Detección de la acumulación de amiloide-β mediante tinción inmunofluorescente en un modelo murino de enfermedad de Alzheimer

Resumen

En la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer, una de las características más cruciales es el depósito de β amiloide. En este protocolo describimos el método de tinción inmunofluorescente en ratones transgénicos 5×FAD para detectar la acumulación de β amiloide en las placas. Se describirá en detalle el proceso de perfusión, criosección, tinción y cuantificación.

Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa que contribuye al 60-70% de la demencia en todo el mundo. Una de las características distintivas de la EA radica sin duda en la acumulación de β amiloide (Aβ) en el cerebro. Aβ se produce a partir de la escisión proteolítica de la proteína precursora beta-amiloide (APP) por la β-secretasa y la γ-secretasa. En circunstancias patológicas, el aumento de la escisión β de APP conduce a una sobreproducción de Aβ, que se agrega en placas de Aβ. Dado que las placas de Aβ son una característica de la patología de la EA, la detección de la cantidad de Aβ es muy importante en la investigación de la EA. En este protocolo, introducimos el método de tinción inmunofluorescente para visualizar la deposición de Aβ. El modelo de ratón utilizado en nuestros experimentos es el 5×FAD, que porta cinco mutaciones encontradas en la EA familiar humana. Los déficits neuropatológicos y conductuales de los ratones 5xFAD están bien documentados, lo que los convierte en un buen modelo animal para estudiar la patología Aβ. Presentaremos el procedimiento que incluye perfusión transcárdica, criosección, tinción inmunofluorescente y cuantificación para detectar la acumulación de Aβ en ratones 5×FAD. Con este protocolo, los investigadores pueden investigar la patología Aβ en un modelo de ratón con EA.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa que causa entre un 60% y un 70% de demencia en todo el mundo y cuesta muchos recursos sociales¹. Es bien sabido que la acumulación de β amiloide (Aβ) es un rasgo patológico de la enfermedad de Alzheimer. La proteína precursora de amiloide (APP) es una proteína de membrana integral que existe en muchos tejidos. El péptido Aβ, que consta de 36-42 aminoácidos², se produce por la posterior escisión de la β- y γ-secretasa en APP ^3,4. Los cambios en la escisión de APP y las mutaciones en el gen APP conducen a la sobreproducción de Aβ. Las moléculas de Aβ pueden agregarse para formar oligómeros o fibrillas, que se cree que son neurotóxicos ^5,6. En estudios previos, se demostró que la acumulación de Aβ estaba correlacionada con la muerte neuronal en AD ^7,8,9.

Los ratones transgénicos 5×FAD (C57BL/6J) contienen 3 mutaciones en APP y 2 mutaciones en PSEN1. La acumulación de Aβ intracelular comienza a partir de los 1,5 meses de edad. La acumulación extracelular de Aβ se encontró alrededor de los 2 meses, en la corteza y el hipocampo. La acumulación aumentó rápidamente con los¹⁰ años. La patología Aβ bien documentada lo convierte en un buen modelo animal para nuestro protocolo.

El objetivo del método de tinción descrito es visualizar y cuantificar la deposición de Aβ en el cerebro de ratones con EA. Se introducirá el procedimiento que incluye perfusión transcárdica de paraformaldehído, criosección, tinción inmunofluorescente y cuantificación para detectar la acumulación de Aβ en ratones 5×FAD. Este protocolo es un método fiable y sencillo para investigar la patología Aβ en modelos de ratón con EA.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Xuzhou y de acuerdo con las pautas de las regulaciones gubernamentales chinas para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Perfusión de ratones

NOTA: Más detalles del procedimiento de perfusión pueden consultar el video del laboratorio ¹¹ de Wiliam Shain.

1. Anestesiar ratones transgénicos 5×FAD (C57BL/6J) con pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal ^12,13. La pérdida de respuesta al pellizco de las patas traseras indica una anestesia adecuada. No inicie la perfusión antes de que el ratón esté correctamente anestesiado.
2. Use cuatro pasadores para fijar las extremidades en la tabla de espuma de polietileno. Coloque el abdomen del ratón anestesiado hacia arriba, con sus extremidades adecuadamente estiradas. Use un par de tijeras de iris para hacer una incisión en la apófisis xifoides. A continuación, se expondrá el diafragma.
3. Use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en el diafragma y continúe con cuidado la incisión del diafragma hasta el límite superior de la caja torácica. Cortar las costillas y los músculos torácicos, diseccionar los tejidos adheridos para exponer el corazón.
4. Encuentra la aurícula derecha del ratón. Corta la aurícula derecha con unas tijeras de iris.
5. Inyecte 20 mL de PBS a 37 °C (0,01 M, pH 7,2-7,4) desde el ventrículo izquierdo del corazón para expulsar la sangre. Luego, inyecte lentamente 20 mL de PFA al 4% de temperatura ambiente desde el ventrículo izquierdo para fijar los tejidos. La tasa de inyección de PBS y PFA al 4% es de alrededor de 5 mL/min. Los temblores de fijación deben observarse en cuestión de segundos.
   PRECAUCIÓN: El PFA al 4% puede irritar los ojos y las vías respiratorias, y puede provocar reacciones alérgicas. Este paso debe realizarse en lugares ventilados y el operador debe usar gafas de seguridad y máscaras faciales.
6. Use tijeras quirúrgicas para cortar la cabeza y retire con cuidado el cráneo, use pinzas de disección y extraiga el cerebro. A continuación, sumerja el cerebro en 4 ml de PFA al 4% en un tubo de plástico de 5 ml durante 12-24 h a 4 °C.

2. Inclusión y criosección

1. Después de la fijación en PFA al 4%, transfiera el cerebro a 4 mL de sacarosa al 15% en un tubo de plástico de 5 mL a 4 °C. Después de 12-24 h, el cerebro debería hundirse hasta el fondo.
2. Transfiera el cerebro a 4 mL de sacarosa al 30% en un tubo de plástico de 5 mL a 4 °C durante 12-24 h. Entonces el cerebro está listo para la incrustación. El propósito del remojo escalonado con sacarosa al 15% y 30% es deshidratar el cerebro, lo que evita la formación de cristales de hielo dentro de las células durante la inclusión y la criosección. El cerebro deshidratado puede almacenarse a 4 °C durante una semana.
3. Deje aproximadamente 1 mL de sacarosa con el cerebro en el tubo. A continuación, añada el mismo volumen de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) en el tubo y mezcle correctamente. Esto ayuda al compuesto OCT a envolver el cerebro de manera más suficiente.
4. Monte una capa gruesa de compuesto OCT en la superficie de la perilla y congele a -21 °C antes de crioseccionar. Corta el cerebro sagitalmente desde la mitad; Utilice cualquiera de las mitades para seccionar en un criostato.
5. Después de que el compuesto OCT se solidifique, monte la perilla en la cabeza de la muestra y recórtela en una superficie de plataforma. Coloque la mitad del cerebro sobre la superficie recortada con el lado medio hacia abajo.
6. Coloque un anillo de papel de aluminio alrededor del cerebro para evitar fugas de compuesto OCT, y luego llene el anillo con compuesto OCT hasta que el cerebro esté sumergido. Cuando la incrustación del compuesto OCT se solidifica, está lista para el seccionamiento.
7. Ajuste el grosor de la sección a 20 μm. Ajuste la temperatura de la cámara a -21 °C y la temperatura de la cabeza de la muestra a -19 °C. Secciona el cerebro desde el extremo rostral hasta el extremo caudal.
8. Cepille un poco de PBS en los portaobjetos de vidrio. Reviste previamente los portaobjetos de vidrio con polilisina para evitar que las secciones se despeguen. Fije la sección en la guía. Si la sección está doblada, use un pincel suave para desplegar las secciones con PBS.
9. Secar las secciones durante la noche a temperatura ambiente y almacenar a -20 °C. Las secciones pueden mantenerse a -20 °C hasta un mes antes de la tinción de Aβ.

3. Procedimiento de tinción Aβ

1. Calienta las secciones a temperatura ambiente, seca la superficie del portaobjetos y usa un bolígrafo hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor de la sección para la incubación de anticuerpos.
2. Remoje el portaobjetos en PBS en una caja de tinción de plástico de 30 ml para lavar el compuesto OCT. Use al menos 20 ml de PBS.
3. Agregue 100 μL de solución de recuperación de antígeno 1x para secciones congeladas en el portaobjetos. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Lave la solución de recuperación con al menos 20 mL de PBS a temperatura ambiente durante 3 veces (5 minutos para cada una).
5. Añadir anticuerpo primario diluido (6E10) en las secciones e incubar a 4 °C durante 16-24 h en una caja húmeda y oscura (solución de dilución de anticuerpos primarios: 1% BSA, 0,3% Triton X-100, 0,01% azida sódica en PBS, dilución 1:500). BSA funciona como agente de bloqueo.
6. Lave las secciones con PBS 3 veces, 5 minutos cada vez.
   NOTA: Realice los pasos 3.7, 3.8 y 3.9 en un lugar oscuro.
7. Incubar secciones en una solución secundaria de anticuerpos (IgG (H+L) Alexa Flour 594 anti-Mouse de cabra, diluida con PBS 1:200) durante 1 h a temperatura ambiente en una caja húmeda y oscura.
8. Lave el anticuerpo secundario de las secciones con al menos 20 mL de PBS durante 3 veces, 5 min cada vez.
   NOTA: No vierta PBS en las secciones durante el lavado para evitar que las secciones se despeguen. Mantén las secciones húmedas.
9. Absorba el líquido alrededor de las secciones y agregue un goteo de medio de montaje en cada sección. Selle las secciones con cubreobjetos, evitando burbujas.
10. Observe las secciones teñidas con un microscopio de fluorescencia. Mantenga los parámetros de imagen consistentes para evitar la derivación. Mantenga los portaobjetos a 4 °C en un lugar oscuro. Analice las secciones dentro de una semana, ya que las manchas se desvanecerán con el tiempo.

4. Obtención de imágenes y cuantificación de la acumulación de Aβ por ImageJ

1. Capture imágenes mediante un microscopio de fluorescencia conectado con una cámara digital y un software de imágenes. Utilizamos el software Image Pro Plus y el parámetro de imagen se estableció de la siguiente manera: Exp Pvw: 450 ms, Exp Acq: 450 ms; Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Resolución Pvw: Ancho 1 × Alto 1, Acq Resolución: Ancho 1 × Alto 1; Profundidad de captura: mono de 8 bits; Ganancia: Pvw: 13, Acq: 13, Gamma: Pvw: 1, Acq: 1, Offse: Pvw: -700, Acq: -700.
2. En ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji), seleccione Plugins | Costuras | MosaicJ en el menú. A continuación, seleccione Archivos | Abrir secuencia de imágenes para abrir las imágenes que se van a unir (Figura 1A).
3. Todas las imágenes seleccionadas se mostrarán en la parte inferior. Después de unir las imágenes manualmente, seleccione Archivo | Cree un mosaico (Figura 1B, C, D).
4. Seleccionar imagen | Ajustar | Brillo/Contraste ..., y ajuste el brillo y el contraste de la imagen (Figura 3A). A continuación, se puede guardar la imagen (Figura 1E).
5. Para cuantificar la acumulación de Aβ, abra la imagen a través de Archivo | Abrir... en el menú (Figura 2A).
6. Seleccionar imagen | Tipo | 8 bits para ajustar la imagen a 8 bits. A continuación, elija el área que se va a contar mediante la selección de polígonos (Figura 2B).
7. Seleccionar imagen | Ajustar | Umbral para seleccionar el umbral adecuado de señales. El umbral se puede ajustar arrastrando las barras de desplazamiento o cambiar los números directamente en el cuadro de texto (máximo: 255, mínimo: 0). Cuando todas las señales Aβ de la sección se han vuelto rojas, el umbral es apropiado para la medición (Figura 2C). Asegúrese de que la casilla Fondo oscuro esté marcada.
8. Selección de Analizar | Establecer la medición... en el menú para elegir los parámetros que se mostrarán en los resultados. Confirme que la opción Densidad integrada y Límite al umbral esté seleccionada. La densidad integrada (intensidad total) es el objetivo de la medición (Figura 2D).
9. Seleccione Analizar | Mide para obtener los resultados. Los resultados se mostrarán y estarán listos para el análisis estadístico (Figura 2E).

Resultados

Utilizamos los procedimientos de tinción inmunofluorescente descritos anteriormente para investigar la deposición de acumulación de Aβ en ratones 5×FAD de diferentes edades. La Figura 3 representa los resultados típicos y los resultados subóptimos utilizando nuestro protocolo. Los cortes de cerebro de ratones transgénicos heterocigotos 5×FAD heterocigotos de 5 y 8 meses y de control de tipo salvaje de 4 a 6 meses se tiñeron con el anticuerpo 6E10 y...

Discusión

La tinción inmunofluorescente con el anticuerpo 6E10 puede detectar específicamente la acumulación de Aβ en el cerebro, que es fácil de cuantificar mediante la imagen J. Lo que vale la pena notar es que algunos pasos cruciales en este protocolo pueden afectar los resultados.

Para evitar que las rodajas se despeguen o se rompan como se muestra en la Figura 3C, se deben tener en cuenta algunos puntos clave. La perfusión debe p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetia
Injection syringe	KLMEDICAL		1 mL
Pentobarbitual sodium	Sigma-Aldrich	P3761	1% in saline for i.p. injection
Thoracotomy:
IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm)	RWD	S12010-11
Sharp curved surgical scissors(11.5 cm)	RWD	S14016-11
Straight dissecting forceps (~10.5 cm)	RWD	F12010-10
Perfusion
Centrifugal tube (5 mL)	Biosharp
Injection syringe	KLMEDICAL		20 mL
Paraformaldehyde	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) powder	Vicmed	VC2001P	Add deionized water to make solution
Fixation, Dehydration and Cryosectioning
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105	76.2 mm × 25.4 mm
Microtome Cryostat	LEICA	CM1950
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakura Finetek	4583
Sucrose	VETEC	V900116
Immunofluorescence staining
Fluorescence microscope	OLYMPUS	IX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	Media Cybernetics		Scientific graphing and data analysis software
Immunohistochemical Wet Box (black)	Sinylab	Customized	300 mm × 100 mm × 38 mm, groove depth 27 mm, can contain 10 standard slides
Pipet	Thermo Scientific
Pipette tips	Well-offer
Plastic staining box	Sinylab	Customized	30 mL, can contain 5 standard slides
Primary Antibody Dilution Buffer	made in our lab		1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% sodium azide 10mg in 100ml PBS
Purified anti beta amyloid,1-16 antibody (6E10)	Biolegend	SIG-39320	500X
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen Sections	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		Medical mapping software
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		Scientific graphing and data analysis software