Nachweis der Amyloid-β-Akkumulation durch Immunfluoreszenzfärbung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit

Zusammenfassung

In der Neuropathologie der Alzheimer-Krankheit ist eines der wichtigsten Merkmale die Ablagerung von Amyloid-β. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode der Immunfluoreszenzfärbung in 5×FAD-transgenen Mäusen zum Nachweis der Amyloid-β-Akkumulation in Plaques. Der Prozess der Perfusion, Kryosektion, Färbung und Quantifizierung wird detailliert beschrieben.

Zusammenfassung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die weltweit zu 60-70 % der Demenzerkrankungen beiträgt. Eines der Kennzeichen von AD liegt zweifellos in der Akkumulation von Amyloid-β (Aβ) im Gehirn. Aβ wird aus der proteolytischen Spaltung des Beta-Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch β-Sekretase und γ-Sekretase hergestellt. Unter pathologischen Umständen führt die vermehrte β-Spaltung von APP zu einer Überproduktion von Aβ, das sich zu Aβ-Plaques aggregiert. Da Aβ-Plaques ein Merkmal der AD-Pathologie sind, ist der Nachweis der Menge an Aβ in der AD-Forschung sehr wichtig. In diesem Protokoll stellen wir die Immunfluoreszenz-Färbemethode vor, um die Aβ-Abscheidung sichtbar zu machen. Das Mausmodell, das in unseren Experimenten verwendet wird, ist 5×FAD, das fünf Mutationen trägt, die bei menschlicher familiärer AD gefunden wurden. Die neuropathologischen und verhaltensbezogenen Defizite von 5xFAD-Mäusen sind gut dokumentiert, was es zu einem guten Tiermodell für die Untersuchung der Aβ-Pathologie macht. Wir werden das Verfahren vorstellen, das Transkardperfusion, Kryosektionen, Immunfluoreszenzfärbung und Quantifizierung zum Nachweis der Aβ-Akkumulation in 5×FAD-Mäusen umfasst. Mit diesem Protokoll können Forscher die Aβ-Pathologie in einem AD-Mausmodell untersuchen.

Einleitung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die weltweit 60 bis 70 % Demenz verursacht und viel soziale Ressourcen kostet¹. Es ist allgemein bekannt, dass die Akkumulation von Amyloid-β (Aβ) ein pathologisches Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit ist. Das Amyloid-Vorläuferprotein (APP) ist ein integrales Membranprotein, das in vielen Geweben vorkommt. Das Aβ-Peptid, bestehend aus 36-42 Aminosäuren², wird durch die anschließende Spaltung von β- und γ-Sekretase in APP ^3,4 hergestellt. Veränderungen in der APP-Spaltung und Mutationen im APP-Gen führen zu einer Überproduktion von Aβ. Aβ-Moleküle können sich zu Oligomeren oder Fibrillen zusammenschließen, von denen angenommen wird, dass sie neurotoxisch sind ^5,6. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die Akkumulation von Aβ mit dem neuronalen Tod in^{den Jahren 7,8,9} n. Chr. korreliert.

Die 5×FAD (C57BL/6J) transgenen Mäuse enthalten 3 Mutationen in APP und 2 Mutationen in PSEN1. Die Akkumulation von intrazellulärem Aβ beginnt bereits im Alter von 1,5 Monaten. Eine extrazelluläre Akkumulation von Aβ wurde etwa 2 Monate lang in der Hirnrinde und im Hippocampus gefunden. Die Akkumulation nahm mit dem Alter von¹⁰ Jahren rapide zu. Die gut dokumentierte Aβ-Pathologie macht es zu einem guten Tiermodell für unser Protokoll.

Das Ziel der beschriebenen Färbemethode ist es, die Aβ-Ablagerung im Gehirn von AD-Mäusemodellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Das Verfahren, das die transkardiale Paraformaldehyd-Perfusion, Kryosektionen, Immunfluoreszenzfärbung und Quantifizierung zum Nachweis der Aβ-Akkumulation in 5×FAD-Mäusen umfasst, wird vorgestellt. Dieses Protokoll ist eine zuverlässige und einfache Methode zur Untersuchung der Aβ-Pathologie im AD-Mausmodell.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Xuzhou Medical University und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der chinesischen Regierungsvorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Perfusion von Mäusen

HINWEIS: Weitere Einzelheiten zum Perfusionsverfahren finden Sie im Video aus Wiliam Shains Labor ¹¹.

1. Anästhesieren Sie 5×FAD (C57BL/6J) transgene Mäuse mit 1 % Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion^12,13. Der Verlust der Reaktion auf das Einklemmen der Hinterpfoten deutet auf eine ordnungsgemäße Anästhesie hin. Beginnen Sie nicht mit der Perfusion, bevor die Maus ordnungsgemäß betäubt wurde.
2. Verwenden Sie vier Stifte, um die Gliedmaßen auf der Polyschaumdiele zu befestigen. Setze den Bauch der betäubten Maus nach oben, wobei die Gliedmaßen ausreichend gestreckt sind. Verwenden Sie eine Irisschere, um einen Schnitt am Xiphoid-Prozess zu machen. Dann wird die Membran freigelegt.
3. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Schnitt am Zwerchfell zu machen, und setzen Sie den Zwerchfellschnitt vorsichtig bis zur oberen Grenze des Brustkorbs fort. Schneiden Sie die Rippen und Brustmuskeln auf, präparieren Sie das anhaftende Gewebe, um das Herz freizulegen.
4. Finde das rechte Atrium der Maus. Schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer Irisschere auf.
5. Injizieren Sie 20 ml 37 °C PBS (0,01 m, pH 7,2-7,4) aus dem linken Ventrikel des Herzens, um das Blut auszuspülen. Injizieren Sie dann langsam 20 ml 4% PFA mit Raumtemperatur aus dem linken Ventrikel, um das Gewebe zu fixieren. Die Injektionsrate von PBS und 4% PFA liegt bei etwa 5 ml/min. Fixationszittern sollte innerhalb von Sekunden beobachtet werden.
   ACHTUNG: 4% PFA kann Augen und Atemwege reizen und allergische Reaktionen hervorrufen. Dieser Schritt sollte an belüfteten Räumen durchgeführt werden, und der Bediener sollte eine Schutzbrille und einen Mundschutz tragen.
6. Schneiden Sie den Kopf mit einer chirurgischen Schere ab, entfernen Sie vorsichtig den Schädel, verwenden Sie eine Präparierzange und extrahieren Sie das Gehirn. Tauchen Sie dann das Gehirn für 12-24 Stunden bei 4 °C in 4 ml 4 % PFA in ein 5 ml-Kunststoffröhrchen.

2. Einbettung und Kryosektion

1. Nach der Fixierung in 4 % PFA wird das Gehirn in 4 ml 15 % Saccharose in einem 5 ml-Kunststoffröhrchen bei 4 °C überführt. Nach 12-24 h sollte das Gehirn zu Boden sinken.
2. Übertragen Sie das Gehirn in 4 ml 30%ige Saccharose in einem 5 ml-Kunststoffröhrchen bei 4 °C für 12-24 Stunden. Dann ist das Gehirn bereit für die Einbettung. Der Zweck des schrittweisen Einweichens mit 15 % und 30 % Saccharose besteht darin, das Gehirn zu dehydrieren, wodurch die Bildung von Eiskristallen in den Zellen während der Einbettung und Kryosektion vermieden wird. Das dehydrierte Gehirn kann eine Woche lang bei 4°C gelagert werden.
3. Lassen Sie etwa 1 ml Saccharose mit dem Gehirn in der Röhre. Geben Sie dann die gleiche Volumenmasse mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) in die Tube und mischen Sie sie richtig. Dies hilft der OCT-Verbindung, das Gehirn besser zu umhüllen.
4. Montieren Sie eine dicke Schicht OCT-Verbindung auf die Noppenoberfläche und frieren Sie sie bei -21 °C ein, bevor Sie kryosektionieren. Schneiden Sie das Gehirn sagittal von der Mitte aus; Verwenden Sie eine der beiden Hälften zum Schneiden in einem Kryostaten.
5. Nachdem die OCT-Masse erstarrt ist, montieren Sie den Knopf auf dem Probenkopf und schneiden Sie ihn zu einer Plattformoberfläche ab. Lege eine Hälfte des Gehirns mit der Mittelseite nach unten auf die getrimmte Fläche.
6. Legen Sie einen Alufolienring um das Gehirn, um ein Austreten der OCT-Verbindung zu vermeiden, und füllen Sie dann den Ring mit OCT-Verbindung, bis das Gehirn untergetaucht ist. Wenn die OCT-Verbundeinbettung erstarrt, ist sie bereit für das Schneiden.
7. Stellen Sie die Dicke des Profils auf 20 μm ein. Stellen Sie die Kammertemperatur auf -21 °C und die Temperatur des Probenkopfes auf -19 °C ein. Schneiden Sie das Gehirn vom rostralen Ende bis zum kaudalen Ende.
8. Streichen Sie etwas PBS auf die Objektträger. Beschichten Sie die Objektträger mit Polylysin, um ein Ablösen der Teile zu verhindern. Befestigen Sie den Abschnitt an der Folie. Wenn der Abschnitt gefaltet ist, verwenden Sie eine weiche Bürste, um die Abschnitte mit PBS zu entfalten.
9. Die Abschnitte über Nacht bei Raumtemperatur trocknen und bei -20 °C lagern. Die Schnitte können bis zu einem Monat vor der Aβ-Färbung bei -20 °C aufbewahrt werden.

3. Aβ Färbeverfahren

1. Erwärmen Sie die Schnitte bei Raumtemperatur, trocknen Sie die Objektträgeroberfläche und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis um den Schnitt für die Antikörperinkubation.
2. Weichen Sie den Objektträger in PBS in einer 30-ml-Kunststofffärbebox ein, um die OCT-Verbindung abzuwaschen. Verwenden Sie mindestens 20 ml PBS.
3. Geben Sie 100 μl 1x Antigen-Rückgewinnungslösung für Schnellschnitte auf den Objektträger. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Waschen Sie die Rückhollösung 3 Mal (jeweils 5 Minuten) mit mindestens 20 ml PBS bei Raumtemperatur.
5. Verdünnter Primärantikörper (6E10) wird auf die Schnitte gegeben und bei 4 °C für 16-24 Stunden in einer nassen, dunklen Box inkubiert (Primärantikörper-Verdünnungslösung: 1 % BSA, 0,3 % Triton X-100, 0,01 % Natriumazid in PBS, 1:500 Verdünnung). BSA fungiert als Blockiermittel.
6. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal à 5 Minuten lang mit PBS.
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.7, 3.8 und 3.9 an einem dunklen Ort aus.
7. Die Abschnitte werden in einer Sekundärantikörperlösung (Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Alexa Flour 594, verdünnt mit PBS 1:200) 1 h lang bei Raumtemperatur in einer feuchten, dunklen Box inkubiert.
8. Waschen Sie den Sekundärantikörper 3 Mal lang jeweils 5 Minuten lang mit mindestens 20 ml PBS von den Schnitten ab.
   HINWEIS: Gießen Sie während des Waschens kein PBS auf die Abschnitte, um ein Ablösen der Abschnitte zu verhindern. Halten Sie die Abschnitte feucht.
9. Nehmen Sie die Flüssigkeit um die Abschnitte auf und geben Sie einen Tropfen Einbettmittel auf jeden Abschnitt. Versiegeln Sie die Abschnitte mit Abdeckglas, um Blasen zu vermeiden.
10. Betrachten Sie die gefärbten Schnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop. Halten Sie die Bildgebungsparameter konsistent, um Ableitungen zu vermeiden. Bewahren Sie die Objektträger bei 4°C an einem dunklen Ort auf. Analysieren Sie die Schnitte innerhalb einer Woche, da die Flecken mit der Zeit verblassen.

4. Bildgebung und Quantifizierung der Aβ-Akkumulation durch ImageJ

1. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einer Digitalkamera und einer Bildgebungssoftware verbunden ist. Wir haben die Image Pro Plus-Software verwendet und die Bildgebungsparameter wie folgt eingestellt: Exp Pvw: 450 ms, Exp Acq: 450 ms; PvW: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Pvw-Auflösung: Breite 1 × Höhe 1, acq-Auflösung: Breite 1 × Höhe 1; Aufnahmetiefe: 8-Bit-Mono; Gewinn: PvW: 13, Acq: 13, Gamma: PvW: 1, Acq: 1, Offse: PvW: -700, Acq: -700.
2. Wählen Sie in ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji) Plugins | Nähte | MosaicJ im Menü. Wählen Sie dann Dateien | Öffnen Sie die Bildsequenz , um die Bilder zu öffnen, die zusammengefügt werden sollen (Abbildung 1A).
3. Alle ausgewählten Bilder werden unten angezeigt. Nachdem Sie die Bilder manuell zusammengefügt haben, wählen Sie Datei | Erstellen Sie ein Mosaik (Abbildung 1B, C, D).
4. Bild auswählen | Anpassen | Helligkeit/Kontrast ..., und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes an (Abbildung 3A). Anschließend kann das Bild gespeichert werden (Abbildung 1E).
5. Um die Akkumulation von Aβ zu quantifizieren, öffnen Sie das Bild über Datei | Offen... im Menü (Abbildung 2A).
6. Bild auswählen | Typ | 8-Bit, um das Bild auf 8-Bit anzupassen. Wählen Sie dann mit der Polygonauswahl den Bereich aus, der gezählt werden soll (Abbildung 2B).
7. Bild auswählen | Anpassen | Schwellenwert zur Auswahl des richtigen Schwellenwerts für Signale. Der Schwellenwert kann durch Ziehen der Bildlaufleisten angepasst oder die Zahlen direkt im Textfeld geändert werden (maximal: 255, minimal: 0). Wenn alle Aβ-Signale in der Sektion rot geworden sind, ist der Schwellenwert für die Messung geeignet (Abbildung 2C). Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Dunkler Hintergrund aktiviert ist.
8. Wenn Sie Analysieren | Messung einstellen... im Menü, um die Parameter auszuwählen, die in den Ergebnissen angezeigt werden. Vergewissern Sie sich, dass Integrierte Dichte und Auf Schwellenwert begrenzen ausgewählt ist. Die integrierte Dichte (Gesamtintensität) ist das Ziel der Messung (Abbildung 2D).
9. Wählen Sie Analysieren | Messen Sie , um die Ergebnisse zu erhalten. Die Ergebnisse werden angezeigt und stehen für die statistische Analyse bereit (Abbildung 2E).

Ergebnisse

Wir haben die oben beschriebenen Immunfluoreszenz-Färbeverfahren verwendet, um die Ablagerung von Aβ-Akkumulation in 5×FAD-Mäusen unterschiedlichen Alters zu untersuchen. Abbildung 3 zeigt typische Ergebnisse und suboptimale Ergebnisse unter Verwendung unseres Protokolls. Hirnschnitte von 5 Monate und 8 Monaten heterozygoten 5×FAD-transgenen Mäusen und 4- bis 6-monatigen Wildtyp-Kontrollen wurden mit 6E10-Antikörpern gefärbt und unter einem Fluoresze...

Diskussion

Die Immunfluoreszenzfärbung mit 6E10-Antikörpern kann spezifisch die Aβ-Akkumulation im Gehirn nachweisen, die mit Bild J leicht quantifiziert werden kann. Es ist erwähnenswert, dass einige entscheidende Schritte in diesem Protokoll die Ergebnisse beeinflussen können.

Um zu verhindern, dass sich die in Abbildung 3C gezeigten Scheiben ablösen oder brechen, sollten einige wichtige Punkte beachtet werden. Die Perfusion sollte n...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetia
Injection syringe	KLMEDICAL		1 mL
Pentobarbitual sodium	Sigma-Aldrich	P3761	1% in saline for i.p. injection
Thoracotomy:
IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm)	RWD	S12010-11
Sharp curved surgical scissors(11.5 cm)	RWD	S14016-11
Straight dissecting forceps (~10.5 cm)	RWD	F12010-10
Perfusion
Centrifugal tube (5 mL)	Biosharp
Injection syringe	KLMEDICAL		20 mL
Paraformaldehyde	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) powder	Vicmed	VC2001P	Add deionized water to make solution
Fixation, Dehydration and Cryosectioning
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105	76.2 mm × 25.4 mm
Microtome Cryostat	LEICA	CM1950
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakura Finetek	4583
Sucrose	VETEC	V900116
Immunofluorescence staining
Fluorescence microscope	OLYMPUS	IX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	Media Cybernetics		Scientific graphing and data analysis software
Immunohistochemical Wet Box (black)	Sinylab	Customized	300 mm × 100 mm × 38 mm, groove depth 27 mm, can contain 10 standard slides
Pipet	Thermo Scientific
Pipette tips	Well-offer
Plastic staining box	Sinylab	Customized	30 mL, can contain 5 standard slides
Primary Antibody Dilution Buffer	made in our lab		1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% sodium azide 10mg in 100ml PBS
Purified anti beta amyloid,1-16 antibody (6E10)	Biolegend	SIG-39320	500X
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen Sections	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		Medical mapping software
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		Scientific graphing and data analysis software