JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Alzheimer hastalığının nöropatolojisinde en önemli özelliklerden biri amiloid β birikimidir. Bu protokolde, plaklarda amiloid β birikimini tespit etmek için 5×FAD transgenik farede immünofloresan boyama yöntemi anlatılmaktadır. Perfüzyon, kriyoseksiyon, boyama ve miktar tayini işlemleri ayrıntılı olarak açıklanacaktır.

Özet

Alzheimer hastalığı (AD), dünya çapında demansa% 60-70'e katkıda bulunan nörodejeneratif bir hastalıktır. AD'nin ayırt edici özelliklerinden biri şüphesiz beyinde amiloid-β (Aβ) birikiminde yatmaktadır. Aβ, beta-amiloid öncü proteininin (APP) proteolitik bölünmesinden β-sekretaz ve γ-sekretaz tarafından üretilir. Patolojik durumlarda, APP'nin artmış β-bölünmesi, Aβ plaklarına toplanan Aβ'nın aşırı üretimine yol açar. Aβ plakları AH patolojisinin bir özelliği olduğundan, AH araştırmalarında Aβ miktarının saptanması çok önemlidir. Bu protokolde, Aβ birikimini görselleştirmek için immünofloresan boyama yöntemini tanıtıyoruz. Deneylerimizde kullanılan fare modeli, insan ailesel AD'de bulunan beş mutasyonu taşıyan 5×FAD'dir. 5xFAD farelerinin nöropatolojik ve davranışsal eksiklikleri iyi belgelenmiştir, bu da onu Aβ patolojisini incelemek için iyi bir hayvan modeli yapar. 5×FAD farelerde Aβ birikimini tespit etmek için transkardiyal perfüzyon, kriyoseksiyon, immünofloresan boyama ve kantifikasyonu içeren prosedürü tanıtacağız. Bu protokol ile araştırmacılar bir AD fare modelinde Aβ patolojisini araştırabilirler.

Giriş

Alzheimer hastalığı (AH), dünya çapında demansa %60-70 oranında neden olan ve çok fazla sosyal kaynağa mal olan nörodejeneratif bir hastalıktır1. Amiloid-β (Aβ) birikiminin Alzheimer hastalığında patolojik bir ayırt edici olduğu iyi bilinmektedir. Amiloid öncü proteini (APP), birçok dokuda bulunan ayrılmaz bir zar proteinidir. 36-42 amino asit2'den oluşan Aβ peptidi, APP 3,4'te β- ve γ-sekretazın müteakip bölünmesiyle üretilir. APP bölünmesindeki değişiklikler ve APP genindeki mutasyonlar Aβ'nın aşırı üretimine yol açar. Aβ molekülleri, nörotoksik olduğuna inanılan oligomerler veya fibriller oluşturmak üzere toplanabilir 5,6. Önceki çalışmalarda, Aβ birikiminin AD 7,8,9'da nöronal ölüm ile ilişkili olduğu gösterilmiştir.

5×FAD (C57BL / 6J) transgenik fareler, APP'de 3 mutasyon ve PSEN1'de 2 mutasyon içerir. Hücre içi Aβ birikimi 1,5 aylıkken başlar. Hücre dışı Aβ birikimi yaklaşık 2 ay içinde korteks ve hipokampusta bulundu. 10 yaşla birlikte birikim hızla arttı. İyi belgelenmiş Aβ patolojisi, onu protokolümüz için iyi bir hayvan modeli haline getirir.

Tarif edilen boyama yönteminin amacı, AD fareleri modelinin beynindeki Aβ birikimini görselleştirmek ve ölçmektir. Transkardiyal paraformaldehit perfüzyonu, kriyoseksiyon, immünofloresan boyama ve 5×FAD farelerde Aβ birikimini tespit etmek için miktar tayinini içeren prosedür tanıtılacaktır. Bu protokol AD fare modelinde Aβ patolojisini araştırmak için güvenilir ve kolay bir yöntemdir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Xuzhou Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ile ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin Çin hükümeti düzenlemelerinin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Farelerin perfüzyonu

NOT: Perfüzyon prosedürü hakkında daha fazla ayrıntı, Wiliam Shain'in laboratuvarı 11'deki videoya başvurabilir.

  1. 5×FAD (C57BL / 6J) transgenik fareleri% 1 pentobarbital sodyum (50 mg / kg vücut ağırlığı) ile intraperitoneal enjeksiyon ile anestezik hale getirin12,13. Arka pençe kıstırmaya yanıt kaybı, uygun anesteziyi gösterir. Fare uygun şekilde uyuşturulmadan perfüzyona başlamayın.
  2. Uzuvları strafor tahta üzerine sabitlemek için dört pim kullanın. Anestezi uygulanmış farenin karnını, uzuvları yeterince gerilmiş olacak şekilde yukarı doğru ayarlayın. Ksifoid işleminde bir kesi yapmak için bir çift iris makası kullanın. Daha sonra diyafram açığa çıkacaktır.
  3. Diyafram üzerinde bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın ve diyafram kesisine göğüs kafesinin üst sınırına kadar dikkatlice devam edin. Kaburgaları ve göğüs kaslarını kesin, kalbi ortaya çıkarmak için bağlı dokuları inceleyin.
  4. Farenin doğru kulakçığını bulun. İris makası kullanarak sağ atriyumu kesin.
  5. Kanı temizlemek için kalbin sol ventrikülünden 20 mL 37 °C PBS (0.01 M, pH 7.2-7.4) enjekte edin. Daha sonra dokuları sabitlemek için sol ventrikülden oda sıcaklığının 20 mL'si% 4 PFA'sını yavaşça enjekte edin. PBS ve %4 PFA'nın enjeksiyon hızı 5 mL/dk civarındadır. Fiksasyon titremeleri saniyeler içinde gözlenmelidir.
    DİKKAT: %4 PFA gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir ve alerjik reaksiyonlara neden olabilir. Bu adım havalandırılan yerlerde yapılmalı ve operatör koruyucu gözlük ve yüz maskesi takmalıdır.
  6. Kafayı kesmek için cerrahi makas kullanın ve kafatasını dikkatlice çıkarın, diseksiyon forsepsleri kullanın ve beyni çıkarın. Daha sonra beyni, 4 ° C'de 12-24 saat boyunca 5 mL'lik bir plastik tüpte 4 mL% 4 PFA'ya daldırın.

2. Gömme ve Kriyoseksiyon

  1. % 4 PFA'da fiksasyondan sonra, beyni 4 ° C'de 5 mL'lik bir plastik tüpte 4 mL% 15 sükroz içine aktarın. 12-24 saat sonra beyin dibe batmalıdır.
  2. Beyni, 12-24 saat boyunca 4 ° C'de 5 mL'lik bir plastik tüpte 4 mL% 30 sükroz içine aktarın. Sonra beyin gömme için hazırdır. %15 ve %30 sükroz kademeli olarak ıslatmanın amacı, gömme ve kriyoseksiyon sırasında hücrelerin içinde buz kristallerinin oluşumunu önleyen beyni kurutmaktır. Susuz kalmış beyin bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
  3. Tüpte beyin varken kabaca 1 mL sükroz bırakın. Daha sonra aynı hacimde optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğini tüpe ekleyin ve uygun şekilde karıştırın. Bu, OCT bileşiğinin beyni daha yeterli şekilde sarmasına yardımcı olur.
  4. Topuz yüzeyine kalın bir OCT bileşiği tabakası monte edin ve kriyoseksiyondan önce -21 °C'de dondurun. Beyni ortadan sagittal olarak kesin; Bir kriyostatta bölümlere ayırmak için her iki yarısını da kullanın.
  5. OCT bileşiği katılaştıktan sonra, düğmeyi numune kafasına monte edin ve bir platform yüzeyine kesin. Beynin yarısını, orta tarafı aşağı bakacak şekilde kesilmiş yüzeye yerleştirin.
  6. OCT bileşiğinin sızmasını önlemek için beynin etrafına bir folyo folyo halka yerleştirin ve ardından beyin suya batırana kadar halkayı OCT bileşiği ile doldurun. OCT bileşiği gömme katılaştığında, bölümleme için hazırdır.
  7. Bölümün kalınlığını 20 μm olarak ayarlayın. Hazne sıcaklığını -21 °C'ye ve numune kafası sıcaklığını -19 °C'ye ayarlayın. Beyni rostral uçtan kaudal uca kadar bölümlere ayırın.
  8. Cam slaytların üzerine biraz PBS fırçalayın. Bölümlerin soyulmasını önlemek için cam slaytları poli-lizin ile önceden kaplayın. Bölümü slayda takın. Bölüm katlanmışsa, bölümleri PBS ile açmak için yumuşak bir fırça kullanın.
  9. Bölümleri gece boyunca oda sıcaklığında kurutun ve -20 °C'de saklayın. Kesitler, Aβ boyamadan önce bir aya kadar -20 ° C'de tutulabilir.

3. Aβ Boyama Prosedürü

  1. Bölümleri oda sıcaklığında ısıtın, slayt yüzeyini kurutun ve antikor inkübasyonu için bölümün etrafına bir daire çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.
  2. OCT bileşiğini yıkamak için slaytı PBS'de 30 mL'lik bir plastik boyama kutusuna batırın. En az 20 mL PBS kullanın.
  3. Slaytın üzerine donmuş bölümler için 100 μL 1x antijen alma solüsyonu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  4. Alma solüsyonunu en az 20 mL PBS oda sıcaklığında 3 kez yıkayın (her biri için 5 dakika).
  5. Bölümlere seyreltilmiş birincil antikor (6E10) ekleyin ve ıslak, karanlık bir kutuda 16-24 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin (birincil antikor seyreltme çözeltisi:% 1 BSA,% 0.3 Triton X-100,% 0.01 sodyum azid, 1:500 seyreltme). BSA, bloke edici ajan olarak işlev görür.
  6. Bölümleri PBS ile her seferinde 5 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın.
    NOT: 3.7, 3.8 ve 3.9 adımlarını karanlık bir yerde gerçekleştirin.
  7. İkincil antikor çözeltisinde (Keçi anti-Fare IgG (H + L) Alexa Unu 594, PBS 1:200 ile seyreltilmiş) bölümleri ıslak, karanlık bir kutuda oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  8. İkincil antikoru, her seferinde 5 dakika olmak üzere 3 kez en az 20 mL PBS ile bölümlerden yıkayın.
    NOT: Bölümlerin soyulmasını önlemek için yıkama sırasında PBS'yi bölümlerin üzerine dökmeyin. Bölümleri ıslak tutun.
  9. Bölümlerin etrafındaki sıvıyı emdirin ve her bölüme bir damla montaj ortamı ekleyin. Kabarcıkları önleyerek bölümleri kapak camı ile kapatın.
  10. Lekeli bölümleri floresan mikroskobu ile gözlemleyin. Türetmeyi önlemek için görüntüleme parametrelerini tutarlı tutun. Slaytları 4°C'de karanlık bir yerde saklayın. Lekelenme zamanla solacağı için bölümleri bir hafta içinde analiz edin.

4. ImageJ ile Aβ birikiminin görüntülenmesi ve miktarının belirlenmesi

  1. Dijital kamera ve görüntüleme yazılımına bağlı bir floresan mikroskobu ile görüntü yakalayın. Image Pro Plus yazılımını kullandık ve görüntüleme parametresi şu şekilde ayarlandı: Exp Pvw: 450 ms, Exp Acq: 450 ms; Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Pvw Çözünürlüğü: Genişlik 1 × Yükseklik 1, Acq Çözünürlük: Genişlik 1 × Yükseklik 1; Yakalama Derinliği: 8 bit mono; Kazanç: Pvw: 13, Acq: 13, Gama: Pvw: 1, Acq: 1, Hücum: Pvw: -700, Acq: -700.
  2. ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji) sürümünde Eklentiler | Dikiş | MosaicJ menüde. Ardından Dosyalar | Dikilecek görüntüleri açmak için Görüntü Sırası'nı açın (Şekil 1A).
  3. Seçilen tüm resimler altta görüntülenecektir. Görüntüleri manuel olarak birleştirdikten sonra Dosya | Mozaik oluşturun (Şekil 1B, C, D).
  4. Resim Seç | Ayarla | Parlaklık/Kontrast ... öğesine gidin ve görüntünün parlaklığını ve kontrastını ayarlayın (Şekil 3A). Daha sonra görüntü kaydedilebilir (Şekil 1E).
  5. Aβ birikimini ölçmek için, görüntüyü Dosya | Açık... menüde (Şekil 2A).
  6. Resim Seç | Türü | Görüntüyü 8 bit olarak ayarlamak için 8 bit. Ardından Çokgen seçimi kullanılarak sayılması amaçlanan alanı seçin (Şekil 2B).
  7. Resim Seç | Ayarla | Uygun sinyal eşiğini seçmek için Eşik. Eşik, kaydırma çubuklarını sürükleyerek veya sayıları doğrudan metin kutusunda değiştirerek ayarlanabilir (maksimum: 255, minimum: 0). Bölümdeki tüm Aβ sinyalleri kırmızıya döndüğünde, eşik ölçüm için uygundur (Şekil 2C). Koyu Arka Plan kutusunun işaretli olduğundan emin olun.
  8. Analiz Etme | Ölçümü Ayarla... Sonuçlarda gösterilecek parametreleri seçmek için menüde. Integrated density (Entegre yoğunluk) ve Limit to Threshold (Eşik Sınırı) seçeneklerinin belirlendiğini onaylayın. Entegre yoğunluk (toplam yoğunluk) ölçümün hedefidir (Şekil 2D).
  9. Analiz Et | Sonuçları almak için ölçün. Sonuçlar görüntülenecek ve istatistiksel analiz için hazır olacaktır (Şekil 2E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Farklı yaşlardaki 5×FAD farelerde Aβ birikiminin birikimini araştırmak için yukarıda açıklanan immünofloresan boyama prosedürlerini kullandık. Şekil 3 , protokolümüzü kullanarak tipik sonuçları ve optimal olmayan sonuçları temsil etmektedir. 5 aylık ve 8 aylık heterozigot 5×FAD transgenik farelerin ve 4 ila 6 aylık vahşi tip kontrolün beyin dilimleri 6E10 antikoru ile boyandı ve floresan mikroskobu altında tespit edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

6E10 antikoru kullanılarak yapılan immünofloresan boyama, beyindeki Aβ birikimini spesifik olarak tespit edebilir, bu da Resim J ile ölçülmesi kolaydır. Dikkat edilmesi gereken şey, bu protokoldeki bazı önemli adımların sonuçları etkileyebileceğidir.

Şekil 3C'de gösterilen dilimlerin soyulmasını veya kırılmasını önlemek için birkaç önemli noktaya dikkat edilmelidir. Diyaframda kesi yapıldıktan sonra h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı'ndan Çin Doğa Bilimleri Vakfı'nın (hibe numarası: 81974157), Jiangsu Eğitim Departmanı'ndan Jiangsu Özel Atanmış Profesörlüğü (CL'ye), Jiangsu Eyaleti Yenilikçi ve Girişimci Ekip Programı'nın (H.Z., A.L., W.W., C.L. ve YS'ye), mükemmel yetenek (D2019025) başlangıç bursu ve İnovasyon ve Girişimcilik Eğitim Programı (201910313038Z'den Z.S.'ye) tarafından desteklenmiştir. Y.X., M.Z. ve J.D.) Xuzhou Tıp Üniversitesi'nden. Bu araştırma aynı zamanda Deneysel Temel Tıp Bilimi Eğitimi Ulusal Gösteri Merkezi (Xuzhou Tıp Üniversitesi) tarafından da desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetia
Injection syringeKLMEDICAL1 mL
Pentobarbitual sodiumSigma-AldrichP37611% in saline for i.p. injection
Thoracotomy:
IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm)RWDS12010-11
Sharp curved surgical scissors(11.5 cm)RWDS14016-11
Straight dissecting forceps (~10.5 cm)RWDF12010-10
Perfusion
Centrifugal tube (5 mL)Biosharp
Injection syringeKLMEDICAL20 mL
ParaformaldehydeVicmedVIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) powderVicmedVC2001PAdd deionized water to make solution
Fixation, Dehydration and Cryosectioning
Adhesion microscope slidesCITOTEST18810576.2 mm × 25.4 mm
Microtome CryostatLEICACM1950
Optimal cutting temperature compound (OCT)Sakura Finetek4583
SucroseVETECV900116
Immunofluorescence staining
Fluorescence microscopeOLYMPUSIX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11005200X
Image-Pro Plus 7.0CMedia CyberneticsScientific graphing and data analysis software
Immunohistochemical Wet Box (black)SinylabCustomized300 mm × 100 mm × 38 mm, groove depth 27 mm, can contain 10 standard slides
PipetThermo Scientific
Pipette tipsWell-offer
Plastic staining boxSinylabCustomized30 mL, can contain 5 standard slides
Primary Antibody Dilution Buffermade in our lab1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% sodium azide 10mg in 100ml PBS
Purified anti beta amyloid,1-16 antibody (6E10)BiolegendSIG-39320500X
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen SectionsKeyGEN BioTECHKGIHC0055X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1GraphpadMedical mapping software
Image J Fiji 2.0.0National Institute of HealthScientific graphing and data analysis software

Referanslar

  1. Burns, A., Iliffe, S. Alzheimer's disease. BMJ. 338, 158(2009).
  2. Leong, Y. Q., Ng, K. Y., Chye, S. M., Ling, A. P. K., Koh, R. Y. Mechanisms of action of amyloid-beta and its precursor protein in neuronal cell death. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 11-30 (2020).
  3. Tiwari, S., Atluri, V., Kaushik, A., Yndart, A., Nair, M. Alzheimer's disease: pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. International Journal of Nanomedicine. 14, 5541-5554 (2019).
  4. Murphy, M. P., LeVine, H. Alzheimer's disease and the amyloid-beta peptide. Journal of Alzheimer's Disease. 19 (1), 311-323 (2010).
  5. Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256 (5054), 184-185 (1992).
  6. Reitz, C. Alzheimer's disease and the amyloid cascade hypothesis: a critical review. International Journal of Alzheimer's Disease. 2012, 369808(2012).
  7. Bozyczko-Coyne, D., et al. CEP-1347/KT-7515, an inhibitor of SAPK/JNK pathway activation, promotes survival and blocks multiple events associated with Abeta-induced cortical neuron apoptosis. Journal of Neurochemistry. 77 (3), 849-863 (2001).
  8. Canevari, L., Abramov, A. Y., Duchen, M. R. Toxicity of amyloid beta peptide: tales of calcium, mitochondria, and oxidative stress. Neurochemical Research. 29 (3), 637-650 (2004).
  9. Zhu, X., et al. Oxidative stress signalling in Alzheimer's disease. Brain Research. 1000 (1-2), 32-39 (2004).
  10. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  12. An, S., et al. Medial septum glutamatergic neurons control wakefulness through a septo-hypothalamic circuit. Current Biology. , (2021).
  13. Cao, J. L., et al. Activation of peripheral ephrinBs/EphBs signaling induces hyperalgesia through a MAPKs-mediated mechanism in mice. Pain. 139 (3), 617-631 (2008).
  14. Ly, P. T., Cai, F., Song, W. Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model. Journal of Visualized Experiments. (53), e2831(2011).
  15. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
  16. Hatami, A., Albay, R., Monjazeb, S., Milton, S., Glabe, C. Monoclonal antibodies against Abeta42 fibrils distinguish multiple aggregation state polymorphisms in vitro and in Alzheimer disease brain. Journal of Biological Chemistry. 289 (46), 32131-32143 (2014).
  17. Shi, X. Z., Wei, X., Sha, L. Z., Xu, Q. Comparison of beta-Amyloid Plaque Labeling Methods: Antibody Staining, Gallyas Silver Staining, and Thioflavin-S Staining. Chinese Medical Sciences Journal. 33 (3), 167-173 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Alzheimer HastalAmiloid betaA Birikimimm nofloresan BoyamaN rodejeneratif Hastal kFare Modeli5xFADAPP B l nmesiBeta sekretazPatofizyolojiA PlaklarTranskardiyal Perf zyonKriyoseksiyonKantifikasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır