JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בנוירופתולוגיה של מחלת אלצהיימר, אחד המאפיינים המכריעים ביותר הוא שקיעת עמילואיד-β. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השיטה של צביעה אימונופלואורסצנטית בעכבר טרנסגני 5×FAD כדי לזהות הצטברות β עמילואיד בפלאק. תהליך הזילוף, ההקפאה, הצביעה והכימות יתואר בפירוט.

Abstract

מחלת אלצהיימר (AD) היא מחלה ניוונית של מערכת העצבים התורמת ל-60-70% שיטיון ברחבי העולם. אחד מסימני ההיכר של אלצהיימר טמון ללא ספק בהצטברות של β עמילואיד (Aβ) במוח. Aβ מיוצר מהמחשוף הפרוטאוליטי של חלבון מבשר בטא-עמילואיד (APP) על ידי β-secretase ו-γ-secretase. בנסיבות פתולוגיות, מחשוף β מוגבר של APP מוביל לייצור יתר של Aβ, המצטבר לפלאק Aβ. מאחר שפלאק Aβ הוא מאפיין של פתולוגיה של אלצהיימר, זיהוי כמות ה-Aβ חשוב מאוד בחקר אלצהיימר. בפרוטוקול זה, אנו מציגים את שיטת הצביעה האימונופלואורסצנטית כדי להמחיש שקיעת Aβ. מודל העכבר ששימש בניסויים שלנו הוא 5×FAD, הנושא חמש מוטציות שנמצאו במחלת אלצהיימר משפחתית אנושית. הליקויים הנוירופתולוגיים וההתנהגותיים של עכברי 5xFAD מתועדים היטב, מה שהופך אותו למודל חי טוב לחקר פתולוגיה של Aβ. נציג את ההליך הכולל זלוף דרך הלב, קריוסקציה, צביעה אימונופלואורסצנטית וכימות לאיתור הצטברות Aβ בעכברי 5×FAD. בעזרת הפרוטוקול הזה, חוקרים יכולים לחקור פתולוגיה של Aβ במודל של עכבר AD.

Introduction

מחלת אלצהיימר (AD) היא מחלה ניוונית הגורמת ל-60%-70% דמנציה ברחבי העולם ועולה משאבים חברתיים רבים1. ידוע כי הצטברות β עמילואיד (Aβ) היא סימן היכר פתולוגי במחלת אלצהיימר. חלבון מבשר עמילואיד (APP) הוא חלבון ממברנה אינטגרלי הקיים ברקמות רבות. פפטיד Aβ, המורכב מ-36-42 חומצות אמינו2, מיוצר על ידי הפיצול הבא של β ו-γ-secretase ב-APP 3,4. שינויים במחשוף APP ומוטציות בגן APP מובילים לייצור יתר של Aβ. מולקולות Aβ יכולות להצטבר ליצירת אוליגומרים או סיבים, אשר מאמינים שהם נוירוטוקסיים 5,6. במחקרים קודמים הוכח כי הצטברות Aβ קשורה למוות עצבי ב-7,8,9 לספירה.

העכברים הטרנסגניים 5×FAD (C57BL/6J) מכילים 3 מוטציות ב-APP ו-2 מוטציות ב-PSEN1. הצטברות Aβ תוך-תאית מתחילה כבר בגיל חודש וחצי. הצטברות חוץ-תאית של Aβ נמצאה בסביבות חודשיים, בקליפת המוח ובהיפוקמפוס. ההצטברות גדלה במהירות עם גיל10. הפתולוגיה המתועדת היטב של Aβ הופכת אותו למודל בעל חיים טוב לפרוטוקול שלנו.

מטרת שיטת הצביעה המתוארת היא לדמיין ולכמת שקיעת Aβ במוח של מודל עכברי אלצהיימר. ההליך הכולל זלוף פרפורמלדהיד טרנס-קרדיאלי יוצג, קריוסקציה, צביעה אימונו-פלואורסצנטית וכימות לאיתור הצטברות Aβ בעכברי 5×FAD. פרוטוקול זה הוא שיטה אמינה וקלה לחקירת פתולוגיה של Aβ במודל עכבר AD.

Protocol

כל הליכי הניסוי בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית שוז'ו ובהתאם להנחיות התקנות הממשלתיות הסיניות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. זלוף של עכברים

הערה: פרטים נוספים על הליך הזלוף יכולים לעיין בסרטון מהמעבדה 11 של וויליאם שיין.

  1. להרדים עכברים טרנסגניים 5×FAD (C57BL/6J) עם נתרן פנטוברביטלי 1% (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף) על ידי הזרקה תוך צפקית12,13. אובדן תגובה לצביטה בכפות הרגליים האחוריות מעיד על הרדמה נכונה. אין להתחיל בזילוף לפני שהעכבר מורדם כראוי.
  2. השתמש בארבעה סיכות כדי לקבע את הגפיים על קרש הקצף. הגדר את בטנו של העכבר המורדם כלפי מעלה, כשגפיו מתוחות כראוי. השתמש בזוג מספריים לקשתית כדי לבצע חתך בתהליך ה- xiphoid. ואז הסרעפת תיחשף.
  3. השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך בסרעפת, והמשך בזהירות את חתך הסרעפת לגבול העליון של כלוב הצלעות. חותכים את הצלעות ושרירי בית החזה, מנתחים את הרקמות המחוברות כדי לחשוף את הלב.
  4. מצא את האטריום הנכון של העכבר. חותכים את האטריום הימני בעזרת מספריים לקשתית.
  5. הזרקו 20 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס PBS (0.01 מ', pH 7.2-7.4) מהחדר השמאלי של הלב כדי לשטוף את הדם. לאחר מכן יש להזריק לאט 20 מ"ל של 4% PFA מטמפרטורת החדר מהחדר השמאלי כדי לתקן את הרקמות. קצב ההזרקה של PBS ו-4% PFA הוא בסביבות 5 מ"ל לדקה. יש להבחין ברעידות קיבוע תוך שניות.
    אזהרה: 4% PFA עלול לגרות את העיניים ודרכי הנשימה, ועלול לעורר תגובות אלרגיות. שלב זה צריך להיעשות במקומות מאווררים, ועל המפעיל להרכיב משקפי מגן ומסכות פנים.
  6. השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את הראש, והסר בזהירות את הגולגולת השתמש במלקחיים לניתוח וחלץ את המוח. לאחר מכן טבלו את המוח לתוך 4 מ"ל של 4% PFA בצינור פלסטיק של 5 מ"ל למשך 12-24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. הטבעה והקפאה

  1. לאחר קיבוע ב-4% PFA, העבירו את המוח ל-4 מ"ל של 15% סוכרוז בצינור פלסטיק של 5 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס. אחרי 12-24 שעות, המוח אמור לשקוע לתחתית.
  2. העבירו את המוח ל-4 מ"ל של 30% סוכרוז בצינור פלסטיק של 5 מ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות. ואז המוח מוכן להטמעה. מטרת השריית סוכרוז בשלבים של 15% ו-30% היא לייבש את המוח, מה שמונע היווצרות גבישי קרח בתוך התאים במהלך הטבעה והקפאה. ניתן לאחסן את המוח המיובש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע אחד.
  3. השאירו בערך 1 מ"ל סוכרוז עם המוח בצינור. לאחר מכן הוסף את אותו נפח תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לתוך הצינור וערבב כראוי. זה עוזר לתרכובת OCT לעטוף את המוח בצורה מספקת יותר.
  4. הרכיבו שכבה עבה של תרכובת OCT על משטח הכפתור והקפיאו בטמפרטורה של -21 מעלות צלזיוס לפני ההקפאה. לחתוך את המוח סגיטלי מהאמצע; השתמש בכל אחד מהחצאים לחיתוך בקריוסטט.
  5. לאחר שתרכובת ה-OCT מתמצקת, התקן את הכפתור על ראש הדגימה וחתוך אותו למשטח פלטפורמה. הניחו מחצית אחת של המוח על המשטח הקצוץ כשהצד האמצעי כלפי מטה.
  6. הניחו טבעת נייר כסף סביב המוח כדי למנוע דליפה של תרכובת OCT, ולאחר מכן מלאו את הטבעת בתרכובת OCT עד שהמוח שקוע. כאשר הטמעת תרכובת OCT מתמצקת, היא מוכנה לחיתוך.
  7. הגדר את עובי הקטע ל -20 מיקרומטר. הגדר את טמפרטורת החדר ל-21 מעלות צלזיוס, ואת טמפרטורת ראש הדגימה ל-19 מעלות צלזיוס. חתך את המוח מהקצה הרוסטרלי לקצה הזנב.
  8. מברישים מעט PBS על שקופיות הזכוכית. מצפים מראש את שקופיות הזכוכית בפולי-ליזין כדי למנוע את התקלפות החלקים. חבר את הקטע לשקופית. אם החלק מקופל, השתמש במברשת רכה כדי לפרוש את החלקים בעזרת PBS.
  9. יבש את החלקים למשך הלילה בטמפרטורת החדר ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. ניתן לשמור את החלקים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד חודש לפני צביעת Aβ.

3. נוהל צביעת Aβ

  1. חממו את החלקים בטמפרטורת החדר, יבשו את משטח ההחלקה והשתמשו בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול סביב הקטע לדגירת נוגדנים.
  2. משרים את השקופית ב-PBS בקופסת צביעה מפלסטיק של 30 מ"ל כדי לשטוף את תרכובת ה-OCT. השתמש לפחות ב-20 מ"ל של PBS.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת אחזור אנטיגן 1x לחלקים קפואים לשקופית. דוגרים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שטפו את תמיסת השליפה עם לפחות 20 מ"ל PBS בטמפרטורת החדר למשך 3 פעמים (5 דקות לכל אחד).
  5. הוסף נוגדן ראשוני מדולל (6E10) על החלקים ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 16-24 שעות בקופסה רטובה וחשוכה (תמיסת דילול נוגדנים ראשונית: 1% BSA, 0.3% טריטון X-100, 0.01% נתרן אזיד ב-PBS, דילול 1:500). BSA מתפקד כסוכן חוסם.
  6. שטפו את החלקים עם PBS במשך 3 פעמים, 5 דקות בכל פעם.
    הערה: בצע את שלבים 3.7, 3.8 ו-3.9 במקום חשוך.
  7. דגירה של קטעים בתמיסת נוגדנים משנית (קמח אלקסה 594 נגד עכבר עיזים IgG (H+L), מדולל ב-PBS 1:200) למשך שעה בטמפרטורת החדר בקופסה רטובה וחשוכה.
  8. שטפו את הנוגדן המשני מהחלקים עם לפחות 20 מ"ל PBS למשך 3 פעמים, 5 דקות בכל פעם.
    הערה: אין לשפוך PBS על חלקים במהלך הכביסה כדי למנוע קילוף חלקים. שמור על החלקים רטובים.
  9. סופגים את הנוזל סביב קטעים ומוסיפים טפטוף של אמצעי הרכבה על כל חלק. אטום את החלקים בזכוכית כיסוי, הימנע מבועות.
  10. התבונן בחלקים המוכתמים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. שמור על עקביות פרמטרי ההדמיה כדי למנוע גזירה. שמור את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקום חשוך. נתח את הקטעים תוך שבוע, מכיוון שהכתמים ידהו עם הזמן.

4. הדמיה וכימות של הצטברות Aβ על ידי ImageJ

  1. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המחובר למצלמה דיגיטלית ותוכנת הדמיה. השתמשנו בתוכנת Image Pro Plus ופרמטר ההדמיה הוגדר באופן הבא: Exp Pvw: 450 אלפיות השנייה, Exp Acq: 450 אלפיות השנייה; Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; רזולוציית Pvw: רוחב 1 × גובה 1, רזולוציית ACQ: רוחב 1 × גובה 1; עומק לכידה: שחור-לבן של 8 סיביות; רווח: Pvw: 13, Acq: 13, גמא: Pvw: 1, Acq: 1, עבירה: Pvw: -700, Acq: -700.
  2. ב-ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji), בחר Plugins | תפירה | MosaicJ בתפריט. לאחר מכן בחר קבצים | פתח את רצף התמונות כדי לפתוח את התמונות לתפירה (איור 1A).
  3. כל התמונות שנבחרו יוצגו בתחתית. לאחר תפירת התמונות באופן ידני, בחר File | יצירת פסיפס (איור 1B, C, D).
  4. בחר תמונה | התאם | בהירות/ניגודיות ..., והתאמת הבהירות והניגודיות של התמונה (איור 3A). לאחר מכן ניתן לשמור את התמונה (איור 1E).
  5. כדי לכמת את ההצטברות של Aβ, פתח את התמונה דרך קובץ | פתוח... בתפריט (איור 2A).
  6. בחר תמונה | סוג | 8 סיביות כדי להתאים את התמונה ל-8 סיביות. לאחר מכן בחר את האזור המיועד לספירה באמצעות בחירת מצולע (איור 2B).
  7. בחר תמונה | התאם | סף לבחירת סף האותות המתאים. ניתן לכוונן את הסף על ידי גרירת פסי הגלילה או שינוי המספרים ישירות בתיבת הטקסט (מקסימום: 255, מינימום: 0). כאשר כל אותות ה-Aβ במקטע הפכו לאדומים, הסף מתאים למדידה (איור 2C). ודא שהתיבה רקע כהה מסומנת.
  8. בחירת ניתוח | הגדר מידה... בתפריט כדי לבחור את הפרמטרים שיוצגו בתוצאות. ודא שהאפשרות צפיפות משולבת והגבלה לסף נבחרה. צפיפות משולבת (עוצמה כוללת) היא יעד המדידה (איור 2D).
  9. בחר נתח | מדוד כדי לקבל את התוצאות. התוצאות יוצגו ומוכנות לניתוח סטטיסטי (איור 2E).

תוצאות

השתמשנו בהליכי הצביעה האימונופלואורסצנטיים שתוארו לעיל כדי לחקור את שקיעת הצטברות Aβ בעכברי 5×FAD בגילאים שונים. איור 3 מייצג תוצאות טיפוסיות ותוצאות לא אופטימליות באמצעות הפרוטוקול שלנו. פרוסות מוח של עכברים טרנסגניים הטרוזיגוטיים 5×FAD בני 5 חודשים ו-8 חו?...

Discussion

צביעה אימונו-פלואורסצנטית באמצעות נוגדן 6E10 יכולה לזהות באופן ספציפי הצטברות Aβ במוח, שקל לכמת על ידי תמונה J. מה שכדאי לשים לב אליו הוא שכמה שלבים מכריעים בפרוטוקול זה עשויים להשפיע על התוצאות.

כדי למנוע פרוסות להתקלף או לשבור המוצגות באיור 3C

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי פרויקט כללי של הקרן למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 81974157) מהקרן למדעי הטבע של סין, פרופסור ממונה מיוחד של ג'יאנגסו (ל-C.L) ממחלקת החינוך של ג'יאנגסו, תוכנית צוות חדשנות ויזמות של מחוז ג'יאנגסו (ל-H.Z., A.L., W.W., C.L. ו-Y.S.), מענק התחלתי של כישרונות מצוינים (D2019025) ותוכנית הכשרה לחדשנות ויזמות (201910313038Z ל-Z.S., י.ק., מ.ז. וג'.ד.) מהאוניברסיטה הרפואית של שוז'ואו. מחקר זה נתמך גם על ידי מרכז ההדגמה הלאומי לחינוך ניסיוני בסיסי למדעי הרפואה (האוניברסיטה הרפואית שוז'ו).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetia
Injection syringeKLMEDICAL1 mL
Pentobarbitual sodiumSigma-AldrichP37611% in saline for i.p. injection
Thoracotomy:
IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm)RWDS12010-11
Sharp curved surgical scissors(11.5 cm)RWDS14016-11
Straight dissecting forceps (~10.5 cm)RWDF12010-10
Perfusion
Centrifugal tube (5 mL)Biosharp
Injection syringeKLMEDICAL20 mL
ParaformaldehydeVicmedVIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) powderVicmedVC2001PAdd deionized water to make solution
Fixation, Dehydration and Cryosectioning
Adhesion microscope slidesCITOTEST18810576.2 mm × 25.4 mm
Microtome CryostatLEICACM1950
Optimal cutting temperature compound (OCT)Sakura Finetek4583
SucroseVETECV900116
Immunofluorescence staining
Fluorescence microscopeOLYMPUSIX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11005200X
Image-Pro Plus 7.0CMedia CyberneticsScientific graphing and data analysis software
Immunohistochemical Wet Box (black)SinylabCustomized300 mm × 100 mm × 38 mm, groove depth 27 mm, can contain 10 standard slides
PipetThermo Scientific
Pipette tipsWell-offer
Plastic staining boxSinylabCustomized30 mL, can contain 5 standard slides
Primary Antibody Dilution Buffermade in our lab1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% sodium azide 10mg in 100ml PBS
Purified anti beta amyloid,1-16 antibody (6E10)BiolegendSIG-39320500X
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen SectionsKeyGEN BioTECHKGIHC0055X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1GraphpadMedical mapping software
Image J Fiji 2.0.0National Institute of HealthScientific graphing and data analysis software

References

  1. Burns, A., Iliffe, S. Alzheimer's disease. BMJ. 338, 158 (2009).
  2. Leong, Y. Q., Ng, K. Y., Chye, S. M., Ling, A. P. K., Koh, R. Y. Mechanisms of action of amyloid-beta and its precursor protein in neuronal cell death. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 11-30 (2020).
  3. Tiwari, S., Atluri, V., Kaushik, A., Yndart, A., Nair, M. Alzheimer's disease: pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. International Journal of Nanomedicine. 14, 5541-5554 (2019).
  4. Murphy, M. P., LeVine, H. Alzheimer's disease and the amyloid-beta peptide. Journal of Alzheimer's Disease. 19 (1), 311-323 (2010).
  5. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256 (5054), 184-185 (1992).
  6. Reitz, C. Alzheimer's disease and the amyloid cascade hypothesis: a critical review. International Journal of Alzheimer's Disease. 2012, 369808 (2012).
  7. Bozyczko-Coyne, D., et al. CEP-1347/KT-7515, an inhibitor of SAPK/JNK pathway activation, promotes survival and blocks multiple events associated with Abeta-induced cortical neuron apoptosis. Journal of Neurochemistry. 77 (3), 849-863 (2001).
  8. Canevari, L., Abramov, A. Y., Duchen, M. R. Toxicity of amyloid beta peptide: tales of calcium, mitochondria, and oxidative stress. Neurochemical Research. 29 (3), 637-650 (2004).
  9. Zhu, X., et al. Oxidative stress signalling in Alzheimer's disease. Brain Research. 1000 (1-2), 32-39 (2004).
  10. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  12. An, S., et al. Medial septum glutamatergic neurons control wakefulness through a septo-hypothalamic circuit. Current Biology. , (2021).
  13. Cao, J. L., et al. Activation of peripheral ephrinBs/EphBs signaling induces hyperalgesia through a MAPKs-mediated mechanism in mice. Pain. 139 (3), 617-631 (2008).
  14. Ly, P. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. Journal of Visualized Experiments. (53), e2831 (2011).
  15. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
  16. Hatami, A., Albay, R., Monjazeb, S., Milton, S., Glabe, C. Monoclonal antibodies against Abeta42 fibrils distinguish multiple aggregation state polymorphisms in vitro and in Alzheimer disease brain. Journal of Biological Chemistry. 289 (46), 32131-32143 (2014).
  17. Shi, X. Z., Wei, X., Sha, L. Z., Xu, Q. Comparison of beta-Amyloid Plaque Labeling Methods: Antibody Staining, Gallyas Silver Staining, and Thioflavin-S Staining. Chinese Medical Sciences Journal. 33 (3), 167-173 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

A5xFADAPPA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved