Обнаружение накопления амилоидного β с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания на мышиной модели болезни Альцгеймера

Резюме

В невропатологии болезни Альцгеймера одной из наиболее важных характеристик является отложение амилоид-β. В данном протоколе мы описываем метод иммунофлуоресцентного окрашивания у трансгенных мышей с 5×FAD для выявления накопления амилоидного β в бляшках. Процесс перфузии, криосекции, окрашивания и количественной оценки будет подробно описан.

Аннотация

Болезнь Альцгеймера (БА) — это нейродегенеративное заболевание, которое способствует развитию 60-70% деменции во всем мире. Одним из признаков болезни Альцгеймера, несомненно, является накопление амилоид-β (Aβ) в мозге. Aβ образуется в результате протеолитического расщепления белка-предшественника бета-амилоида (APP) β-секретазой и γ-секретазой. В патологических условиях повышенное β-расщепление АПП приводит к гиперпродукции Aβ, которая агрегируется в Aβ-бляшки. Поскольку бляшки Aβ являются характерной чертой патологии БА, обнаружение количества Aβ очень важно в исследованиях БА. В этом протоколе мы представляем метод иммунофлуоресцентного окрашивания для визуализации осаждения Aβ. Мышиная модель, используемая в наших экспериментах, — 5×FAD, которая несет пять мутаций, обнаруженных в семейной болезни Альцгеймера человека. Невропатологический и поведенческий дефицит мышей 5xFAD хорошо задокументирован, что делает его хорошей моделью для изучения патологии Aβ на животных. Мы внедрим процедуру, включающую транскардиальную перфузию, криосекцию, иммунофлуоресцентное окрашивание и количественную оценку для выявления накопления Aβ у мышей 5×FAD. С помощью этого протокола исследователи могут исследовать патологию Aβ на мышиной модели с болезнью Альцгеймера.

Введение

Болезнь Альцгеймера (БА) – это нейродегенеративное заболевание, которое вызывает 60-70% деменции во всем мире и требует больших социальных ресурсов¹. Хорошо известно, что накопление амилоид-β (Aβ) является патологическим признаком болезни Альцгеймера. Белок-предшественник амилоида (APP) — это интегральный мембранный белок, который существует во многих тканях. Аβ-пептид, состоящий из 36-42^{аминокислот2,} продуцируется последующим расщеплением β- и γ-секретазы в APP ^3,4. Изменения в расщеплении APP и мутации в гене APP приводят к гиперпродукции Aβ. Молекулы Aβ могут агрегировать с образованием олигомеров или фибрилл, которые считаются нейротоксичными ^5,6. В предыдущих исследованиях было продемонстрировано, что накопление Aβ коррелирует с гибелью нейронов при^{БА 7,8,9}.

Трансгенные мыши 5×FAD (C57BL/6J) содержат 3 мутации в APP и 2 мутации в PSEN1. Накопление внутриклеточного Aβ начинается уже в возрасте 1,5 месяца. Внеклеточное накопление Aβ было обнаружено примерно через 2 месяца в коре головного мозга и гиппокампе. Накопление быстро увеличивалось с¹⁰ годами. Хорошо задокументированная патология Aβ делает его хорошей моделью на животных для нашего протокола.

Целью описанного метода окрашивания является визуализация и количественная оценка отложения Aβ в мозге модели мышей с болезнью Альцгеймера. Будет введена процедура, включающая транскардиальную параформальдегидную перфузию, криосекцию, иммунофлуоресцентное окрашивание и количественное определение для выявления накопления Aβ у мышей 5×FAD. Этот протокол является надежным и простым методом исследования патологии Aβ на мышиной модели БА.

протокол

Все экспериментальные процедуры были проведены с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию Медицинского университета Сюйчжоу и в соответствии с руководящими принципами китайского правительства по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Перфузия мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробную информацию о процедуре перфузии можно найти в видео из лаборатории Вильяма Шейна ¹¹.

1. Обезболить трансгенных мышей 5×FAD (C57BL/6J) 1% пентобарбитала натрия (50 мг/кг массы тела) путем внутрибрюшинного введения^12,13. Потеря реакции на щипывание задних лап свидетельствует о правильной анестезии. Не приступайте к перфузии до тех пор, пока мышь не будет должным образом обезболиваена.
2. С помощью четырех штифтов закрепите конечности на пенопластовой доске. Поместите брюшную полость мыши, находящейся под наркозом, вверх, при этом ее конечности должны быть адекватно вытянуты. С помощью ножниц для радужной оболочки глаза сделайте разрез на мечевидном отростке. Тогда диафрагма будет оголена.
3. Хирургическими ножницами сделайте разрез на диафрагме, и осторожно продолжайте разрез диафрагмы до верхней границы грудной клетки. Разрежьте ребра и грудные мышцы, рассеките прикрепленные ткани, чтобы обнажить сердце.
4. Найдите подходящий атриум мыши. Разрежьте правое предсердие с помощью ножниц для ирисов.
5. Введите 20 мл PBS 37 °C (0,01 М, pH 7,2-7,4) из левого желудочка сердца для промывания крови. Затем медленно введите 20 мл 4% PFA комнатной температуры из левого желудочка для фиксации тканей. Скорость инъекции PBS и 4% PFA составляет около 5 мл/мин. Фиксирующий тремор должен наблюдаться в течение нескольких секунд.
   ВНИМАНИЕ: 4% PFA может раздражать глаза и дыхательные пути, а также может спровоцировать аллергические реакции. Этот шаг следует делать в проветриваемых местах, а оператор должен быть одет в защитные очки и маски для лица.
6. С помощью хирургических ножниц отрежьте голову, а затем аккуратно удалите черепную коробку, используйте рассекающие щипцы и извлеките мозг. Затем погрузите мозг в 4 мл 4% PFA в пластиковую пробирку объемом 5 мл на 12-24 часа при 4 °C.

2. Встраивание и криосекция

1. После фиксации в 4% PFA перенесите мозг в 4 мл 15% сахарозы в пластиковой пробирке объемом 5 мл при температуре 4 °C. Через 12-24 ч мозг должен опуститься на дно.
2. Перенесите мозг в 4 мл 30% сахарозы в пластиковую пробирку объемом 5 мл при температуре 4 °C в течение 12-24 часов. Затем мозг готов к встраиванию. Целью ступенчатого замачивания 15% и 30% сахарозы является обезвоживание мозга, что позволяет избежать образования кристаллов льда внутри клеток во время встраивания и криосекции. Обезвоженный мозг может храниться при температуре 4°C в течение одной недели.
3. Оставьте примерно 1 мл сахарозы вместе с мозгом в трубке. Затем добавьте в трубку такой же объем состава оптимальной температуры резки (OCT) и хорошенько перемешайте. Это помогает ОКТ-соединению более адекватно оборачивать мозг.
4. Нанесите толстый слой ОКТ-соединения на поверхность ручки и заморозьте при -21 °C перед криосекцией. Разрежьте мозг сагиттально от середины; Используйте обе половины для разрезания в криостате.
5. После того как ОКТ-соединение застынет, установите ручку на головку образца и вдавите ее в поверхность платформы. Положите одну половину мозга на обрезанную поверхность средней стороной вниз.
6. Наденьте кольцо из фольги вокруг мозга, чтобы избежать утечки соединения ОКТ, а затем заполните кольцо соединением ОКТ до тех пор, пока мозг не будет погружен в воду. Когда закладка OCT компаунда затвердевает, она готова к резке.
7. Установите толщину сечения равной 20 мкм. Установите температуру камеры на -21 °C, а температуру головки образца на -19 °C. Разрез мозга от рострального конца до каудального конца.
8. Нанесите немного PBS на предметные стекла. Предварительно покройте стекла полилизином, чтобы предотвратить отслаивание секций. Прикрепите секцию к предметному стеклу. Если секция сложена, используйте мягкую щетку, чтобы развернуть секции с помощью PBS.
9. Просушите срезы в течение ночи при комнатной температуре и храните при температуре -20 °C. Срезы можно хранить при температуре -20 °C в течение одного месяца до окрашивания Aβ.

3. Процедура окрашивания Aβ

1. Прогрейте срезы при комнатной температуре, высушите поверхность предметного стекла и с помощью гидрофобной ручки нарисуйте круг вокруг среза для инкубации антител.
2. Замочите предметное стекло в PBS в пластиковой коробке для окрашивания объемом 30 мл, чтобы смыть ОКТ-соединение. Используйте не менее 20 мл PBS.
3. Добавьте на предметное стекло 100 мкл 1x раствора для извлечения антигена для замороженных срезов. Выдерживать 5 минут при комнатной температуре.
4. Промыть раствор для извлечения не менее чем 20 мл PBS комнатной температуры 3 раза (по 5 минут на каждый).
5. Разбавленное первичное антитело (6E10) добавить на срезы и инкубировать при 4 °C в течение 16-24 ч во влажном темном боксе (раствор для разведения первичного антитела: 1% BSA, 0,3% Triton X-100, 0,01% азид натрия в PBS, разведение 1:500). BSA функционирует как блокирующий агент.
6. Промойте секции PBS 3 раза, каждый раз по 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги 3.7, 3.8 и 3.9 в темном месте.
7. Инкубируйте срезы во вторичном растворе антител (Goat anti-Mouse IgG (H+L) Alexa Flour 594, разбавленном PBS 1:200) в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной темной коробке.
8. Смойте вторичное антитело со срезов не менее чем 20 мл PBS в течение 3 раз, каждый раз по 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не наливайте PBS на секции во время стирки, чтобы предотвратить отклеивание секций. Следите за тем, чтобы секции были влажными.
9. Впитайте жидкость вокруг секций и добавьте каплю монтажного материала на каждую секцию. Загерметизируйте секции покровным стеклом, не допуская образования пузырей.
10. Рассмотрите окрашенные срезы с помощью флуоресцентного микроскопа. Поддерживайте неизменность параметров изображения, чтобы избежать деривации. Храните предметные стекла при температуре 4°C в темном месте. Анализируйте срезы в течение одной недели, так как окрашивание со временем потускнеет.

4. Визуализация и количественная оценка накопления Aβ с помощью ImageJ

1. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа, подключенного к цифровой камере и программному обеспечению для обработки изображений. Мы использовали программное обеспечение Image Pro Plus, и параметр визуализации был установлен следующим образом: Exp Pvw: 450 мс, Exp Acq: 450 мс; Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Разрешение Pvw: ширина 1 × высота 1, разрешение acq: ширина 1 × высота 1; Глубина захвата: 8-битное моно; Усиление: Pvw: 13, Acq: 13, Gamma: Pvw: 1, ACQ: 1, Offse: Pvw: -700, ACQ: -700.
2. В ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji) выберите Плагины | Сшивание | MosaicJ в меню. Затем выберите Файлы | Откройте Image Sequence , чтобы открыть изображения, которые нужно сшить (Рисунок 1A).
3. Все выбранные изображения будут отображаться внизу. После сшивания изображений вручную выберите Файл | Создайте мозаику (рисунок 1B, C, D).
4. Выбрать изображение | Настройка | Яркость/Контрастность ..., и отрегулируйте яркость и контрастность изображения (рис. 3A). После этого изображение можно сохранить (рис. 1E).
5. Чтобы количественно оценить накопление Aβ, откройте изображение через Файл | Открытый... в меню (рисунок 2A).
6. Выбрать изображение | Тип | 8-бит для настройки изображения до 8-бит. Затем выберите область, которую необходимо подсчитать, с помощью выделения полигона (Рисунок 2B).
7. Выбрать изображение | Настройка | Threshold для выбора правильного порога сигналов. Порог можно настроить с помощью перетаскивания полос прокрутки или изменить числа непосредственно в текстовом поле (максимум: 255, минимум: 0). Когда все сигналы Aβ в разделе стали красными, порог подходит для измерения (Рисунок 2C). Убедитесь, что установлен флажок «Темный фон».
8. Выбор команды «Анализ» | Установите мерку... В меню выбрать параметры, которые будут отображаться в результатах. Убедитесь, что выбраны параметры Интегрированная плотность и предел порогового значения . Целью измерения является интегральная плотность (общая интенсивность) (рисунок 2D).
9. Выберите «Анализ» | Измерьте , чтобы получить результаты. Результаты будут отображены и готовы к статистическому анализу (Рисунок 2E).

Результаты

С помощью описанных выше процедур иммунофлуоресцентного окрашивания мы исследовали отложение накопления Aβ у мышей разного возраста с 5×FAD. На рисунке 3 представлены типичные и неоптимальные результаты с использованием нашего протокола. Срезы мозга 5?...

Обсуждение

Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антител 6E10 может специфически обнаруживать накопление Aβ в мозге, которое легко количественно определить с помощью изображения J. Стоит отметить, что некоторые важные шаги в этом протоколе могут повлиять на результа...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetia
Injection syringe	KLMEDICAL		1 mL
Pentobarbitual sodium	Sigma-Aldrich	P3761	1% in saline for i.p. injection
Thoracotomy:
IRIS-Fine Straight iris scissors (~11.5 cm)	RWD	S12010-11
Sharp curved surgical scissors(11.5 cm)	RWD	S14016-11
Straight dissecting forceps (~10.5 cm)	RWD	F12010-10
Perfusion
Centrifugal tube (5 mL)	Biosharp
Injection syringe	KLMEDICAL		20 mL
Paraformaldehyde	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) powder	Vicmed	VC2001P	Add deionized water to make solution
Fixation, Dehydration and Cryosectioning
Adhesion microscope slides	CITOTEST	188105	76.2 mm × 25.4 mm
Microtome Cryostat	LEICA	CM1950
Optimal cutting temperature compound (OCT)	Sakura Finetek	4583
Sucrose	VETEC	V900116
Immunofluorescence staining
Fluorescence microscope	OLYMPUS	IX-81
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	Media Cybernetics		Scientific graphing and data analysis software
Immunohistochemical Wet Box (black)	Sinylab	Customized	300 mm × 100 mm × 38 mm, groove depth 27 mm, can contain 10 standard slides
Pipet	Thermo Scientific
Pipette tips	Well-offer
Plastic staining box	Sinylab	Customized	30 mL, can contain 5 standard slides
Primary Antibody Dilution Buffer	made in our lab		1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% sodium azide 10mg in 100ml PBS
Purified anti beta amyloid,1-16 antibody (6E10)	Biolegend	SIG-39320	500X
Quick Antigen Retrieval Solution for Frozen Sections	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		Medical mapping software
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		Scientific graphing and data analysis software