알츠하이머병의 마우스 모델에서 면역형광 염색을 통한 아밀로이드 β 축적 검출

요약

알츠하이머병의 신경병리학에서 가장 중요한 특징 중 하나는 아밀로이드β의 침착입니다. 이 프로토콜에서는 플라크에서 아밀로이드β 축적을 검출하기 위해 5×FAD 형질전환 마우스에서 면역형광성 염색 방법을 설명합니다. 관류, 동결 절편, 염색 및 정량화 과정이 자세히 설명됩니다.

초록

알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 전 세계 치매의 60-70%를 차지하는 신경퇴행성 질환입니다. 알츠하이머병의 특징 중 하나는 의심할 여지 없이 뇌에 아밀로이드β(Aβ)이 축적되는 것입니다. Aβ는 β-세크레타제와 γ-세크레타제에 의한 베타-아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 단백질 분해 절단에서 생성됩니다. 병리학적 상황에서 APP의 β 분열 증가는 Aβ의 과잉 생산으로 이어지며, 이는 Aβ 플라크로 응집됩니다. Aβ 플라크는 AD 병리학의 특징이기 때문에 Aβ의 양을 검출하는 것은 AD 연구에서 매우 중요합니다. 이 프로토콜에서는 Aβ 침착을 시각화하기 위해 면역형광 염색 방법을 소개합니다. 실험에 사용된 마우스 모델은 5×FAD로, 인간 가족성 알츠하이머병에서 발견되는 5개의 돌연변이를 가지고 있습니다. 5xFAD 마우스의 신경병리학적 및 행동적 결함은 잘 문서화되어 있어 Aβ 병리학을 연구하기에 좋은 동물 모델입니다. 5×FAD 마우스에서 Aβ 축적을 검출하기 위한 경심 관류, 동결 절편, 면역형광 염색 및 정량화를 포함한 절차를 소개합니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 AD 마우스 모델에서 Aβ 병리학을 조사할 수 있습니다.

서문

알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 전 세계적으로 60%-70%의 치매를 유발하는 신경퇴행성 질환으로, 많은 사회적 자원이 소모됩니다¹. 아밀로이드β(Aβ)의 축적이 알츠하이머병의 병리학적 특징이라는 것은 잘 알려진 사실입니다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 많은 조직에 존재하는 일체형 막 단백질입니다. 36-42개의 아미노산²로 구성된 Aβ 펩타이드는 APP ^3,4에서 β--및 γ-세크레타제의 후속 절단에 의해 생성됩니다. APP 분열의 변화와 APP 유전자의 돌연변이는 Aβ의 과잉 생산으로 이어집니다. Aβ 분자는 응집하여 올리고머 또는 피브릴을 형성할 수 있으며, 이는 신경독성이 있는 것으로 여겨집니다 ^5,6. 이전 연구에서 Aβ의 축적은 AD ^7,8,9의 신경 세포 사멸과 상관관계가 있는 것으로 입증되었습니다.

5×FAD (C57BL/6J) 형질전환 마우스는 APP에 3개의 돌연변이, PSEN1에 2개의 돌연변이를 포함하고 있습니다. 세포 내 Aβ의 축적은 빠르면 생후 1.5개월부터 시작됩니다. Aβ의 세포외 축적은 피질과 해마에서 약 2개월 후에 발견되었습니다. 축적은¹⁰세가 되면서 급격히 증가했습니다. 잘 문서화된 Aβ 병리학은 당사 프로토콜에 적합한 동물 모델입니다.

설명된 염색 방법의 목표는 AD 마우스 모델의 뇌에서 Aβ 침착을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 5×FAD 마우스에서 Aβ 축적을 검출하기 위한 경심 파라포름알데히드 관류, 동결절편, 면역형광 염색 및 정량화를 포함한 절차가 소개됩니다. 이 프로토콜은 AD 마우스 모델에서 Aβ 병리학을 조사할 수 있는 신뢰할 수 있고 쉬운 방법입니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 쉬저우 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받고 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 중국 정부 규정의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 마우스의 관류

참고: 관류 절차에 대한 자세한 내용은 Wiliam Shain의 실험실 ¹¹의 비디오를 참조하십시오.

1. 복강 내 주사로 5 % 펜토 바르비탈 나트륨 (체중 50mg / kg)으로 5×FAD (C57BL / 6J) 형질 전환 마우스를 마취^12,13. 뒷발 꼬집기에 대한 반응 상실은 적절한 마취를 나타냅니다. 마우스가 제대로 마취되기 전에 관류를 시작하지 마십시오.
2. 4개의 핀을 사용하여 폴리폼 널빤지에 팔다리를 고정합니다. 마취된 쥐의 복부를 위쪽으로 설정하고 팔다리를 적절하게 쭉 뻗습니다. 홍채 가위를 사용하여 xiphoid 과정을 절개합니다. 그러면 다이어프램이 노출됩니다.
3. 수술용 가위를 사용하여 횡격막을 절개하고 횡격막 절개를 흉곽의 위쪽 경계까지 조심스럽게 계속합니다. 갈비뼈와 흉부 근육을 자르고 부속 조직을 절개하여 심장을 드러냅니다.
4. 마우스의 오른쪽 아트리움을 찾으십시오. 홍채 가위를 사용하여 오른쪽 심방을 잘라냅니다.
5. 심장의 좌심실에서 37°C PBS(0.01M, pH 7.2-7.4) 20mL를 주입하여 혈액을 씻어냅니다. 그런 다음 좌심실에서 실온의 20% PFA 4mL를 천천히 주입하여 조직을 고정합니다. PBS 및 4% PFA의 주입 속도는 약 5mL/분입니다. 고정 떨림은 몇 초 이내에 관찰되어야 합니다.
   주의: 4% PFA는 눈과 기도를 자극할 수 있으며 알레르기 반응을 유발할 수 있습니다. 이 단계는 환기가 잘 되는 곳에서 수행해야 하며 작업자는 보안경과 안면 마스크를 착용해야 합니다.
6. 수술용 가위를 사용하여 머리를 자르고 두개골을 조심스럽게 제거하고 해부 집게를 사용하여 뇌를 추출합니다. 그런 다음 5mL 플라스틱 튜브에 4% PFA 4mL에 뇌를 4°C에서 12-24시간 동안 담그십시오.

2. Embedding 및 Cryosectioning

1. 4% PFA에 고정한 후 4°C에서 5mL 플라스틱 튜브에 15% 자당이 담긴 4mL로 뇌를 옮깁니다. 12-24시간이 지나면 뇌는 바닥으로 가라앉아야 합니다.
2. 5mL 플라스틱 튜브에 30% 자당을 넣고 4°C에서 12-24시간 동안 뇌를 4mL로 옮깁니다. 그러면 뇌는 내장할 준비가 됩니다. 15% 및 30% 자당 단계적 담금의 목적은 뇌를 탈수시켜 임베딩 및 동결 절제 중에 세포 내부에 얼음 결정이 형성되는 것을 방지하는 것입니다. 탈수된 뇌는 4°C에서 일주일 동안 보관할 수 있습니다.
3. 대략 1mL의 자당을 뇌와 함께 튜브에 남겨둡니다. 그런 다음 동일한 부피의 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 튜브에 넣고 적절하게 혼합합니다. 이것은 OCT 화합물이 뇌를 더 충분히 감싸는 데 도움이 됩니다.
4. 손잡이 표면에 OCT 화합물의 두꺼운 층을 장착하고 동결 절편 전에 -21 °C에서 동결합니다. 뇌를 중간부터 궁수적으로 잘라낸다. 저온 유지 장치에서 절단을 위해 절반 중 하나를 사용하십시오.
5. OCT 컴파운드가 응고된 후 시편 헤드에 손잡이를 장착하고 플랫폼 표면으로 트리밍합니다. 뇌의 절반을 가운데 면이 아래를 향하도록 다듬어진 표면에 놓습니다.
6. OCT 화합물의 누출을 방지하기 위해 뇌 주위에 은박지 고리를 끼우고 뇌가 잠길 때까지 고리에 OCT 화합물을 채웁니다. OCT 화합물 포매가 응고되면 절편화할 준비가 된 것입니다.
7. 단면의 두께를 20μm로 설정합니다. 챔버 온도를 -21°C로 설정하고 시편 헤드 온도를 -19°C로 설정합니다. 뇌를 상부 끝에서 꼬리 끝까지 절단합니다.
8. 유리 슬라이드에 PBS를 바르십시오. 유리 슬라이드를 폴리 라이신으로 사전 코팅하여 섹션이 벗겨지는 것을 방지합니다. 슬라이드에 섹션을 부착합니다. 섹션이 접혀 있는 경우 부드러운 브러시를 사용하여 PBS로 섹션을 펼칩니다.
9. 단면을 실온에서 밤새 건조시키고 -20 °C에서 보관하십시오. 절편은 Aβ 염색 전에 최대 1개월 동안 -20°C에서 유지할 수 있습니다.

3. Aβ 염색 절차

1. 실온에서 단면을 예열하고 슬라이드 표면을 건조시킨 다음 소수성 펜을 사용하여 항체 배양을 위해 단면 주위에 원을 그립니다.
2. 30mL 플라스틱 염색 상자에 PBS의 슬라이드를 담가 OCT 화합물을 씻어냅니다. 최소 20mL의 PBS를 사용하십시오.
3. 동결된 절편에 대한 100μL의 1x 항원 회수 용액을 슬라이드에 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
4. 회수 용액을 실온의 PBS 20mL 이상으로 3회(각 5분씩) 세척합니다.
5. 섹션에 희석된 1차 항체(6E10)를 추가하고 4°C에서 16-24시간 동안 습하고 어두운 상자(1차 항체 희석 용액: 1% BSA, 0.3% Triton X-100, PBS 내 0.01% 아지드화나트륨, 1:500 희석)에서 배양합니다. BSA는 차단제로서 기능합니다.
6. PBS로 섹션을 3회, 매번 5분씩 세척합니다.
   참고: 어두운 곳에서 3.7, 3.8 및 3.9 단계를 수행하십시오.
7. 2차 항체 용액(Goat anti-Mouse IgG(H+L) Alexa Flour 594, PBS 1:200으로 희석)의 절편을 젖은 어두운 상자에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
8. 최소 20mL의 PBS가 함유된 절편에서 2차 항체를 3회, 매번 5분씩 씻어냅니다.
   알림: 섹션이 벗겨지는 것을 방지하기 위해 세탁 중 섹션에 PBS를 붓지 마십시오. 섹션을 젖은 상태로 유지하십시오.
9. 섹션 주변의 액체를 흡수하고 각 섹션에 장착 매체를 한 방울 떨어뜨립니다. 기포를 피하고 커버 유리로 섹션을 밀봉하십시오.
10. 형광 현미경으로 염색된 부분을 관찰합니다. 파생을 피하기 위해 이미징 파라미터를 일관되게 유지합니다. 슬라이드를 어두운 곳에서 4°C로 유지하십시오. 염색은 시간이 지남에 따라 희미해지므로 일주일 이내에 단면을 분석하십시오.

4. ImageJ에 의한 Aβ 축적의 이미징 및 정량화

1. 디지털 카메라 및 이미징 소프트웨어와 연결된 형광 현미경으로 이미지를 캡처합니다. Image Pro Plus 소프트웨어를 사용했으며 이미징 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: Exp Pvw: 450ms, Exp Acq: 450ms; Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Pvw 해상도: 너비 1 × 높이 1, Acq 해상도 : 너비 1 × 높이 1; 캡처 깊이: 8비트 모노; 획득: Pvw: 13, Acq: 13, 감마: Pvw: 1, Acq: 1, Offse: Pvw: -700, Acq: -700.
2. ImageJ Fiji 2.0.0(https://imagej.net/Fiji)에서 Plugins(플러그인) | 스티칭 | MosaicJ 를 클릭합니다. 그런 다음 파일 | Open Image Sequence(이미지 시퀀스 열기 )를 클릭하여 스티칭할 이미지를 엽니다(그림 1A).
3. 선택한 모든 이미지가 하단에 표시됩니다. 이미지를 수동으로 스티칭한 후 파일 | 모자이크를 만듭니다 (그림 1B, C, D).
4. 이미지 | 조정 | Brightness/Contrast ...를 선택하고 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다(그림 3A). 그런 다음 이미지를 저장할 수 있습니다(그림 1E).
5. Aβ의 누적을 정량화하려면 File | 열다... 메뉴에서(그림 2A).
6. 이미지 | 유형 | 8비트를 눌러 이미지를 8비트로 조정합니다. 그런 다음 폴리곤 선택을 사용하여 계산하려는 영역을 선택합니다(그림 2B).
7. 이미지 | 조정 | 임계값을 사용하여 신호의 적절한 임계값을 선택합니다. 임계값은 스크롤 막대를 드래그하여 조정하거나 텍스트 상자에서 직접 숫자를 변경할 수 있습니다(최대: 255, 최소: 0). 섹션의 모든 Aβ 신호가 빨간색으로 바뀌면 임계값이 측정에 적합한 것입니다(그림 2C). 어두운 배경 상자가 선택되어 있는지 확인합니다.
8. Analyze(분석) | 측정 설정... 을 클릭하여 결과에 표시될 매개변수를 선택합니다. Integrated density(통합 밀도) 및 Limit to Threshold(임계값 제한)가 선택되어 있는지 확인합니다. 통합 밀도(총 강도)가 측정 대상입니다(그림 2D).
9. 분석 | 결과를 얻기 위해 측정하십시오. 결과가 표시되고 통계 분석을 위해 준비됩니다(그림 2E).

결과

우리는 위에서 설명한 면역형광 염색 절차를 사용하여 다른 연령의 5×FAD 마우스에서 Aβ 축적의 침착을 조사했습니다. 그림 3 은 프로토콜을 사용한 일반적인 결과와 최적이 아닌 결과를 나타냅니다. 5개월 및 8개월 이형접합 5×FAD 형질전환 마우스와 4개월 6개월 야생형 대조군의 뇌 절편을 6E10 항체로 염색하고 형광 현미경으로 검출했습니다.

토론

6E10 항체를 이용한 면역형광 염색은 뇌의 Aβ 축적을 특이적으로 검출할 수 있으며, 이는 Image J로 쉽게 정량화할 수 있습니다. 주목할 가치가 있는 것은 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 결과에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다.

그림 3C에 표시된 슬라이스가 벗겨지거나 파손되는 것을 방지하려면 몇 가지 핵심 사항에 유의해...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetia
Injection syringe	KLMEDICAL		1 mL
Pentobarbitual sodium	Sigma-Aldrich	P3761	1% in saline for i.p. injection
Thoracotomy:
IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm)	RWD	S12010-11
Sharp curved surgical scissors(11.5 cm)	RWD	S14016-11
Straight dissecting forceps (~10.5 cm)	RWD	F12010-10
Perfusion
Centrifugal tube (5 mL)	Biosharp
Injection syringe	KLMEDICAL		20 mL
Paraformaldehyde	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) powder	Vicmed	VC2001P	Add deionized water to make solution
Fixation, Dehydration and Cryosectioning
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105	76.2 mm × 25.4 mm
Microtome Cryostat	LEICA	CM1950
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakura Finetek	4583
Sucrose	VETEC	V900116
Immunofluorescence staining
Fluorescence microscope	OLYMPUS	IX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	Media Cybernetics		Scientific graphing and data analysis software
Immunohistochemical Wet Box (black)	Sinylab	Customized	300 mm × 100 mm × 38 mm, groove depth 27 mm, can contain 10 standard slides
Pipet	Thermo Scientific
Pipette tips	Well-offer
Plastic staining box	Sinylab	Customized	30 mL, can contain 5 standard slides
Primary Antibody Dilution Buffer	made in our lab		1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% sodium azide 10mg in 100ml PBS
Purified anti beta amyloid,1-16 antibody (6E10)	Biolegend	SIG-39320	500X
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen Sections	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		Medical mapping software
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		Scientific graphing and data analysis software