JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في علم الأمراض العصبية لمرض الزهايمر ، تتمثل إحدى أهم الخصائص في ترسب β الأميلويد. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة تلطيخ الفلورسنت المناعي في الفأر المعدل وراثيا 5×FAD للكشف عن تراكم β الأميلويد في اللويحات. سيتم وصف عملية التروية والتشريح بالتبريد والتلوين والقياس الكمي بالتفصيل.

Abstract

مرض الزهايمر (AD) هو مرض تنكسي عصبي يساهم في 60-70٪ من الخرف في جميع أنحاء العالم. تكمن إحدى السمات المميزة لمرض الزهايمر بلا شك في تراكم β الأميلويد (Aβ) في الدماغ. يتم إنتاج Aβ من الانقسام المحلل للبروتين للسلائف بيتا أميلويد (APP) بواسطة β-secretase و γ-secretase. في الظروف المرضية ، يؤدي الانقسام المتزايد β ل APP إلى الإفراط في إنتاج Aβ ، والذي يتجمع في لويحات Aβ. نظرا لأن لويحات Aβ هي سمة من سمات أمراض مرض الزهايمر ، فإن اكتشاف كمية Aβ مهم جدا في أبحاث مرض الزهايمر. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة تلطيخ الفلورسنت المناعي لتصور ترسب Aβ. نموذج الفأر المستخدم في تجاربنا هو 5×FAD ، والذي يحمل خمس طفرات موجودة في AD العائلي البشري. تم توثيق العجز العصبي المرضي والسلوكي للفئران 5xFAD جيدا ، مما يجعلها نموذجا حيوانيا جيدا لدراسة أمراض Aβ. سنقدم الإجراء بما في ذلك نضح القلب ، والتقطيع بالتبريد ، والتلوين المناعي الفلوري ، والقياس الكمي للكشف عن تراكم Aβ في فئران 5×FAD. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين التحقيق في علم أمراض Aβ في نموذج فأر AD.

Introduction

مرض الزهايمر (AD) هو مرض تنكسي عصبي يسبب 60٪ -70٪ من الخرف في جميع أنحاء العالم ويكلف الكثير من الموارد الاجتماعية1. من المعروف أن تراكم β الأميلويد (Aβ) هو سمة مميزة مرضية لمرض الزهايمر. بروتين سلائف الأميلويد (APP) هو بروتين غشائي متكامل موجود في العديد من الأنسجة. يتم إنتاج الببتيد Aβ ، الذي يتكون من 36-42 من الأحماض الأمينية2 ، عن طريق الانقسام اللاحق ل β- و γ-secretase في APP3،4. تؤدي التغييرات في انقسام APP والطفرات في جين APP إلى الإفراط في إنتاج Aβ. يمكن أن تتجمع جزيئات Aβ لتشكيل قلة أو ألياف ، والتي يعتقد أنها سامة للأعصاب5،6. في الدراسات السابقة ، ثبت أن تراكم Aβ مرتبط بموت الخلايا العصبية في7،8،9 بعد الميلاد.

تحتوي الفئران المعدلة وراثيا 5×FAD (C57BL / 6J) على 3 طفرات في APP ، وطفرتين في PSEN1. يبدأ تراكم Aβ داخل الخلايا في وقت مبكر من عمر 1.5 شهر. تم العثور على تراكم Aβ خارج الخلية حوالي شهرين ، في القشرة والحصين. زاد التراكم بسرعة مع سن10 سنوات. إن علم أمراض Aβ الموثق جيدا يجعله نموذجا حيوانيا جيدا لبروتوكولنا.

الهدف من طريقة التلوين الموصوفة هو تصور وقياس ترسب Aβ في دماغ نموذج الفئران المزيل بمرض الزهايمر. سيتم تقديم الإجراء بما في ذلك نضح بارافورمالديهايد عبر القلب ، والتقطيع بالتبريد ، والتلوين المناعي الفلوري ، والقياس الكمي للكشف عن تراكم Aβ في الفئران المصابة ب 5×FAD. هذا البروتوكول هو طريقة موثوقة وسهلة للتحقيق في علم أمراض Aβ في نموذج فأر AD.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة Xuzhou الطبية ووفقا للمبادئ التوجيهية للوائح الحكومية الصينية لرعاية واستخدام المختبر.

1. نضح الفئران

ملاحظة: يمكن الرجوع إلى مزيد من التفاصيل حول إجراء التروية إلى الفيديو من مختبر ويليام شاين 11.

  1. تخدير الفئران المعدلة وراثيا 5×FAD (C57BL / 6J) مع 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كجم من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق12،13. يشير فقدان الاستجابة لقرص المخلب الخلفي إلى التخدير المناسب. لا تبدأ التروية قبل تخدير الفأر بشكل صحيح.
  2. استخدم أربعة دبابيس لتثبيت الأطراف على لوح الرغوة. ضع بطن الفأر المخدر لأعلى ، مع شد أطرافه بشكل كاف. استخدم زوجا من مقص القزحية لعمل شق في عملية الخنجري. ثم سيتم الكشف عن الحجاب الحاجز.
  3. استخدم مقصا جراحيا لعمل شق في الحجاب الحاجز ، واستمر في شق الحجاب الحاجز بعناية إلى الحد العلوي للقفص الصدري. قطع الأضلاع والعضلات الصدرية ، وتشريح الأنسجة المرفقة لكشف القلب.
  4. ابحث عن الأذين الأيمن للماوس. اقطع الأذين الأيمن باستخدام مقص القزحية.
  5. حقن 20 مل من 37 درجة مئوية PBS (0.01 M، درجة الحموضة 7.2-7.4) من البطين الأيسر للقلب لطرد الدم. ثم حقن ببطء 20 مل من 4٪ PFA من درجة حرارة الغرفة من البطين الأيسر لإصلاح الأنسجة. يبلغ معدل حقن PBS و 4٪ PFA حوالي 5 مل / دقيقة. يجب ملاحظة رعشة التثبيت في غضون ثوان.
    تحذير: يمكن أن يؤدي 4٪ من PFA إلى تهيج العينين والممرات الهوائية ، وقد تثير الحساسية. يجب أن تتم هذه الخطوة في أماكن جيدة التهوية ، ويجب على المشغل ارتداء نظارات واقية وأقنعة للوجه.
  6. استخدم مقصا جراحيا لقطع الرأس ، وقم بإزالة الجمجمة بعناية ، واستخدم ملقط تشريح واستخراج الدماغ. ثم اغمر الدماغ في 4 مل من 4٪ PFA في أنبوب بلاستيكي سعة 5 مل لمدة 12-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.

2. التضمين والتقطيع بالتبريد

  1. بعد التثبيت في 4٪ PFA ، انقل الدماغ إلى 4 مل من السكروز بنسبة 15٪ في أنبوب بلاستيكي سعة 5 مل عند 4 درجات مئوية. بعد 12-24 ساعة ، يجب أن يغرق الدماغ في القاع.
  2. انقل الدماغ إلى 4 مل من السكروز بنسبة 30٪ في أنبوب بلاستيكي سعة 5 مل عند 4 درجات مئوية لمدة 12-24 ساعة. ثم يكون الدماغ جاهزا للتضمين. الغرض من نقع السكروز التدريجي بنسبة 15٪ و 30٪ هو تجفيف الدماغ ، مما يتجنب تكوين بلورات الجليد داخل الخلايا أثناء التضمين والتقطيع بالتبريد. يمكن تخزين الدماغ المجفف عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد.
  3. اترك ما يقرب من 1 مل من السكروز مع الدماغ في الأنبوب. ثم أضف نفس الحجم ، مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في الأنبوب واخلطه بشكل صحيح. هذا يساعد مركب OCT على لف الدماغ بشكل كاف.
  4. قم بتركيب طبقة سميكة من مركب OCT على سطح المقبض وقم بتجميدها عند -21 درجة مئوية قبل التقطيع بالتبريد. قطع الدماغ سهمي من الوسط. استخدم أي من النصفين للتقسيم في ناظم البرد.
  5. بعد أن يصلب مركب OCT ، قم بتركيب المقبض على رأس العينة وقم بقصه في سطح المنصة. ضع نصف الدماغ على السطح المشذب مع الجانب الأوسط لأسفل.
  6. ضع حلقة من ورق القصدير حول الدماغ لتجنب تسرب مركب OCT ، ثم املأ الحلقة بمركب OCT حتى يتم غمر الدماغ. عندما يتجمد تضمين مركب OCT ، يكون جاهزا للتقسيم.
  7. اضبط سمك القسم على 20 ميكرومتر. اضبط درجة حرارة الغرفة على -21 درجة مئوية ، ودرجة حرارة رأس العينة على -19 درجة مئوية. قسم الدماغ من النهاية المنقارية إلى النهاية الذيلية.
  8. قم بتنظيف بعض PBS على الشرائح الزجاجية. قم بتغطية الشرائح الزجاجية مسبقا بمادة بولي ليسين لمنع تقشير الأقطاع. قم بإرفاق القسم على الشريحة. إذا كان القسم مطويا ، فاستخدم فرشاة ناعمة لفتح الأقسام باستخدام PBS.
  9. جفف الأقسام طوال الليل في درجة حرارة الغرفة وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بالأقسام عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد قبل تلطيخ Aβ.

3. إجراء تلطيخ Aβ

  1. قم بتسخين الأقسام في درجة حرارة الغرفة ، وجفف سطح الشريحة ، واستخدم قلما كارها للماء لرسم دائرة حول القسم لحضانة الأجسام المضادة.
  2. انقع الشريحة في PBS في صندوق تلطيخ بلاستيكي سعة 30 مل لغسل مركب OCT. استخدم ما لا يقل عن 20 مل من PBS.
  3. أضف 100 ميكرولتر من محلول استرجاع المستضد 1x للأقسام المجمدة على الشريحة. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. اغسل محلول الاسترجاع بما لا يقل عن 20 مل من PBS من درجة حرارة الغرفة لمدة 3 مرات (5 دقائق لكل منهما).
  5. أضف الجسم المضاد الأولي المخفف (6E10) على الأقسام واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 16-24 ساعة في صندوق رطب ومظلم (محلول تخفيف الأجسام المضادة الأولي: 1٪ BSA ، 0.3٪ Triton X-100 ، 0.01٪ أزيد الصوديوم في PBS ، تخفيف 1: 500). يعمل BSA كعامل حظر.
  6. اغسل الأقسام باستخدام PBS لمدة 3 مرات ، 5 دقائق في كل مرة.
    ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات 3.7 و 3.8 و 3.9 في مكان مظلم.
  7. احتضان الأقسام في محلول الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) Alexa Flour 594 ، المخفف ب PBS 1: 200) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في صندوق مبلل ومظلم.
  8. اغسل الجسم المضاد الثانوي من الأقسام بما لا يقل عن 20 مل من PBS لمدة 3 مرات ، 5 دقائق في كل مرة.
    ملاحظة: لا تصب PBS على الأقسام أثناء الغسيل لمنع تقشير الأقسام. حافظ على الأقسام رطبة.
  9. امتصاص السائل حول الأقسام وأضف قطرة من وسط التركيب في كل قسم. أغلق الأقسام بغطاء زجاجي ، وتجنب الفقاعات.
  10. راقب الأقسام الملطخة بالمجهر الفلوري. حافظ على اتساق معلمات التصوير لتجنب الاشتقاق. احتفظ بالشرائح عند 4 درجات مئوية في مكان مظلم. قم بتحليل الأقسام في غضون أسبوع واحد ، لأن التلوين سوف يتلاشى بمرور الوقت.

4. تصوير وقياس تراكم Aβ بواسطة ImageJ

  1. التقط الصور بواسطة مجهر مضان متصل بكاميرا رقمية وبرنامج تصوير. استخدمنا برنامج Image Pro Plus وتم تعيين معلمة التصوير على النحو التالي: Exp Pvw: 450 مللي ثانية ، Exp Acq: 450 مللي ثانية ؛ Pvw: 1 × 1 ، ACQ: 1 × 1 ؛ قرار Pvw: العرض 1 × الارتفاع 1 ، دقة ACQ: العرض 1 × الارتفاع 1 ؛ عمق الالتقاط: 8 بت أحادية اللون ؛ الكسب: Pvw: 13 ، Acq: 13 ، Gamma: Pvw: 1 ، Acq: 1 ، Offse: Pvw: -700 ، Acq: -700.
  2. في ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji) ، حدد الإضافات | خياطة | MosaicJ في القائمة. ثم حدد الملفات | افتح تسلسل الصورة لفتح الصور المراد خياطتها (الشكل 1 أ).
  3. سيتم عرض جميع الصور المحددة في الأسفل. بعد خياطة الصور يدويا ، حدد ملف | إنشاء فسيفساء (الشكل 1 ب ، ج ، د).
  4. حدد صورة | ضبط | السطوع / التباين ...، وضبط سطوع الصورة وتباينها (الشكل 3 أ). ثم يمكن حفظ الصورة (الشكل 1E).
  5. لتحديد تراكم Aβ ، افتح الصورة من خلال ملف | مفتوح... في القائمة (الشكل 2 أ).
  6. حدد صورة | النوع | 8 بت لضبط الصورة على 8 بت. ثم اختر المنطقة المراد عدها باستخدام تحديد المضلع (الشكل 2 ب).
  7. حدد صورة | ضبط | عتبة لتحديد العتبة المناسبة للإشارات. يمكن ضبط العتبة عن طريق سحب أشرطة التمرير أو تغيير الأرقام مباشرة في مربع النص (الحد الأقصى: 255 ، الحد الأدنى: 0). عندما تصبح جميع إشارات Aβ في القسم حمراء ، تكون العتبة مناسبة للقياس (الشكل 2C). تأكد من تحديد مربع الخلفية الداكنة .
  8. تحديد تحليل | تعيين القياس... في القائمة لاختيار المعلمات التي ستظهر في النتائج. تأكد من تحديد الكثافة المتكاملة والحد إلى الحد. الكثافة المتكاملة (الكثافة الكلية) هي هدف القياس (الشكل 2 د).
  9. حدد تحليل | قم بالقياس للحصول على النتائج. سيتم عرض النتائج وجاهزة للتحليل الإحصائي (الشكل 2 هاء).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

استخدمنا إجراءات تلطيخ الفلورسنت المناعي الموصوفة أعلاه للتحقيق في ترسب تراكم Aβ في فئران 5×FAD من مختلف الأعمار. يمثل الشكل 3 النتائج النموذجية والنتائج دون المستوى الأمثل باستخدام بروتوكولنا. تم تلطيخ شرائح الدماغ من الفئران المعدلة وراثيا 5×FAD متغايرة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن أن يكتشف تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام الجسم المضاد 6E10 على وجه التحديد تراكم Aβ في الدماغ ، والذي يسهل قياسه كميا بواسطة الصورة J. ما يجدر الانتباه هو أن بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول قد تؤثر على النتائج.

لمنع الشرائح من التقشير أو الكسر الم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من خلال مشروع عام لمؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة: 81974157) من مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين ، وأستاذية معينة خاصة في جيانغسو (إلى CL) من إدارة التعليم في جيانغسو ، وبرنامج فريق الابتكار وريادة الأعمال في مقاطعة جيانغسو (إلى H.Z. ، A. L. ، W.W. ، C.L. و YS) ، منحة أولية للمواهب الممتازة (D2019025) وبرنامج التدريب على الابتكار وريادة الأعمال (201910313038Z إلى Z.S. ، YX و MZ و JD.) من جامعة Xuzhou الطبية. تم دعم هذا البحث أيضا من قبل المركز الوطني التجريبي لتعليم العلوم الطبية الأساسية التجريبية (جامعة Xuzhou الطبية).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetia
Injection syringeKLMEDICAL1 mL
Pentobarbitual sodiumSigma-AldrichP37611% in saline for i.p. injection
Thoracotomy:
IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm)RWDS12010-11
Sharp curved surgical scissors(11.5 cm)RWDS14016-11
Straight dissecting forceps (~10.5 cm)RWDF12010-10
Perfusion
Centrifugal tube (5 mL)Biosharp
Injection syringeKLMEDICAL20 mL
ParaformaldehydeVicmedVIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) powderVicmedVC2001PAdd deionized water to make solution
Fixation, Dehydration and Cryosectioning
Adhesion microscope slidesCITOTEST18810576.2 mm × 25.4 mm
Microtome CryostatLEICACM1950
Optimal cutting temperature compound (OCT)Sakura Finetek4583
SucroseVETECV900116
Immunofluorescence staining
Fluorescence microscopeOLYMPUSIX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11005200X
Image-Pro Plus 7.0CMedia CyberneticsScientific graphing and data analysis software
Immunohistochemical Wet Box (black)SinylabCustomized300 mm × 100 mm × 38 mm, groove depth 27 mm, can contain 10 standard slides
PipetThermo Scientific
Pipette tipsWell-offer
Plastic staining boxSinylabCustomized30 mL, can contain 5 standard slides
Primary Antibody Dilution Buffermade in our lab1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% sodium azide 10mg in 100ml PBS
Purified anti beta amyloid,1-16 antibody (6E10)BiolegendSIG-39320500X
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen SectionsKeyGEN BioTECHKGIHC0055X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1GraphpadMedical mapping software
Image J Fiji 2.0.0National Institute of HealthScientific graphing and data analysis software

References

  1. Burns, A., Iliffe, S. Alzheimer's disease. BMJ. 338, 158(2009).
  2. Leong, Y. Q., Ng, K. Y., Chye, S. M., Ling, A. P. K., Koh, R. Y. Mechanisms of action of amyloid-beta and its precursor protein in neuronal cell death. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 11-30 (2020).
  3. Tiwari, S., Atluri, V., Kaushik, A., Yndart, A., Nair, M. Alzheimer's disease: pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. International Journal of Nanomedicine. 14, 5541-5554 (2019).
  4. Murphy, M. P., LeVine, H. Alzheimer's disease and the amyloid-beta peptide. Journal of Alzheimer's Disease. 19 (1), 311-323 (2010).
  5. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256 (5054), 184-185 (1992).
  6. Reitz, C. Alzheimer's disease and the amyloid cascade hypothesis: a critical review. International Journal of Alzheimer's Disease. 2012, 369808(2012).
  7. Bozyczko-Coyne, D., et al. CEP-1347/KT-7515, an inhibitor of SAPK/JNK pathway activation, promotes survival and blocks multiple events associated with Abeta-induced cortical neuron apoptosis. Journal of Neurochemistry. 77 (3), 849-863 (2001).
  8. Canevari, L., Abramov, A. Y., Duchen, M. R. Toxicity of amyloid beta peptide: tales of calcium, mitochondria, and oxidative stress. Neurochemical Research. 29 (3), 637-650 (2004).
  9. Zhu, X., et al. Oxidative stress signalling in Alzheimer's disease. Brain Research. 1000 (1-2), 32-39 (2004).
  10. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  12. An, S., et al. Medial septum glutamatergic neurons control wakefulness through a septo-hypothalamic circuit. Current Biology. , (2021).
  13. Cao, J. L., et al. Activation of peripheral ephrinBs/EphBs signaling induces hyperalgesia through a MAPKs-mediated mechanism in mice. Pain. 139 (3), 617-631 (2008).
  14. Ly, P. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. Journal of Visualized Experiments. (53), e2831(2011).
  15. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
  16. Hatami, A., Albay, R., Monjazeb, S., Milton, S., Glabe, C. Monoclonal antibodies against Abeta42 fibrils distinguish multiple aggregation state polymorphisms in vitro and in Alzheimer disease brain. Journal of Biological Chemistry. 289 (46), 32131-32143 (2014).
  17. Shi, X. Z., Wei, X., Sha, L. Z., Xu, Q. Comparison of beta-Amyloid Plaque Labeling Methods: Antibody Staining, Gallyas Silver Staining, and Thioflavin-S Staining. Chinese Medical Sciences Journal. 33 (3), 167-173 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

A 5xFAD APP A

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved