتين مترنة بتردد بالموجات فوق الصوتية يبلغ 2 ميغاهرتز وسعة ضغط صوتية 600 كيلو باسكال. (ب) عدم نجاح تسليم الجسيمات النانوية ذات العلامات الفلورية لفقاعات صغيرة استقرت في الجسيمات النانوية والبروتين ومسننة بتردد بالموجات فوق الصوتية يبلغ 2 ميغاهرتز وسعة ضغط صوتية 210 كيلو باسكال. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. التكبير هو 120x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: المجهر داخل الفيتال بعد تقديم فقاعات صغيرة ثابتة بالجسيمات النانوية والبروتين بتردد بالموجات فوق الصوتية يبلغ 1 ميغاهرتز وسعة ضغط صوتي تبلغ 800 كيلو باسكال. (أ) الجسيمات النانوية داخل السفينة، و (ب) تسلسل صورة للمنطقة المشار إليها بالمربع الأبيض المتقطع في (أ) الذي يصور إسراف الديكتران (الأخضر) والجسيمات النانوية (الأحمر). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. التكبير هو 20x. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وتم الجمع بين طرق مختلفة للفحص المجهري البصري للحصول على معلومات عن الخطوات المختلفة في توصيل الجسيمات النانوية من سطح الفقاعات الصغيرة إلى الوسط المحيط بها. تم إجراء تصوير التذبذبات الفقاعة ، فضلا عن تصوير إطلاق الجسيمات النانوية من قذيفة فقاعة ، والبذخ ، والاختراق من خلال مصفوفة خارج الخلية من الأورام في الجسم الحي. يتيح التصوير في المختبر فحص العديد من معلمات الموجات فوق الصوتية مقارنة بالإعدادات الأكثر تعقيدا في الجسم الحي . الفائدة من الجمع بين هذه المجموعة من طرائق التصوير هي المعلومات التكميلية التي يمكن الحصول عليها في جداول زمنية مختلفة - وهي ميزة حاسمة لتوصيف وتحسين الفقاعات الدقيقة للتسليم الناجح والحصول على فعالية علاجية. هذا النهج مفيد لفهم آليات التسليم لجميع الفقاعات الصغيرة على حد سواء ، بما في ذلك البنى ذات الجسيمات النانوية والأدوية المسماة بالفلورسنت.

الخطوات الأكثر أهمية في طرق المجهر المستخدمة لدراسة الفقاعات الصغيرة واحدة هي على النحو التالي. بالنسبة للمجهر الفلوري، يجب وضع علامة فلورية على الجسيمات النانوية لتمكين تصور إطلاق الجسيمات. وعلاوة على ذلك، ينبغي تخفيف محلول العينة بما يكفي لعزل الفقاعات الصغيرة الواحدة لتحليلها في طرق المجهر الكونفوكوكال، والحقول الساطعة، والمضان. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم اختيار تردد القيادة بالموجات فوق الصوتية والضغط الصوتي لإثارة الفقاعات بكفاءة أكبر ، وهي في رنينها. إذا كان السؤال البحثي يتعلق بتسليم حمولة الجسيمات النانوية ، فيجب أن تكون معلمات الموجات فوق الصوتية المناسبة جزءا من التحقيق. بجانب الرنين، ينبغي أيضا أن تكون مدفوعة هذه الفقاعات عند أو بعد عتبة إطلاق الجسيمات النانوية، وعادة في ارتفاع نسبي في السعة الضغط الصوتي (MI > 0.3)⁵¹. بالنسبة للتصوير المجهري في المجال الساطع، من الضروري اختيار كاميرا عالية السرعة ذات معدل إطار مرتفع بما يكفي لتقليل ضبابية الحركة وتجنب الأسماء المستعارة.

يقتصر المجهر ذو المجال الساطع بشكل رئيسي على معدل إطارات التصوير وكثافة مصادر الضوء المتاحة ، حيث أن معدل الإطارات الأعلى سيعطي نظرة أكثر تفصيلا مع الوقت في ديناميكيات الفقاعة ، ولكنه يتطلب إضاءة أكثر كثافة بسبب أوقات التعرض الأقصر. لدراسة إطلاق الجسيمات بمزيد من التفصيل ، يمكن زيادة معدل الإطار للتصوير الفلوري ، من حيث المبدأ ، عن طريق زيادة كثافة ضوء الليزر. ومع ذلك ، فإن امتصاص ضوء الليزر عالي الكثافة بواسطة الفقاعات الدقيقة ذات العلامات الفلورية يولد الحرارة ، حتى مع الأصباغ ذات العائد الكمي العالي. يمكن أن تتداخل هذه الحرارة مع التجارب على المحك ، وفي الحالات القصوى ، تحفز التجويف الحراري ^للصور52. وهكذا ، في الممارسة العملية ، هناك حد لطلاقة الليزر المطبقة. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام إضاءة الليزر المكثفة عمدا للحث على إطلاق الجسيمات من ^liposomes53. تؤثر درجة الحرارة على ديناميكيات الفقاعات والاستجابة بالموجات فوق الصوتية ، اعتمادا على نوع ^{الفقاعة54}. لذلك، إذا كان ينبغي مقارنة الأساليب داخل المختبر وداخل الفيتية بموضوعية، ينبغي أن يتم تنفيذ الأساليب في المختبر التي نوقشت في البروتوكول عند 37 درجة مئوية. وهناك قيد آخر على طرق المختبر التي نوقشت في الورقة الحالية هو أن الفقاعات ليست في بيئة حرة، حيث أن الفقاعات الدقيقة سوف تطفو تحت غشاء حامل العينة. وعلاوة على ذلك ، هناك تحيز الاختيار عند تصوير الفقاعات الصغيرة واحد. ومع ذلك ، فإن إجراء تجارب متكررة على فقاعات واحدة يسمح بالتحقيق في تأثير الحجم وإزالة توزيع العامل المحير - الحجم. إذا كان من الممكن فهم استجابة الفقاعة كدالة للحجم في حين أن التركيز ليس مرتفعا جدا لمنع التفاعلات بين الفقاعات ، فيمكن حساب استجابة أي مجموعة فقاعة تعسفية. وأخيرا، توفر طرق الفحص المجهري ذات المجال الساطع والمضان نظرة ثاقبة على الفقاعات الدقيقة الملتوية في صورة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد). إذا تطلب سؤال البحث أكثر من التصوير ثلاثي الأبعاد، يمكن حل السلوك ثلاثي الأبعاد للفقاعات من خلال الجمع بين الإعداد الموضح في البروتوكول وإعداد الرؤية الجانبية للتصوير متعدد ^{الكواكب55}.

طريقة بديلة لدراسة الفقاعات الدقيقة هي التوصيف ^{الصوتي56}. ومع ذلك ، فإن قياس صدى الفقاعات الصغيرة الواحدة يتطلب تحديد وعزل فقاعات صغيرة واحدة داخل شعاع الموجات فوق ^{الصوتية56} ، مما يشكل تحديا يتم معالجته عادة باستخدام أنبوب ضيق أو ملاقط بصرية أو ^{صوتية5758}. لحجم الفقاعات صوتيا، يمكن أن تكون الفقاعات الدقيقة متقنة في نظام التشتت الهندسي بترددات أعلى بكثير من تردد الرنين، الذي لا يحفز تذبذبات الفقاعات الدقيقة ^{الحجمية59}. استخدام "كاميرا صوتية" هو مثل هذه الطريقة لتصوير الديناميات الشعاعية من microbubbles واحد ردا على الموجات فوق الصوتية، حيث يتم استخدام مسبار الموجات فوق الصوتية عالية التردد لتحديد الاستجابة الشعاعية للفقاعة إلى موجة القيادة منخفضة ^{التردد60}. وعيب هذه الطريقة هو أنه لا يمكن استخدامها إلا لتحديد التغير النسبي لنصف قطر الفقاعات الصغيرة؛ ومن ثم، هناك حاجة إلى طريقة أخرى لتحديد نصف قطر الفقاعة المطلق، على سبيل المثال، من خلال التصوير ^{البصري61,62}. عيب الطرق التي تتعرض فيها الفقاعات الدقيقة للموجات فوق الصوتية بترددات أعلى من تردد الرنين هو أنه في مثل هذه الترددات العالية ، ينخفض عمق ^{الاختراق59} ، مما يحد من قابلية الاستخدام لتطبيقات الجسم الحي. ويمكن أيضا استخدام أشكال أخرى من المجهر لدراسة الفقاعات الدقيقة مثل المسح المجهري الإلكتروني، والمجهر القوة الذرية، والمجهر الإلكتروني ^{انتقال63}. ومع ذلك، فإن الدقة الزمنية القابلة للتحقيق لهذه التقنيات المجهرية البديلة محدودة بشكل عام، وهذه التقنيات لها عيب في أن يتم التصوير إما قبل أو بعد التعرض بالموجات فوق الصوتية عن طريق التحليل خارج الخط وعادة ما تقدم إنتاجية ^{منخفضة63}. وثمة بديل آخر هو استخدام طريقة تشتت الضوء، والتي يمكن استخدامها لدراسة الديناميات الشعاعية للفقاعات الصغيرة المفردة في الوقت الحقيقي، ولكن لديها نسبة إشارة منخفضة إلى الضوضاء بالمقارنة مع أساليب التشتت ^{الصوتي64}.

في الوقت الحقيقي المجهر أثناء التعرض بالموجات فوق الصوتية هو وسيلة قوية للحصول على نظرة جديدة على الأوعية الدموية، وسلوك الفقاعات الدقيقة، والجسيمات النانوية، أو جزيئات أخرى (مثل dextran في هذه الحالة) أثناء التعرض بالموجات فوق الصوتية. وهناك قيود عامة عند إجراء المجهر داخل الجسم في الوقت الحقيقي هو أن يتم تصوير مساحة صغيرة فقط من الأنسجة، وعمق اختراق الضوء في الأنسجة محدودة. إذا كانت الأوعية المصورة تحتوي على عدد قليل جدا من الفقاعات الدقيقة و / أو الجسيمات النانوية داخل مجال الرؤية ، يمكن الحصول على معلومات قليلة أو معدومة عن سلوك الجسيمات النانوية والبذخ. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب مجال الرؤية المحدود ، فإن المحاذاة المناسبة بين مسارات الضوء والموجات فوق الصوتية أمر بالغ الأهمية. إذا كان ضغط الموجات فوق الصوتية مرتفعا بما يكفي للحث على تدمير الفقاعات ، فمن المهم أيضا اختيار تردد تكرار النبض الذي يسمح للفقاعات الطازجة بالتشويش في مجال الرؤية بين نبضات الموجات فوق الصوتية. وعلاوة على ذلك، كما سيتم عكس الموجات فوق الصوتية من الزجاج الغطاء في غرفة النافذة والهدف، ووضع محول في زاوية من المهم للحد من انعكاسات لمنع تشكيل موجات الدائمة، والتي تشوه مجال الضغط معايرة. مسألة عملية أخرى هي أن الإعداد يحتاج إلى مساحة كافية لتركيب محول الموجات فوق الصوتية و waveguide فوق أو تحت الهدف في إعداد المجهر. الأورام في غرفة النافذة الظهرية سيكون لها سمك محدود بسبب غرفة حصر وزلة الغطاء. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، يمكن استخدام نماذج أخرى. ومن الأمثلة على ذلك الأورام الجلدية، على سبيل المثال، في وسادة الدهون ^{الثديية65} أو التصوير داخل البطن للأورام في مختلف ^{الأعضاء66}. يمكن زراعة هذه الأورام بشكل متعامد في البيئة الدقيقة المناسبة ، وعلى هذا النحو ، تقدم حالة أكثر ملاءمة سريريا.

الأساليب الموصوفة في هذا العمل تنير إمكانات الفقاعات الصغيرة ذات العلامات الفلورية لدراسة أساسيات تطبيقات توصيل الأدوية باستخدام الفقاعات والموجات فوق الصوتية. يوفر هذا المزيج من طرق الفحص المجهري نظرة قيمة على استجابة الفقاعات الدقيقة لطنين الموجات فوق الصوتية ومساحة المعلمة الصوتية المرتبطة بها ويقدم رؤية واضحة لسلوك الفقاعات الدقيقة والحمولة على مدى مجموعة ذات صلة من جداول الوقت والطول.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026	Tabor Electronics		Arbitrary waveform generator (programmable)
2100 L	ENI		Amplifier, used in window chamber setup
2 MDa dextran	Sigma-Aldrich
33522 A	Agilent Technologies		Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup
A1R	Nikon Instruments		Confocal microscope
ACE I	SCHOTT		Dimmable AC halogen light source
Atipemazol	Orion Pharma		Antidote to wake animal
Baytril	Bayer		Enrofloxacin
BD Neoflon 24 G	Becton Dickinson & Company		Tail vein catheter
BNC model 575	Berkely Nucleonics Corporation		Pulse/delay generator
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner	Branson		Ultrasonic bath
Channel slide	Ibidi
CLINIcell 25	Laboratoires Mabio International		Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm)
Cohlibri	Lightline		Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm)
DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope	Tektronix		Oscilloscope
Fentanyl	Actavis Group HF		Anaesthesia of mouse
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich		Supplement for cell culture medium
Fiber-optic hydrophone	Precision Acoustics		Used for alignment
Flumanezil	Fresenius Kabi		Antidote to wake animal
Heated animal holder	Custom design		A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber
Hyper Vision HPV-X2	Shimadzu		High-speed camera
ImageJ	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin		open source image processing program
In vivo SliceScope	Scientifica		Multiphoton microscope
Isoflurane	Baxter
ISOTON	Beckman Coulter		Filtered, phosphate-buffered saline solution
LUMPLFLN60XW	Olympus		Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm)
MaiTai DeepSee	Spectra-Physics		Pulsed laser
MATLAB	Mathworks		Programming environment
Medetomidine	Orion Pharma		Anesthesia of mouse
Midazolam	Accord Healthcare Limited		Anesthesia of mouse
Milli-Q	Merck		Ultrapure water
MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe	PerkinElmer		Strobe light
Panametrics-NDT C305	Olympus		Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1")
Panametrics-NDT V304	Olympus		Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25")
Penicillin	Sigma-Aldrich		Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals
Perfluoropropane gas	F2 Chemicals
Roswell Park Memorial Institute 1640	Gibco Thermo-Fisher		Cell culture medium
Safe-Lock tube	Eppendorf
Streptomycin	Sigma-Aldrich		Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals
T 25 basic ULTRA-TURRAX	IKA laboratory technology		Dispersion tool
TDS 210	Tektronix		Oscilloscope, used in window chamber setup
Transducer	Precision Acoustics Ltd		Used in window chamber setup
U-TLU	Olympus		Tube lens
VBA100-200	Vectawave		Amplifier
Window chambers	Custom made		Used in window chamber setup
XLUMPLFLN20 XW	Olympus		20x water dipping objective
XY(Z) translation stages	Thorlabs